Name: determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00
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著者らは、J.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche sur le Cancer(ARC)が博士課程のフェローシップをJ.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche(ANR)に財政支援(助成金ANR-18-CE12-0018-01)として認める。サイトメトリーと顕微鏡検査は、モンペリエMRIバイオキャンパスイメージング施設で実施されました。

1. S. セレビシエ 細胞培養
注:使用した酵母株は表1に記載されています
注意: Sフェーズの持続時間は、さまざまな方法で監視できます。対処すべき問題に応じて、細胞は、G1 停止後に非同期または同期的に増殖させることができる。
<ol><li>非同期に増殖 するS.セレビシエ 細胞から 注:この方法では、?...

<ol>
	<li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li><li>Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+replication+of+individual+replicons+in+eukaryotic+replication+factories.">Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories.</a> Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).</li><li>Marston, A. 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酵母は細胞周期研究の主要なモデル生物ですが、そのS期の特徴付けは、DNA複製のトレーサーとして使用されるBrdUなどの外因性ヌクレオシドを組み込むことができないために長い間妨げられてきました。酵母に単純ヘルペスチミジンキナーゼ(TK)の高発現を装備し、ヒトヌクレオシドトランスポーター(hENT)を添加することで、この問題は大部分が解決されました15,16<su...

有糸分裂によるゲノム安定性は、2つの産生された細胞子孫への完全かつ等しい染色体のセットの伝達によって保証される。これは、細胞周期の各段階において所与の時間に起こる一連の事象の正確な完了に依存する。G 1では、複製元は、Cdc61を含むいくつかのライセンス要素の採用時にライセンスされます。S期では、全ゲノム複製は複数のアクティブな複製起点から開始され、複製ファクトリー2と呼ばれる顕微鏡的に見える焦点に集まる複製機械によって実行されます。M期では、複製された姉妹染色分体が有糸分裂紡錘体上に付着し、双配向して、有糸分裂細胞3の反対側の極に分離することを可能にする。各フェーズの調節、適切な完了、および期間は、ゲノムの安定性を確保するための鍵です。実際、これらの段階のいずれかからの時期尚早の終了は、ゲノムの不安定性につながります。例えば、出芽酵母CDK阻害剤Sic1の欠失またはG1サイクリンの過剰発現によって誘導されるより短いG1は、その後のS期4,5,6を変化させるであろう。その結果、複製ストレスに関連するかどうかにかかわらず、これらの規制緩和は、染色体の切断、再配列、および誤分離をもたらします4,5,6。したがって、S期の持続時間、より広義には細胞周期の他の段階の持続時間を監視することは、異なる変異体および異なるストレスの多い条件で発生する欠陥を特定するために重要であり得る。
細胞周期の持続時間を測定する従来の方法には、単純なDNA含有フローサイトメトリー(図1A)が含まれ、1Cおよび2Cピークから集団をG1、S、およびG2 + Mフェーズフラクションに分離するために使用されるフィッティングアルゴリズム(ほとんどのサイトメトリーソフトウェアで利用可能)に依存します。次に、分数に母集団倍増時間7を掛けます。ただし、この方法は推定値のみを提供し、特定のフラクション内で均一な細胞サイズ分布を必要とし、同期培養には適用できません。哺乳類細胞におけるS期持続時間を研究するために、EdUを含むいくつかのチミジン類似体が開発され、広く使用されている。細胞外培地からの取り込みとチミジンキナーゼ(以下TK)によるリン酸化により、DNAポリメラーゼがDNA合成(複製、組換え、修復)の部位に取り込むことができます。 サッカロミセス・セレビシエ 細胞におけるTK遺伝子の不在を回避するために、酵母株は、単純ヘルペスウイルスTK8 およびヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター(hENT1)9の安定かつ構成的発現を可能にするように操作されている。DNAに取り込まれると、EdUは選択的クリック反応 を介して 検出され、そのアルキン部分をアジド修飾蛍光色素10に化学的に結合します。
この論文は、顕微鏡とフローサイトメトリーによって単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能で、DNA複製期間とダイナミクス、および細胞周期の他のフェーズの持続時間を正確に視覚化および測定するために、EdUで非同期および同期TK-hENT1操作細胞をパルス標識するための2つの最適化された包括的なプロトコルを提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-factor&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>RP01002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100--812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-JV6320</td>
			<td>Alternative to Alexa647-Azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy-530 azide</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>&#160;530-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>P013A10D16</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>OLS</td>
			<td>CASY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NovoSampler Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Infors</td>
			<td>444-4230</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SW22</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>Vibra cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>THUNDER Imager</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae

