Name: determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00
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저자는 재정 지원을 위해 JDDBT와 Agence Nationale pour la Recherche (ANR) 및 Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC)를 J.d.DBT에 대한 박사 학위 펠로우십과 ANR(Agence Nationale pour la Recherche)로 인정하고자 합니다(보조금 ANR-18-CE12-0018-01). 세포 분석 및 현미경 검사는 Montpellier MRI BioCampus 이미징 시설에서 수행되었습니다.

1. S. 세레비시아에 세포 배양
참고: 사용된 효모 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.
알림: S상 지속 시간은 다양한 방법으로 모니터링할 수 있습니다. 다루어야 할 질문에 따라, 세포는G1 정지 후에 비동기적으로 또는 동기적으로 성장될 수 있다.
<ol><li>비동기적으로 성장하는 S. 세레비시아에 세포에서 참?...

<ol>
	<li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li><li>Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+replication+of+individual+replicons+in+eukaryotic+replication+factories.">Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories.</a> Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).</li><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+in+budding+yeast:+Sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms.">Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li><li>Lengronne, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CDK+inhibitor+Sic1+prevents+genomic+instability+by+promoting+replication+origin+licensing+in+late+G1.">The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).</li><li>Tanaka, S., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+G+1-cyclin+expression+induces+genomic+instability+by+preventing+efficient+pre-RC+formation.">Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation.</a> Genes &amp; Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).</li><li>Teixeira, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+E+deregulation+promotes+loss+of+specific+genomic+regions.">Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions.</a> Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).</li><li>Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+populations+growing+at+different+rates.">Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).</li><li>McNeil, J. B., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+herpes+simplex+virus+thymidine+kinase+gene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).</li><li>Vernis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+efficient+thymidine+salvage+pathway+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+instability+of+yeast+cdc6-1/cdc6-1+mutants+involves+chromosome+structure+and+recombination.">The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination.</a> Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).</li><li>Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+control+of+Mcm5+interaction+with+chromatin+in+cdc6-1+mutated+in+CDC-NTP+motif.">Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif.</a> DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).</li><li>Saner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+association+of+neighboring+replicons+creates+replication+factories+in+budding+yeast.">Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast.</a> Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).</li><li>Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORC-dependent+and+origin-specific+initiation+of+DNA+replication+at+defined+foci+in+isolated+yeast+nuclei.">ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei.</a> Genes &amp; Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).</li><li>Lengronne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+BrdU+incorporation+in+TK++yeast+strains.">Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains.</a> Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li><li>Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+spindle+checkpoints+cooperate+during+S+phase+to+delay+mitosis+and+preserve+genome+integrity.">DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).</li><li>Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+for+FACS+and+microscopy+analysis+of+DNA+replication+in+budding+yeast.">EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).</li><li>Ivanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+complete+DNA+synthesis+after+chromosome+segregation+begins.">Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins.</a> Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).</li></ol>

효모는 세포주기 연구의 주요 모델 유기체이지만 DNA 복제의 추적자로 사용되는 BrdU와 같은 외인성 뉴 클레오 사이드를 통합 할 수 없기 때문에 S 단계의 특성화는 오랫동안 방해 받아 왔습니다. 효모에 단순 포진 티미 딘 키나아제 (TK)의 높은 발현을 장착하고 인간 뉴 클레오 시드 수송 체 (hENT)를 첨가하면이 문제가 크게 해결되었습니다15,16. EdU는 항 BrdU...

