Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل Swiss National Fond (منحة المشروع 310030_189262).

كانت جميع التجارب على الحيوانات متوافقة مع اللوائح الفيدرالية السويسرية للحيوانات ووافق عليها المكتب البيطري في زيورخ (رقم 007/2017 ، 156/2019) لضمان رعاية الإنسان. تم الاحتفاظ بذكور الفئران C57BL / 6 الذين تتراوح أعمارهم بين 10-12 أسبوعا في دورة نهارية / ليلية لمدة 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الطعام والم...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

يوفر البروتوكول المنشور طريقة موثوقة ومباشرة لعزل غلة عالية من خلايا الكبد الفأر الطبيعية والدهنية لتحليلات المصب أحادية الخلية أو التحليل المجمع للخلايا بعد فرز FACS. الميزة المميزة لتنقية تدرج الكثافة هي أن محتوى الدهون الخلوية ليس له أي تأثير أساسي على العائد الفعال لخلايا الكبد. وبالت...

يمكن للكبد تجديد نفسه حتى بعد فقدان الأنسجة بشكل كبير. تتضح هذه القدرة التجديدية الفريدة بوضوح من خلال النموذج التجريبي لاستئصال الكبد الجزئي (70٪) ، والذي تم وصفه لأول مرة في الفئران من قبل هيغينز وأندرسون في عام 19311. في هذا النموذج ، تتم إزالة 70٪ من الكبد جراحيا من الحيوانات عن طريق قص فصوص الكبد الكبيرة. ثم تنمو الفصوص المتبقية من خلال تضخم تعويضي لاستعادة كتلة الكبد الأصلية في غضون أسبوع واحد تقريبا بعد الجراحة ، وإن كان ذلك دون استعادة بنية الكبد الأصلية 2,3. تم تطوير عمليات استئصال الكبد الإضافية بكميات متفاوتة من إزالة الأنسجة ، مثل استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ حيث تكون بقايا الكبد صغيرة جدا بحيث لا يمكن استعادتها ، مما يؤدي في النهاية إلى فشل الكبد بعد استئصال الكبد (PHLF) والموت اللاحق في 30٪ -50٪ من الحيوانات4،5،6. تمكن هذه النماذج من دراسة تجديد الكبد الطبيعي والفاشل ، اعتمادا على كمية الأنسجة المقطوعة (الشكل 1).
على الرغم من أن نماذج الفئران من استئصال الكبد قد استخدمت بنجاح لسنوات عديدة ، إلا أن الأساليب التحليلية الأكثر تقدما لم تسمح إلا مؤخرا برؤية أعمق على مستوى الخلية الواحدة. بالنسبة لمعظم هذه الطرق ، ومع ذلك ، فإن وجود خلايا الكبد الفردية هو شرط أساسي أساسي. تعتمد معظم بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية على تقنية نضح كولاجيناز من خطوتين وتنقية تدرج الكثافة اللاحقة لفصل خلايا الكبد القابلة للحياة عن الحطام وغير المتني ، وكذلك الخلايا الميتة7،8،9. تم وصف هذه الطريقة لأول مرة من قبل بيري وفريند في 196910 وتم تكييفها من قبل Seglen وزملائه في 197211,12. ومع ذلك ، نظرا لأن الطرد المركزي المتدرج يعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فغالبا ما تفقد خلايا الكبد المحملة بالدهون أثناء التنقية القياسية. في حين أن هذه الخسارة قد تكون ضئيلة بالنسبة للعديد من الأسئلة البحثية ، إلا أنها جانب حاسم لتجديد الكبد المبكر. خلال أول 2 أيام ، تتراكم خلايا الكبد داخل كبد الفأر المتجدد الدهون ، وبالتالي تنمو في الحجم وتغمس في الكثافة. يعمل هذا التنكس الدهني العابر المرتبط بالتجديد (TRAS) على توفير وقود متجدد وهو مؤقت ، ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية ويتم توزيعه بشكل غير متساو داخل فصيصات الكبد - الوحدات الوظيفية للكبد13,14. بعد استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ ، يحدث TRAS أيضا ولكنه يستمر ، لأن التجدد متوقف ولا تتأكسد الدهون14. لذلك ، فإن التنقية المتدرجة لخلايا الكبد بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ أو 86٪ ستنتج كسور غير تمثيلية ، حيث يتم فقدان معظم خلايا الكبد المحملة بالدهون بسبب كثافتها المنخفضة15.
في بروتوكول العزل المعدل هذا ، يتم عزل خلايا الكبد من الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. عادة ، يتم القنية والتروية من بقايا عزل الخلايا عن طريق الوريد البابي. ومع ذلك ، فإن المقاومة الوعائية البورتية في البقايا الصغيرة المتبقية بعد الاستئصال الكبير عالية16 ، وبالتالي فإن التروية حساسة. نظرا لأن الوريد الأجوف لا يتأثر باستئصال الكبد ، يمكن إجراء التروية بسهولة في الاتجاه الرجعي عن طريق قنية الوريد الأجوف. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى بقايا الكبد ، باستخدام التروية الرجعية مع التدفق عبر الوريد البابي (الشكل التكميلي S1). يتم فصل خلايا الكبد عن طريق الكولاجين ويتم إطلاقها من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والمعالجة الدقيقة لخلايا الكبد القابلة للحياة عن طريق العزل التدريجي باستخدام نهج الطرد المركزي منخفض السرعة ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