真核生物のDNA複製は、染色体分離の前に細胞の遺伝的青写真が正しく複製されることを保証する高度に制御されたプロセスです。DNA合成の欠陥は染色体再配列の根底にあるため、DNA複製のモニタリングは、ゲノム不安定性の基礎を理解するために不可欠になっています。 Saccharomyces cerevisiae は、細胞周期調節を研究するための古典的なモデルですが、S期の細胞の割合やS期の持続時間などの重要なDNA複製パラメータを決定することは依然として困難です。このプロトコルは、チミジン類似体である5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の短い非毒性パルスを改変されたTK-hENT1酵母細胞で使用し、続いてクリック反応で検出することで、顕微鏡およびフローサイトメトリーによる単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能でDNA複製の視覚化と定量を可能にします。この方法は、酵母変異体のS期および細胞周期進行におけるこれまで見過ごされてきた欠陥を特定し、それによってゲノム安定性を確保するために不可欠な新しいプレーヤーの特性評価を可能にする可能性があります。

S期持続時間および、より広義には、G1 およびG2 +Mの持続時間を決定するために(プロトコルステップ1.1)、 S. cerevisiae W303野生型細胞(WT、 表1)をSC培地中で7時間非同期に増殖させた。1時間毎に、細胞濃度をモニターし、倍加時間を決定した(図2B)。これらの増殖条件において、計算された倍加時間は、25°Cで120分±13分であった(表2</st...

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Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

我々は、in vivoに組み込まれ、顕微鏡およびフローサイトメトリーによってクリックケミストリーを使用して検出されるチミジン類似体であるEdUを使用して、S.cerevisiaeのS期持続時間を正確に決定するための2つの補完的なプロトコルについて説明します。これにより、DNA複製の持続時間や変異体の見落とされた複製欠陥を簡単に特徴付けることができます。