유사분열 분열을 통한 게놈 안정성은 완전하고 동일한 염색체 세트를 생산된 두 세포 자손으로 전달함으로써 보장됩니다. 이것은 세포주기의 각 단계에서 주어진 시간에 발생하는 일련의 사건의 정확한 완료에 의존합니다. G 1에서 복제 원본은 Cdc61을 포함한 여러 라이센스 요소를 모집할 때 라이센스가 부여됩니다. S 단계에서 전체 게놈 복제는 여러 활성 복제 기점에서 시작되고 복제 공장2이라는 현미경으로 보이는 초점에 모이는 복제 기계에 의해 수행됩니다. M 단계에서, 복제 된 자매 염색분체는 유사 분열 방추에 부착되고 이중 배향되어 유사 분열 세포3의 반대 극으로 분리 될 수 있습니다. 각 단계의 조절, 적절한 완료 및 기간은 게놈 안정성을 보장하는 데 중요합니다. 실제로, 이러한 단계에서 조기 종료는 게놈 불안정성을 초래합니다. 예를 들어, 출아 효모 CDK 억제제 Sic1의 결실 또는 G1 사이클린의 과발현에 의해 유도된 더 짧은G1은 후속 S상 4,5,6을 변화시킬 것이다. 결과적으로, 복제 스트레스와 관련이 있든 없든 이러한 규제 완화는 염색체 파괴, 재 배열 및 잘못된 분리 4,5,6을 초래합니다. 따라서 S 단계의 지속 기간 및보다 광범위하게는 세포주기의 다른 단계의 지속 시간을 모니터링하는 것은 다른 돌연변이 체 및 다른 스트레스 조건에서 발생하는 결함을 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.
세포 주기 단계 기간을 측정하는 전통적인 방법에는 간단한 DNA 함량 유세포분석(그림 1A)이 포함되며 집단을 1C 및 2C 피크에서 G1, S 및 G2 + M 상 분획으로 분리하는 데 사용되는 피팅 알고리즘(대부분의 세포분석 소프트웨어에서 사용 가능)에 의존합니다. 그런 다음 분수에 인구 배가 시간7을 곱합니다. 그러나 이 방법은 추정된 값만 제공하고 주어진 분획 내에서 균질한 세포 크기 분포가 필요하며 동기화된 배양에는 적용할 수 없습니다. 포유류 세포에서 S- 기 지속 시간을 연구하기 위해 EdU를 포함한 여러 티미 딘 유사체가 개발되어 널리 사용되었습니다. 세포 외 배지로부터의 흡수와 티미 딘 키나아제 (이하 TK라고 함)에 의한 인산화는 DNA 중합 효소가 DNA 합성 (복제, 재조합, 복구) 부위에 이들을 통합 할 수있게한다. 사카로마이세스 세레비지애 세포에서 TK 유전자의 부재를 우회하기 위해 효모 균주는 단순 포진 바이러스 TK8 및 인간 평형 뉴클레오시드 수송체(hENT1)9의 안정적이고 구성적인 발현을 허용하도록 설계되었습니다. 일단 DNA에 통합되면, EdU는 선택적 클릭 반응을 통해 검출되며, 이는 알킨 부분을 아지드-개질된 플루오로크롬10에 화학적으로 결합시킨다.
이 백서는 현미경 및 유세포 분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제 기간 및 역학뿐만 아니라 세포 주기의 다른 단계의 지속 시간을 정확하게 시각화하고 측정하기 위해 EdU를 사용하여 비동기 및 동기식 TK-hENT1 엔지니어링 세포에 대한 두 가지 최적화된 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-factor&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>RP01002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100--812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-JV6320</td>
			<td>Alternative to Alexa647-Azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy-530 azide</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>&#160;530-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>P013A10D16</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>OLS</td>
			<td>CASY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NovoSampler Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Infors</td>
			<td>444-4230</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SW22</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>Vibra cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>THUNDER Imager</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae

진핵생물 DNA 복제는 염색체 분리 전에 세포의 유전적 청사진이 올바르게 복제되도록 하는 고도로 조절된 과정입니다. DNA 합성 결함이 염색체 재배열의 기초가 됨에 따라 DNA 복제 모니터링은 게놈 불안정성의 기초를 이해하는 데 필수적이 되었습니다. 사카로마이세스 세레비지애 는 세포 주기 조절을 연구하는 고전적인 모델이지만 S기의 세포 분율 또는 S기 기간과 같은 주요 DNA 복제 매개변수는 여전히 결정하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 조작된 TK-hENT1 효모 세포에서 티미딘 유사체인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 짧고 독성이 없는 펄스를 사용한 다음 클릭 반응으로 검출하여 현미경 및 유세포분석을 통해 단일 세포 및 집단 수준 모두에서 높은 공간 및 시간 분해능으로 DNA 복제를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 효모 돌연변이체의 S 단계 및 세포주기 진행에서 이전에 간과 된 결함을 식별 할 수 있으므로 게놈 안정성을 보장하는 데 필수적인 새로운 플레이어의 특성화를 허용합니다.

S기 지속기간 및, 보다 광범위하게는G1 및G2+M의 지속기간을 결정하기 위해(프로토콜 단계 1.1), S. 세레비지애 W303 야생형 세포(WT, 표 1)를 SC 배지에서 7시간 동안 비동기적으로 성장시켰다. 매 시간마다, 세포 농도를 모니터링하여 배가 시간을 결정하였다(도 2B). 이들 성장 조건에서, 계산된 배가 시간은 25°C에서 120분 ± 13분이었다(표 2<...

