Name: determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00
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Os autores desejam agradecer à Agence Nationale de la Recherche (ANR) e à Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) pelas bolsas de doutoramento ao J.d.D.B.T. e à Agence Nationale pour la Recherche (ANR) pelo apoio financeiro (subvenção ANR-18-CE12-0018-01). A citometria e a microscopia foram realizadas no centro de imagem BioCampus da RM de Montpellier.

1. Cultura de células de S. cerevisiae
NOTA: As estirpes de levedura utilizadas estão listadas no quadro 1
NOTA: A duração da fase S pode ser monitorada de diferentes maneiras. Dependendo da questão a ser abordada, as células podem ser cultivadas de forma assíncrona ou síncrona após a parada do G1 .
<ol><li>De células de S. cerevisiae de crescimento assíncrono NOTA: Este método permite a...

<ol>
	<li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li><li>Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+replication+of+individual+replicons+in+eukaryotic+replication+factories.">Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories.</a> Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).</li><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+in+budding+yeast:+Sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms.">Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li><li>Lengronne, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CDK+inhibitor+Sic1+prevents+genomic+instability+by+promoting+replication+origin+licensing+in+late+G1.">The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).</li><li>Tanaka, S., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+G+1-cyclin+expression+induces+genomic+instability+by+preventing+efficient+pre-RC+formation.">Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation.</a> Genes &amp; Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).</li><li>Teixeira, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+E+deregulation+promotes+loss+of+specific+genomic+regions.">Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions.</a> Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).</li><li>Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORC-dependent+and+origin-specific+initiation+of+DNA+replication+at+defined+foci+in+isolated+yeast+nuclei.">ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei.</a> Genes &amp; Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).</li><li>Lengronne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+BrdU+incorporation+in+TK++yeast+strains.">Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains.</a> Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li><li>Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+spindle+checkpoints+cooperate+during+S+phase+to+delay+mitosis+and+preserve+genome+integrity.">DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).</li><li>Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+for+FACS+and+microscopy+analysis+of+DNA+replication+in+budding+yeast.">EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).</li><li>Ivanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+complete+DNA+synthesis+after+chromosome+segregation+begins.">Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins.</a> Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).</li></ol>

A levedura é um organismo modelo primordial para estudos do ciclo celular, mas a caracterização de sua fase S tem sido dificultada por sua incapacidade de incorporar nucleosídeos exógenos, como o BrdU, que são usados como traçadores da replicação do DNA. Equipar leveduras com alta expressão de herpes simplex timidina quinase (TK) e a adição de um transportador de nucleosídeos humanos (hENT) resolveram em grande parte esse problema15,16. O EdU é mais...

A estabilidade do genoma através da divisão mitótica é assegurada pela transmissão de um conjunto completo e igual de cromossomos para as duas progênies celulares produzidas. Isso depende da conclusão precisa de uma série de eventos que ocorrem em um determinado tempo em cada fase do ciclo celular. No G 1, as origens de replicação são licenciadas mediante o recrutamento de vários fatores de licenciamento, incluindo o Cdc61. Na fase S, a duplicação do genoma inteiro é iniciada a partir de múltiplas origens de replicação ativas e executada por máquinas de replicação que se reúnem em focos microscopicamente visíveis chamados fábricas de replicação2. Na fase M, cromátides irmãs duplicadas são anexadas e biorientadas no fuso mitótico para permitir sua segregação para os polos opostos da célula mitótica3. A regulação, a conclusão adequada e a duração de cada fase são fundamentais para garantir a estabilidade do genoma. De fato, a saída prematura de qualquer uma dessas fases leva à instabilidade do genoma. Por exemplo, um G1 mais curto induzido pela deleção do inibidor de CDK de levedura em brotamentoSic1 ou pela superexpressão de ciclinas G1 alterará a fase Ssubsequente 4,5,6. Consequentemente, essas desregulamentações, associadas ou não à tensão de replicação, resultam em quebras cromossômicas, rearranjos e má segregação 4,5,6. Portanto, monitorar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração das outras fases do ciclo celular pode ser crucial para identificar os defeitos que ocorrem em diferentes mutantes e em diferentes condições estressantes.
Um método tradicional para medir a duração da fase do ciclo celular inclui citometria de fluxo de conteúdo de DNA simples (Figura 1A) e depende de um algoritmo de ajuste (disponível na maioria dos softwares de citometria) usado para separar a população em frações de fase G1, S e G2 + M dos picos 1C e 2C. As frações são então multiplicadas pelo tempo de duplicação da população7. No entanto, este método fornece apenas valores estimados, requer uma distribuição homogênea do tamanho da célula dentro de uma determinada fração e não é aplicável a culturas sincronizadas. Para estudar a duração da fase S em células de mamíferos, vários análogos da timidina foram desenvolvidos e amplamente utilizados, incluindo o EdU. Sua absorção do meio extracelular e fosforilação pela timidina quinase (doravante referida como TK) os tornam disponíveis para DNA polimerases para incorporá-los em locais de síntese de DNA (replicação, recombinação, reparo). Para contornar a ausência do gene TK nas células de Saccharomyces cerevisiae , cepas de levedura foram modificadas para permitir a expressão estável e constitutiva do vírus herpes simplex TK8 e do transportador de nucleosídeos equilibrados humanos (hENT1)9. Uma vez incorporado ao DNA, o EdU é detectado através da reação seletiva de Click, que acopla quimicamente sua porção alquina a fluorocromos modificados com azida10.
Este artigo fornece dois protocolos abrangentes otimizados para células de engenharia assíncronas e síncronas de TK-hENT1 com EdU, a fim de visualizar e medir com precisão a duração e a dinâmica da replicação do DNA, bem como a duração das outras fases do ciclo celular, com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-factor&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>RP01002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100--812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-JV6320</td>
			<td>Alternative to Alexa647-Azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy-530 azide</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>&#160;530-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>P013A10D16</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>OLS</td>
			<td>CASY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NovoSampler Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Infors</td>
			<td>444-4230</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SW22</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>Vibra cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>THUNDER Imager</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae

A replicação do DNA eucariótico é um processo altamente regulado que garante que o modelo genético de uma célula seja corretamente duplicado antes da segregação cromossômica. Como os defeitos de síntese de DNA estão subjacentes aos rearranjos cromossômicos, o monitoramento da replicação do DNA tornou-se essencial para entender a base da instabilidade do genoma. Saccharomyces cerevisiae é um modelo clássico para estudar a regulação do ciclo celular, mas os principais parâmetros de replicação do DNA, como a fração de células na fase S ou a duração da fase S, ainda são difíceis de determinar. Este protocolo utiliza pulsos curtos e não tóxicos de 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um análogo da timidina, em células de levedura TK-hENT1 modificadas, seguidas de sua detecção por reação Click para permitir a visualização e quantificação da replicação do DNA com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo. Este método pode identificar defeitos anteriormente negligenciados na fase S e na progressão do ciclo celular de mutantes de levedura, permitindo assim a caracterização de novos players essenciais para garantir a estabilidade do genoma.

Para determinar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração de G 1 e G2 + M (etapa do protocolo 1.1), células selvagens do tipo S. cerevisiae W303 (WT, Tabela 1) foram cultivadas de forma assíncrona em meio SC por 7 h. A cada hora, a concentração celular foi monitorada para determinar o tempo de duplicação (Figura 2B). Nessas condições de crescimento, o tempo de duplicação calculado foi de 120 min ± 13 min a 25 °C (<st...

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Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.