تم استخدام استئصال الكبد الجزئي على نطاق واسع للتحقيق في تجديد الكبد في الفئران ، ولكن عزل الغلة العالية لخلايا الكبد القابلة للحياة لتطبيقات الخلية المفردة في المصب يمثل تحديا. لوحظ تراكم ملحوظ للدهون داخل خلايا الكبد المتجددة خلال أول 2 أيام من تجديد الكبد الطبيعي في الفئران. هذا ما يسمى بالتنكس الدهني المرتبط بالتجديد العابر (TRAS) مؤقت ولكنه يتداخل جزئيا مع المرحلة التكاثرية الرئيسية. تنقية تدرج الكثافة هي العمود الفقري لمعظم البروتوكولات الحالية لعزل خلايا الكبد الأولية. نظرا لأن التنقية المتدرجة تعتمد على كثافة الخلايا وحجمها ، فإنها تفصل بين مجموعات خلايا الكبد غير الدهنية والخلايا الكبدية الدهنية. لذلك ، غالبا ما تفقد خلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه أجزاء غير تمثيلية من خلايا الكبد. 
يصف البروتوكول المقدم طريقة سهلة وموثوقة للعزل في الجسم الحي لتجديد خلايا الكبد بغض النظر عن محتواها من الدهون. يتم عزل خلايا الكبد من ذكور الفئران C57BL / 6 بعد 24-48 ساعة من استئصال الكبد من خلال نهج نضح كولاجيناز كلاسيكي من خطوتين. تدفع المضخة التمعجية القياسية المحاليل الدافئة عبر الوريد الأجوف السفلي القسطرة إلى البقايا ، باستخدام تقنية التروية الرجعية مع التدفق الخارجي عبر الوريد البابي. يتم فصل خلايا الكبد عن طريق كولاجيناز لإطلاقه من كبسولة جليسون. بعد الغسيل والطرد المركزي الدقيق ، يمكن استخدام خلايا الكبد لأي تحليلات المصب. في الختام ، تصف هذه الورقة تقنية مباشرة وقابلة للتكرار لعزل مجموعة تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران. قد تساعد هذه الطريقة أيضا في دراسة مرض الكبد الدهني.

يبلغ TRAS ذروته في 16 ساعة بعد استئصال الكبد ويختفي تدريجيا بعد 32-48 ساعة بعد استئصال الكبد القياسي ، لكنه يستمر بعد 48 ساعة بعد استئصال الكبد الممتد. من الناحية المجهرية ، يمكن رؤية TRAS بسهولة كبشرة شاحبة من بقايا الكبد (الشكل 1F) ويمكن ملاحظتها في الفئران التي تم استئصال الكبد في?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

خلايا الكبد المحملة بالدهون متأصلة في تجديد الكبد ولكنها عادة ما تضيع عند الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هنا ، نقدم بروتوكول عزل الخلايا الأمثل الذي يحتفظ بخلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه مجموعات تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.