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Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

우리는 생체 내에 통합되고 현미경 및 유세포 분석에 의한 Click 화학을 사용하여 검출되는 티미딘 유사체인 EdU를 사용하여 S. cerevisiae에서 S상 지속 시간을 정확하게 결정하기 위한 두 가지 보완 프로토콜을 설명합니다. 이를 통해 DNA 복제 기간을 쉽게 특성화하고 돌연변이의 복제 결함을 간과할 수 있습니다.

사카로마이세스 세레비시아에 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 혼입을 사용한 S상 지속 시간 측정

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

이 프로토콜을 사용하면 동기화된 신진 효모 세포에서 S상 지속 시간을 정밀하게 측정할 수 있습니다. 빠르고 쉽고 재현 가능한 방법입니다. 또한 기존 프로토콜에서 감지되지 않는 경미한 합성 결함을 감지할 수 있을 만큼 민감합니다.이 방법은 신진 효모에서 세포주기 조절을 연구하는 많은 연구자들에게 유용 할 것입니다. 이 프로토콜을 시연하는 것은 선임 연구원 인 Nicolas Talarek과 실험실의 박사 과정 학생 인 Juan De Dios Barba Tena입니다. 사카로마이세스 세레비지애 세포를 낮은 세포 농도의 SC 배지 10밀리리터에 접종하여 분당 130회전의 안와 교반과 함께 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다.다음날, 세포를 20 밀리리터의 신선한 SC 배지에서 10 밀리리터당 10 내지 6개의 세포에 2 내지 3배의 최종 농도로 희석한다. 물에 희석 된 밀리리터 알파 인자 당 1 밀리그램의 40 마이크로 리터에서. 그런 다음 세포를 섭씨 30도에서 배양하고 1 시간 동안 분당 130 회전의 궤도 교반을 수행합니다.이 단계를 한 번 반복합니다. G1 정지를 모니터링하기 위해 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 셀의 90 % 이상이 shmoo를 표시하고 나머지는 둥근 고정되지 않은 셀이면 진행합니다.샘플을 1, 500 G에서 3 분 동안 원심 분리한 다음 진공 피펫으로 상청액을 버리고 세포를 20 밀리리터의 SC 배지에 재현탁시킨다. 이 단계를 한 번 반복합니다. 5 분마다 두 번 1 밀리리터의 세포를 수집하고 EDU 라벨링을 진행합니다.방출 30 분 후에 400 마이크로 리터의 알파 인자를 첨가하십시오. 1 밀리리터의 세포 배양 물을 10 밀리몰 EDU의 1 마이크로 리터를 포함하는 2 밀리리터 마이크로 원속 튜브로 옮기고 반전으로 잘 혼합합니다. Pi EDU 이변량 팩트에서 EDU 양성 세포와 EDU 양성 세포를 구별하려면 1 밀리리터의 세포 배양을 1 마이크로 리터의 DMSO가 들어있는 2 밀리리터 마이크로 원속 튜브로 옮깁니다.흔들리는 수조에서 교반 하에서 섭씨 30도에서 3-5 분 동안 배양하십시오. 100 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 세포를 미세 원심 분리기에서 10, 000 G에서 2 분 동안 펠릿화한다.진공 피펫을 사용하여 상청액을 제거한다. 세포 펠릿을 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올에 재현 탁시키고 vortexing하여 잘 혼합합니다. 샘플을 가변 속도 로커에서 분당 20 틸트로 최소 1 시간 동안 실온에 두어 세포를 투과시킵니다.세포를 미세원심분리기에서 10, 000 G에서 2분 동안 펠릿화하고 상층액을 진공 피펫으로 버린다. 세포를 500 마이크로리터의 10% 에탄올과 PBS로 두 번 세척한다. 세포를 마이크로원속에 10, 000 G에서 2분간 펠릿화하고, 상층액을 진공 피펫으로 버린다.RNase A 및 Proteinase K를 함유 한 200 마이크로 리터의 PBS에 펠릿을 재현 탁하십시오.가끔 흔들면서 섭씨 50도에서 1-2 시간 동안 또는 섭씨 37도에서 밤새 배양하십시오. 세포를 마이크로 원심분리기에서 10, 000 G에서 2분 동안 펠릿화하고 상층액을 진공 피펫으로 버린다. 세포를 500 마이크로리터의 PBS로 세척한다.