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

このプロトコルにより、同期した出芽酵母細胞におけるS期持続時間を正確に決定することができます。これは、迅速、簡単、再現可能な方法です。さらに、従来のプロトコルでは検出されない軽度の合成欠陥を検出するのに十分な感度があります。この方法は、出芽酵母の細胞周期調節に取り組んでいる多くの研究者にとって有用であろう。このプロトコルを実演するのは、上級研究員のニコラス・タラレクと、研究室の博士課程の学生であるフアン・デ・ディオス・バルバ・テナです。サッカロミセス・セレビシエ細胞を10ミリリットルのSC培地に低細胞濃度で接種し、摂氏30度で一晩培養し、毎分130回転の軌道攪拌を行います。翌日、細胞を20ミリリットルの新鮮なSC培地で、1ミリリットルあたり10〜6細胞の2〜3倍の最終濃度で希釈する。水で希釈した1ミリリットルあたり1ミリグラムの40マイクロリットルでアルファ因子。次に、細胞を摂氏30度で培養し、毎分130回転で1時間軌道攪拌します。この手順を一度繰り返します。光学顕微鏡で細胞を可視化し、G1停止を監視します。セルの90%以上がshmooを表示し、他のセルが丸みを帯びた未突起のセルである場合は続行します。サンプルを1, 500 Gで3分間遠心分離し、上清を真空ピペットで捨て、細胞を20ミリリットルのSC培地に再懸濁します。この手順を一度繰り返します。5分ごとに2回1ミリリットルの細胞を採取し、EDUラベリングに進みます。リリースの30分後に400マイクロリットルのアルファファクターを追加します。1ミリリットルの細胞培養物を、1マイクロリットルの10ミリモルEDUを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、転倒によりよく混合する。Pi EDUバイバリアントファクト上のEDU陽性細胞とEDU陰性細胞を区別するには、さらに1ミリリットルの細胞培養物を、1マイクロリットルのDMSOを含む2ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。振とう水浴中で攪拌しながら摂氏30度で3〜5分間インキュベートする。100マイクロリットルの100%エタノールを加えて反応を停止します。細胞を微量遠心機で10, 000 Gで2分間ペレット化します。真空ピペットを使用して上清を除去します。細胞ペレットを500マイクロリットルの70%エタノールに再懸濁し、ボルテックスによりよく混合する。サンプルを室温で、可変速ロッカーで毎分20回の傾斜で少なくとも1時間放置し、細胞を透過させます。細胞をマイクロ遠心分離機で10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで捨てます。500マイクロリットルの10%エタノールとPBSで細胞を2回洗浄します。細胞をマイクロフュージで10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで捨てます。RNase AとプロテイナーゼKを含む200マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁し、摂氏50度で1〜2時間、または摂氏37度で一晩インキュベートします。細胞をマイクロ遠心分離機で10, 000 Gで2分間ペレット化し、上清を真空ピペットで廃棄します。細胞を500マイクロリットルのPBSで洗浄します。次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。細胞ペレットを1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。室温で30分間インキュベートします。次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄し、1%BSAを含む300マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。細胞を2本の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分配します。最初のチューブはクリック反応用の200マイクロリットルの細胞培養物で構成され、2番目のチューブにはsytox緑色染色用の100マイクロリットルの細胞培養物が含まれている必要があります。次に、細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。sytox緑色染色の場合は、細胞ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。次いで、細胞濃度に応じて、300マイクロリットルのsytox緑色混合物を含むフローサイトメーターチューブに10〜30マイクロリットルを移す。40〜50%の振幅で2秒間サンプルを2回超音波処理フローサイトメーターでサンプルを処理するまで暗所に置いておきます。クリック反応では、新たに調製したアジド色素バッファー40マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁します。暗所で室温で60分間インキュベートします。細胞をペレット化し、前に示したように上清を廃棄します。次に、PBS中の300マイクロリットルの10%エタノールで細胞を3回洗浄します。次に、細胞を1ミリリットル当たり50マイクログラムのヨウ化プロピジウム100マイクロリットルにPBSに再懸濁し、暗所に10分間放置する。細胞濃度に応じて、10〜30マイクロリットルの細胞懸濁液を、300マイクロリットルの50ミリモルトリスHCl、pH 7.5を含むフローサイトメーターチューブに移します。40〜50の振幅で2秒間2回超音波処理します。サンプルをサイトメーターで処理するまで、暗所に置いておきます。488ナノメートルの励起青色レーザーと530 x 30バンドパスフィルターを使用して、sytoxグリーンサンプルを読み取ります。Pi X軸に488ナノメートルの励起青色レーザーと615 x 20バンドパスフィルターを使用し、Y軸に640ナノメートルの赤色励起レーザー、660 x 20バンドパスフィルターを使用して、ドットプロット上のバイエルンPi EDUサンプルを読み取ります。3つの細胞集団がバイ変量EDU Piサイトメーター分析で観察された。摂氏25度では、細胞集団の約27%がG1期、29%がS期、約44%がG2プラスM期でした。同期細胞では、S期の持続時間は、sytoxグリーンフローサイトメータープロファイル上でDNA含有量が1つのCから2つのCに変化した時間に基づいて約25分であり得る。EDUパルスラベリングは、Sフェーズ期間を正確に決定しました。放出の15分後、EDU陽性細胞の一部が検出され、S期の開始が示されました。S期を通る進行は、バイエルン円周率EDUグラフの細胞雲が上向きおよび右向きに移動することによって見られました。最後に、放出から35分で、細胞の一部はEDU陰性でしたが、2倍の量のDNAがあり、S期が終了し、細胞がG2プラスM期であったことを示しています。高い同期性が観察されたにもかかわらず、一部の細胞は放出後60分でS期を終了し、S期は放出後約65分で全集団で完了しました。完全な同期を行い、細胞が第2S期に入るのを防ぐことが重要です。細胞は、核DNA複製の先見性を監視および定量できる顕微鏡で画像化できます。この手法は、軽度のS期欠損を有する見落とし変異体、および細胞周期持続時間欠損を有する変異体を特定するのに役立つ。

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

の解剖サッカロマイセスセレビシエ ASCI

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

生物学

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

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脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPRは、補因子の酸化還元滴定を監視対象<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

増殖に基​​づく決定とタンパク質分解に対する遺伝的要件の生化学的確認で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...