Name: determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2022-10-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Los autores desean agradecer a la Agence Nationale de la Recherche (ANR) y a la Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) por las becas de doctorado a J.d.D.B.T. y a la Agence Nationale pour la Recherche (ANR) por su apoyo financiero (subvención ANR-18-CE12-0018-01). La citometría y la microscopía se realizaron en el centro de imágenes BioCampus de Montpellier MRI.

1. Cultivo celular de S. cerevisiae
NOTA: Las cepas de levadura utilizadas se enumeran en la Tabla 1
NOTA: La duración de la fase S se puede monitorear de diferentes maneras. Dependiendo de la pregunta a abordar, las células se pueden cultivar de forma asíncrona o sincrónica después de la detención de G1 .
<ol><li>De células de S. cerevisiae de crecimiento asincrónico NOTA: Este método perm...

<ol>
	<li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li><li>Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+reveals+replication+of+individual+replicons+in+eukaryotic+replication+factories.">Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories.</a> Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).</li><li>Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+in+budding+yeast:+Sister+chromatid+cohesion+and+related+mechanisms.">Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms.</a> Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).</li><li>Lengronne, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+CDK+inhibitor+Sic1+prevents+genomic+instability+by+promoting+replication+origin+licensing+in+late+G1.">The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1.</a> Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).</li><li>Tanaka, S., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulated+G+1-cyclin+expression+induces+genomic+instability+by+preventing+efficient+pre-RC+formation.">Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation.</a> Genes &amp; Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).</li><li>Teixeira, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+E+deregulation+promotes+loss+of+specific+genomic+regions.">Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions.</a> Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).</li><li>Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+populations+growing+at+different+rates.">Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).</li><li>McNeil, J. B., Friesen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+herpes+simplex+virus+thymidine+kinase+gene+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).</li><li>Vernis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+an+efficient+thymidine+salvage+pathway+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+instability+of+yeast+cdc6-1/cdc6-1+mutants+involves+chromosome+structure+and+recombination.">The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination.</a> Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).</li><li>Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+control+of+Mcm5+interaction+with+chromatin+in+cdc6-1+mutated+in+CDC-NTP+motif.">Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif.</a> DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).</li><li>Saner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+association+of+neighboring+replicons+creates+replication+factories+in+budding+yeast.">Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast.</a> Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).</li><li>Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORC-dependent+and+origin-specific+initiation+of+DNA+replication+at+defined+foci+in+isolated+yeast+nuclei.">ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei.</a> Genes &amp; Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).</li><li>Lengronne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+BrdU+incorporation+in+TK++yeast+strains.">Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains.</a> Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li><li>Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+and+spindle+checkpoints+cooperate+during+S+phase+to+delay+mitosis+and+preserve+genome+integrity.">DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity.</a> The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).</li><li>Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EdU+incorporation+for+FACS+and+microscopy+analysis+of+DNA+replication+in+budding+yeast.">EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).</li><li>Ivanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+complete+DNA+synthesis+after+chromosome+segregation+begins.">Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins.</a> Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).</li></ol>

La levadura es un organismo modelo principal para estudios del ciclo celular, sin embargo, la caracterización de su fase S se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por su incapacidad para incorporar nucleósidos exógenos, como BrdU, que se utilizan como trazadores de la replicación del ADN. El equipamiento de la levadura con una alta expresión de herpes simple timidina quinasa (TK) y la adición de un transportador de nucleósidos humanos (hENT) ha resuelto en gran medida este problema15,16</s...