그런 다음 세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버립니다. 세포 펠릿을 200 마이크로 리터의 PBS에 1 % BSA로 재현 탁시킵니다. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.그런 다음 세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버리고 1%BSA를 포함하는 300마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다. 세포를 두 개의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 분배하십시오. 첫 번째 튜브는 클릭 반응을 위한 200마이크로리터의 세포 배양으로 구성되어야 하고 두 번째 튜브는 사이톡스 녹색 염색을 위한 100마이크로리터의 세포 배양을 포함해야 합니다.이어서, 세포를 펠릿화하고 앞에서 입증된 바와 같이 상청액을 버린다. 사이톡스 그린 염색을 위해, 세포 펠릿을 100 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다. 이어서 세포 농도에 따라, 10 내지 30 마이크로리터를 300 마이크로리터의 사이톡스 녹색 혼합물을 함유하는 유세포분석기 튜브로 옮긴다.40-50%의 진폭에서 2초 동안 샘플을 두 번 초음파 처리하여 유세포분석기에서 샘플을 처리할 때까지 어둠 속에 두십시오. 클릭 반응의 경우, 새로 준비된 40 마이크로리터의 아지드 염료 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 어두운 곳에서 실온에서 60 분 동안 배양하십시오.세포를 펠릿화하고 앞에서 설명한 대로 상청액을 버립니다. 그런 다음 PBS에서 300 마이크로 리터의 10 % 에탄올로 세포를 3 회 세척하십시오. 다음으로 세포를 PBS에 밀리리터당 50 마이크로그램의 100 마이크로리터에 재현탁시키고 어둠 속에서 10분 동안 방치한다.세포 농도에 따라, 10 내지 30 마이크로리터의 세포 현탁액을 300 마이크로리터의 50 밀리몰 트리스 HCl, pH 7.5를 함유하는 유세포분석기 튜브로 옮긴다. 40에서 50의 진폭에서 2 초 동안 두 번 초음파 처리합니다. 세포 분석기에서 처리 할 때까지 샘플을 어둠 속에 두십시오.488 나노미터의 여기 청색 레이저와 530 x 30 대역 통과 필터를 사용하여 sytox 녹색 샘플을 판독합니다. 488나노미터의 여기 청색 레이저와 Pi X축의 경우 615 x 20 대역 통과 필터, 640나노미터의 적색 여기 레이저, Y축의 경우 660 x 20 대역 통과 필터를 사용하여 점도표에서 Bavaria Pi EDU 샘플을 읽습니다. 3개의 세포 집단이 이변량 EDU Pi 세포분석기 분석에서 관찰되었다.섭씨 25도에서 세포 집단의 약 27%가 G1 단계, 29%가 S 단계, 약 44%가 G2 플러스 M 단계에 있었습니다. 동기화된 세포에서, S 페이즈의 지속시간은 사이톡스 녹색 유세포분석기 프로파일 상에서 DNA 함량이 1C에서 2C로 변화된 시간에 기초하여 약 25분일 수 있다. EDU 펄스 라벨링은 S 위상 지속 시간을 정확하게 결정했습니다.방출 15 분 후, EDU 양성 세포의 분획이 검출되었고, 이는 S 단계의 시작을 나타냅니다. S 단계를 통한 진행은 바이에른 Pi EDU 그래프에서 위쪽과 오른쪽으로 이동하는 세포 구름에 의해 관찰되었습니다. 마지막으로, 방출 후 35 분에 세포의 분획은 EDU 음성이었지만 DNA 양의 두 배는 S 단계가 종료되고 세포가 G2 플러스 M 단계에 있음을 나타냅니다.관찰된 높은 동시성에도 불구하고, 일부 세포는 방출 후 60분 후에 S 페이즈를 완료하였고, S 페이즈는 방출 후 약 65분 후에 전체 집단에 대해 완료되었다. 완벽한 동기화를 유지하고 세포가 두 번째 S 단계로 들어가는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 세포는 핵 DNA 복제 예측을 모니터링하고 정량화할 수 있는 현미경으로 이미지화할 수 있습니다.이 기술은 경미한 S 상 결함과 세포주기 기간 결함을 갖는 간과 된 돌연변이를 식별하는 데 도움이됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...