Determinação da Duração da Fase S Usando a Incorporação de 5-Etil-2'-desoxiuridina em Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Este protocolo permite uma determinação precisa da duração da fase S em células de levedura de brotamento sincronizadas. É um método rápido, fácil e reprodutível. Além disso, é sensível o suficiente para detectar defeitos leves de síntese não detectados pelos protocolos clássicos.Este método será útil para muitos pesquisadores que trabalham na regulação do ciclo celular em leveduras em brotamento. Demonstrando esse protocolo estarão Nicolas Talarek, pesquisador sênior, e Juan De Dios Barba Tena, estudante de doutorado no laboratório. Inocular células de Saccharomyces cerevisiae em 10 mililitros de meio SC a uma baixa concentração celular para uma cultura noturna a 30 graus Celsius com agitação orbital a 130 rotações por minuto.No dia seguinte, diluir as células em 20 mililitros de meio SC fresco a uma concentração final de duas a três vezes 10 para as seis células por mililitro. A 40 microlitros de um miligrama por mililitro de fator alfa diluído em água. Em seguida, cultura das células a 30 graus Celsius, com agitação orbital a 130 rotações por minuto durante uma hora.Repita esta etapa uma vez. Visualize as células sob um microscópio de luz para monitorar a parada G1. Prossiga se mais de 90% das células exibirem um shmoo e as outras forem células arredondadas sem ponta.Centrifugar as amostras durante três minutos a 1, 500 G.Em seguida, deitar fora o sobrenadante com a pipeta de vácuo e ressuspender as células em 20 mililitros de meio SC. Repita esta etapa uma vez. Colete um mililitro de células duas vezes a cada cinco minutos e prossiga para a rotulagem EDU.Adicione 400 microlitros do fator alfa 30 minutos após a liberação. Transfira um mililitro da cultura celular para um tubo de microfuga de dois mililitros contendo um microlitro de 10 milimolares de EDU, misturado bem por inversão. Para discriminar as células positivas de EDU das células negativas de EDU em um Pi EDU fatos bivariantes, transfira outro mililitro de cultura celular para um tubo de microfuge de dois mililitros contendo um microlitro de DMSO.Incubar por três a cinco minutos a 30 graus Celsius sob agitação em um banho de água agitado. Pare a reação adicionando 100 microlitros de etanol a 100%. Pellet as células por dois minutos a 10.000 G em um microfugo.Remova o sobrenadante usando uma pipeta a vácuo. Ressuspeite a pastilha celular em 500 microlitros de etanol a 70% e misture bem por vórtice. Deixar as amostras à temperatura ambiente durante, pelo menos, uma hora a 20 inclinações por minuto num balancim de velocidade variável para permear as células.Pellet as células durante dois minutos a 10 000 G numa microcentrífuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo. Lave as células duas vezes com 500 microlitros de etanol a 10% e PBS. Pellet as células durante dois minutos a 10 000 G numa microfuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.Ressuspeite o pellet em 200 microlitros de PBS contendo RNase A e Proteinase K.Incubar de uma a duas horas a 50 graus Celsius com agitação ocasional, ou durante a noite a 37 graus Celsius. Pellet as células durante dois minutos a 10 000 G numa microcentrífuga e eliminar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo. Lave as células com 500 microlitros de PBS.Em seguida, elimine as células e descarte o sobrenadante, como demonstrado anteriormente. Ressuspeite o pellet celular em 200 microlitros de PBS com 1%BSA. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, elimine as células, descarte o sobrenadante, como demonstrado anteriormente, e ressuspenda o pellet em 300 microlitros de PBS contendo 1%BSA. Distribua as células em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. O primeiro deve consistir em 200 microlitros de cultura celular para a reação Click e o segundo tubo deve conter 100 microlitros de cultura celular para a coloração verde do sytox.Em seguida, elimine as células e descarte o sobrenadante, conforme demonstrado anteriormente. Para coloração verde sytox, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros de PBS. Em seguida, dependendo da concentração celular, transfira de 10 a 30 microlitros para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 microlitros de mistura verde de sytox.Sonicate as amostras duas vezes por dois segundos a uma amplitude de 40 a 50%Deixe no escuro até processar as amostras em um citômetro de fluxo. Para a reação Click, ressuspenda o pellet celular com 40 microlitros de tampão de corante azida recém-preparado. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 60 minutos.Pellet as células e descartar o sobrenadante como demonstrado anteriormente. Em seguida, lave as células três vezes com 300 microlitros de etanol a 10% em PBS. Em seguida, ressuspeite as células em 100 microlitros de 50 microgramas por mililitro de iodeto de propídio em PBS e deixe por 10 minutos no escuro.Dependendo da concentração celular, transfira 10 a 30 microlitros da suspensão celular para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 microlitros de 50 milimolares Tris HCl, pH 7,5. Sonicate duas vezes por dois segundos a uma amplitude de 40 a 50. Deixe as amostras no escuro até processá-las em um citômetro.Leia as amostras verdes do sytox usando um laser azul de excitação a 488 nanômetros e um filtro de passagem de banda de 530 por 30. Leia as amostras de EDU Pi da Baviera em um gráfico de pontos usando um laser azul de excitação a 488 nanômetros e um filtro passa-passo de banda de 615 por 20 para o eixo X Pi, e um laser de excitação vermelho a 640 nanômetros, um filtro de passagem de 660 por 20 bandas para o eixo Y. Três populações de células foram observadas na análise do citômetro bivariante EDU Pi.A 25 graus Celsius, aproximadamente 27% da população celular estava na fase G1, 29% na fase S e cerca de 44% na fase G2 mais M. Em células sincronizadas, a duração da fase S pode ser de cerca de 25 minutos com base no tempo em que o conteúdo de DNA mudou de um C para dois C no perfil do citômetro de fluxo verde do sytox. A marcação de pulso EDU determinou com precisão a duração da fase S.15 minutos após a liberação, uma fração de células EDU positivas foi detectada, indicando o início da fase S. A progressão através da fase S foi vista pela nuvem celular movendo-se para cima e para a direita no gráfico Bavaria Pi EDU. Finalmente, aos 35 minutos da liberação, uma fração de células foi EDU negativa, mas com o dobro da quantidade de DNA indicando que a fase S terminou e as células estavam na fase G2 mais M.Apesar da alta sincronia observada, algumas células terminaram a fase S 60 minutos após a liberação e a fase S foi completa para toda a população aproximadamente 65 minutos após a liberação. É crucial ter uma sincronização perfeita e evitar que as células entrem na segunda fase S. As células podem ser fotografadas com um microscópio onde a previsão da replicação do DNA nuclear pode ser monitorada e quantificada.Esta técnica ajudará a identificar mutantes que têm defeitos leves da fase S, bem como defeitos de duração do ciclo celular.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

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Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

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