La estabilidad del genoma a través de la división mitótica está garantizada por la transmisión de un conjunto completo e igual de cromosomas a las dos progenies celulares producidas. Esto se basa en la finalización precisa de una serie de eventos que ocurren en un momento dado en cada fase del ciclo celular. En G 1, los orígenes de replicación se licencian tras la contratación de varios factores de licencia, incluido Cdc61. En la fase S, la duplicación del genoma completo se inicia a partir de múltiples orígenes de replicación activa y se realiza mediante maquinarias de replicación que se reúnen en focos microscópicamente visibles llamados fábricas de replicación2. En la fase M, las cromátidas hermanas duplicadas se unen y se biorientan en el huso mitótico para permitir su segregación a los polos opuestos de la célula mitótica3. La regulación, la finalización adecuada y la duración de cada fase son clave para garantizar la estabilidad del genoma. De hecho, la salida prematura de cualquiera de estas fases conduce a la inestabilidad del genoma. Por ejemplo, un G 1 más corto inducido por la deleción del inhibidor de CDK de levadura en ciernes Sic1 o por la sobreexpresión de ciclinas G1 alterará la fase S posterior 4,5,6. En consecuencia, estas desregulaciones, asociadas o no al estrés de replicación, resultan en roturas cromosómicas, reordenamientos y mala segregación 4,5,6. Por lo tanto, monitorear la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de las otras fases del ciclo celular puede ser crucial para identificar los defectos que ocurren en diferentes mutantes y en diferentes condiciones estresantes.
Un método tradicional para medir la duración de la fase del ciclo celular incluye citometría de flujo de contenido de ADN simple (Figura 1A) y se basa en un algoritmo de ajuste (disponible en la mayoría de los programas de citometría utilizados) utilizado para separar la población en fracciones de fase G1, S y G2 + M de los picos 1C y 2C. Las fracciones se multiplican por la población duplicando el tiempo7. Sin embargo, este método solo da valores estimados, requiere una distribución homogénea del tamaño de celda dentro de una fracción dada y no es aplicable a cultivos sincronizados. Para estudiar la duración de la fase S en células de mamíferos, se han desarrollado y utilizado ampliamente varios análogos de timidina, incluido EdU. Su absorción del medio extracelular y su fosforilación por la timidina quinasa (en lo sucesivo, TK) las ponen a disposición de las ADN polimerasas para incorporarlas en los sitios de síntesis de ADN (replicación, recombinación, reparación). Para evitar la ausencia del gen TK en las células de Saccharomyces cerevisiae , se han diseñado cepas de levadura para permitir la expresión estable y constitutiva del virus del herpes simple TK8 y el transportador de nucleósidos de equilibrio humano (hENT1)9. Una vez incorporado al ADN, EdU se detecta a través de la reacción selectiva de clic, que acopla químicamente su fracción alquina a fluorocromos modificados con azida10.
Este documento proporciona dos protocolos integrales optimizados para las células diseñadas con TK-hENT1 asíncronas y sincrónicas con etiquetas de pulso con EdU para visualizar y medir con precisión la duración y la dinámica de la replicación del ADN, así como la duración de las otras fases del ciclo celular, con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-factor&#160;</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>RP01002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>04-100--812-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>FP-JV6320</td>
			<td>Alternative to Alexa647-Azide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy-530 azide</td>
			<td>Dyomics</td>
			<td>&#160;530-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU (5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine)</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Carlo Erba reagents</td>
			<td>P013A10D16</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L- ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EU0090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>OLS</td>
			<td>CASY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NovoSampler Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Infors</td>
			<td>444-4230</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SW22</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>Vibra cell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-field microscopy</td>
			<td>Leica</td>
			<td>THUNDER Imager</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of s-phase duration using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation in saccharomyces cerevisiae

La replicación del ADN eucariota es un proceso altamente regulado que garantiza que el plano genético de una célula se duplique correctamente antes de la segregación cromosómica. A medida que los defectos de síntesis de ADN subyacen a los reordenamientos cromosómicos, el monitoreo de la replicación del ADN se ha vuelto esencial para comprender la base de la inestabilidad del genoma. Saccharomyces cerevisiae es un modelo clásico para estudiar la regulación del ciclo celular, pero los parámetros clave de replicación del ADN, como la fracción de células en la fase S o la duración de la fase S, aún son difíciles de determinar. Este protocolo utiliza pulsos cortos y no tóxicos de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un análogo de la timidina, en células de levadura TK-hENT1 diseñadas, seguidas de su detección por reacción Click para permitir la visualización y cuantificación de la replicación del ADN con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo. Este método puede identificar defectos previamente pasados por alto en la fase S y la progresión del ciclo celular de los mutantes de levadura, lo que permite la caracterización de nuevos actores esenciales para garantizar la estabilidad del genoma.

Para determinar la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de G 1 y G2 + M (paso del protocolo 1.1), las células de tipo salvaje W303 de S. cerevisiae (WT, Tabla 1) se cultivaron asíncronamente en medio SC durante 7 h. Cada hora, la concentración celular fue monitoreada para determinar el tiempo de duplicación (Figura 2B). En estas condiciones de crecimiento, el tiempo de duplicación calculado fue de 120 min ± 13 min a 25...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Eukaryotic DNA replication is a highly regulated process that ensures that the genetic blueprint of a cell is correctly duplicated prior to chromosome ...

Este protocolo permite una determinación precisa de la duración de la fase S en células de levadura en gemación sincronizadas. Es un método rápido, fácil y reproducible. Además, es lo suficientemente sensible como para detectar defectos de síntesis leves no detectados por los protocolos clásicos.Este método será útil para muchos investigadores que trabajan en la regulación del ciclo celular en levaduras en ciernes. Demostrando este protocolo estarán Nicolás Talarek, investigador principal, y Juan De Dios Barba Tena, estudiante de doctorado en el laboratorio. Inocular células de Saccharomyces cerevisiae en 10 mililitros de medio SC a una concentración celular baja para un cultivo nocturno a 30 grados centígrados con agitación orbital a 130 rotaciones por minuto.Al día siguiente, diluir las células en 20 mililitros de medio SC fresco a una concentración final de dos a tres veces 10 a las seis células por mililitro. A 40 microlitros de un miligramo por mililitro de factor alfa diluido en agua. Luego cultive las células a 30 grados centígrados, con agitación orbital a 130 rotaciones por minuto durante una hora.Repita este paso una vez. Visualice las células bajo un microscopio de luz para monitorear la detención de G1. Proceda si más del 90% de las celdas muestran un shmoo, y las otras son células redondeadas sin tope.Centrifugar las muestras durante tres minutos a 1.500 G.A continuación, desechar el sobrenadante con la pipeta de vacío y resuspender las células en 20 mililitros de medio SC. Repita este paso una vez. Recoja un mililitro de células dos veces cada cinco minutos y proceda al etiquetado de EDU.Agregue 400 microlitros del factor alfa 30 minutos después de la liberación. Transfiera un mililitro del cultivo celular a un tubo de microfuga de dos mililitros que contenga un microlitro de EDU 10 milimolar, mezclado bien por inversión. Para discriminar las células EDU positivas de las células EDU negativas en un Pi EDU bivariante, transfiera otro mililitro de cultivo celular a un tubo de microfuga de dos mililitros que contenga un microlitro de DMSO.Incubar durante tres a cinco minutos a 30 grados centígrados bajo agitación en un baño de agua agitado. Detenga la reacción agregando 100 microlitros de etanol al 100%. Granular las células durante dos minutos a 10, 000 G en una microfuga.Retire el sobrenadante con una pipeta de vacío. Resuspender el pellet celular en 500 microlitros de etanol al 70% y mezclar bien mediante vórtice. Deje las muestras a temperatura ambiente durante al menos una hora a 20 inclinaciones por minuto en un balancín de velocidad variable para permeabilizar las células.Granular las células durante dos minutos a 10.000 g en una microcentrífuga y desechar el sobrenadante con una pipeta de vacío. Lave las células dos veces con 500 microlitros de etanol al 10% y PBS. Granular las células durante dos minutos a 10, 000 G en una microfuga y desechar el sobrenadante con una pipeta de vacío.Resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS que contienen RNasa A y proteinasa K.Incubar de una a dos horas a 50 grados centígrados con agitación ocasional, o durante la noche a 37 grados centígrados. Granular las células durante dos minutos a 10, 000 G en una microcentrífuga y desechar el sobrenadante con una pipeta de vacío. Lave las células con 500 microlitros de PBS.Luego pellet las células y deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente. Resuspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS con 1% BSA. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego pellet las células, deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente y resuspenda el pellet en 300 microlitros de PBS que contienen 1% de BSA. Distribuya las células en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. El primero debe consistir en 200 microlitros de cultivo celular para la reacción Click, y el segundo tubo debe contener 100 microlitros de cultivo celular para la tinción verde sytox.Luego, granular las células y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Para la tinción verde sytox, resuspenda el pellet celular en 100 microlitros de PBS. Luego, dependiendo de la concentración celular, transfiera de 10 a 30 microlitros a un tubo de citómetro de flujo que contenga 300 microlitros de la mezcla verde sytox.Sonicar las muestras dos veces durante dos segundos a una amplitud de 40 a 50%Dejar en la oscuridad hasta procesar las muestras en un citómetro de flujo. Para la reacción Click, resuspenda el pellet celular con 40 microlitros de tampón de colorante Azide recién preparado. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 60 minutos.Granular las células y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente. Luego lave las células tres veces con 300 microlitros de etanol al 10% en PBS. A continuación, resuspender las células en 100 microlitros de 50 microgramos por mililitro de yoduro de propidio en PBS y dejar durante 10 minutos en la oscuridad.Dependiendo de la concentración celular, transfiera de 10 a 30 microlitros de la suspensión celular a un tubo de citómetro de flujo que contenga 300 microlitros de 50 milimolares Tris HCl, pH 7.5. Sonicate dos veces durante dos segundos a una amplitud de 40 a 50. Deje las muestras en la oscuridad hasta que las procese en un citómetro.Lea las muestras de sytox green usando un láser azul de excitación a 488 nanómetros y un filtro de paso de banda de 530 por 30. Lea las muestras de Bavaria Pi EDU en un diagrama de puntos utilizando un láser azul de excitación a 488 nanómetros y un filtro de paso de banda de 615 por 20 para el eje X Pi, y un láser de excitación rojo a 640 nanómetros, un filtro de paso de banda de 660 por 20 para el eje Y. Se observaron tres poblaciones de células en el análisis bivariante del citómetro EDU Pi.A 25 grados centígrados, aproximadamente el 27% de la población celular estaba en la fase G1, el 29% estaba en la fase S y aproximadamente el 44% estaba en la fase G2 más M. En las células sincronizadas, la duración de la fase S puede ser de unos 25 minutos en función del momento en que el contenido de ADN cambió de un C a dos C en el perfil del citómetro de flujo verde sytox. El etiquetado de pulsos EDU determinó con precisión la duración de la fase S.15 minutos después de la liberación, se detectó una fracción de células EDU positivas, lo que indica el inicio de la fase S. La progresión a través de la fase S fue vista por la nube celular moviéndose hacia arriba y hacia la derecha en el gráfico EDU de Bavaria Pi. Finalmente, a los 35 minutos de la liberación, una fracción de células fue EDU negativa, pero con el doble de la cantidad de ADN que indica que la fase S terminó y las células estaban en la fase G2 más M.A pesar de la alta sincronía observada, algunas células terminaron la fase S 60 minutos después de la liberación y la fase S se completó para toda la población aproximadamente 65 minutos después de la liberación. Es crucial tener una sincronización perfecta y evitar que las células entren en la segunda fase S. Las células pueden ser fotografiadas con un microscopio donde la previsión de replicación del ADN nuclear puede ser monitoreada y cuantificada.Esta técnica ayudará a identificar mutantes pasados por alto que tienen defectos leves de la fase S, así como defectos de duración del ciclo celular.

Research

JoVE Journal

Biology

Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

EPR supervisado Redox La titulación de los cofactores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...