عزل خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم طريقة محسنة لعزل خلايا الكبد في الفئران بعد استئصال الكبد الجزئي دون الحاجة إلى الطرد المركزي المتدرج الكثافة. عادة ما نرى نسبة كبيرة من خلايا الكبد المحملة بالدهون أثناء التجدد المبكر. عادة ما يتم الاحتفاظ بخلايا الكبد الدهنية التي تفقد عند الطرد المركزي المتدرج للكثافة بسبب الكثافة المنخفضة مع هذا البروتوكول.لتحضير معدات التروية ، قم بتوصيل قنية IUI قياس 26 بنهاية مخرج الأنبوب باستخدام موصل قفل Luer. ثم اغسل الأنبوب وأدخل طرف مدخل الأنبوب في أنبوب التروية العازلة الذي تم تسخينه مسبقا في حمام مائي. قم بتجهيزه بمخزن مؤقت للتروية الدافئة بسرعة مضخة تبلغ ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.قبل الشروع في الجراحة ، تأكد من تخدير الماوس بشكل كاف. ثم قم بتنظيف البطن بمحلول فرك جراحي و 70٪ إيثانول. ثم قم بقص الغرز لإعادة فتح شق خط الوسط الذي تم إجراؤه مسبقا لاستئصال الكبد الجزئي واسحب حواف الجرح برفق.إذا كان استئصال الكبد أقدم من 24 إلى 48 ساعة ، فقم بإزالة الخيط وقطع الجلد بالمقص أو المشرط. استخدم مبعدة أو مشابك بسيطة لإبقاء البطن مفتوحا. يجب كشف تجويف البطن قدر الإمكان لتحسين الوصول والتصور.إصلاح خياطة البولي بروبلين 5-0 إلى القص. اسحبه بشكل جمجمة وقم بإصلاحه في هذا الموقف. حرك الأمعاء إلى اليمين باستخدام مسحات قطنية معقمة للكشف عن الوريد البابي والوريد الأجوف.استخدم قطعة قماش مبللة للاحتفاظ بالأمعاء. ضع جسما ثقيلا يبلغ ارتفاعه حوالي سنتيمترين مثل حلقة وزن معدنية مجاورة لأرجل الفأر الخلفية. ثم ضع الأنبوب مع قنية IUI المتصلة بقياس 26 على الجسم وضع الإبرة بعناية فوق الوريد الأجوف.اضبط طول الأنبوب كما هو مطلوب. انقل محلول مرق كولاجيناز إلى أنبوب الهضم العازل الذي تم تسخينه مسبقا. تحضير 10 إلى 20 ملليلتر من العازلة الهضم لكل.قم بتشغيل المضخة بعد ضبط سرعة المضخة على ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. تخلص من أول ملليلترين إلى ثلاثة ملليلتر من محلول التروية الذي تم تسخينه مسبقا بمجرد وصول المخزن المؤقت إلى الإبرة. لإجراء قنية الوريد الأجوف السفلي ، استخدم مسحة قطنية معقمة لسحب الوريد الأجوف برفق أسفل البزل بحيث يسهل التوتر المقدم إدخال القنية في الوريد.أدخل قنية IUI ذات المقياس 26 بزاوية ضحلة في الوريد الأجوف السفلي أسفل الكلى بينما يمر المخزن المؤقت عبر الإبرة. تأكد من أن الإبرة مائلة تشير إلى الأعلى. ابحث عن الدم في حجرة الفلاش للقسطرة عندما تدخل الإبرة التجويف.دفع الإبرة بمقدار ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات إضافية لضمان دخول طرف القسطرة إلى الوريد. حرك القسطرة البلاستيكية فوق الإبرة وفي الوريد الأجوف خمسة ملليمترات أخرى. قم بإزالة الإبرة ببطء وبعناية فائقة.بعد ثانيتين إلى ثلاث ثوان ، ابحث عن بقع بيضاء تتشكل في الكبد أو تورم الوريد البابي ، مما يشير إلى أن مخزن التروية يتدفق عبر الكبد ويدخل فصيصات الكبد من الوريد المركزي. انتظر حتى ينتفخ الوريد البابي بشكل واضح في غضون ثانية إلى ثانيتين من تشكل بقع بيضاء على سطح الكبد. قطع الوريد البابي مع مقص بعيدا قدر الإمكان من هيلوس الكبد.زيادة معدل التدفق إلى أربعة إلى سبعة ملليلتر في الدقيقة اعتمادا على وزن الحيوان وحجم الكبد ومدى استئصال الكبد الأولي. قم بتثبيت الوريد البابي بملاقط أو مشبك وعائي لمدة سبع إلى 10 ثوان. تأكد من عدم مرور أي سوائل.قم بإجراء مشبك ثان بعد حوالي 30 ثانية وتأكد من تضخم الكبد واسترخاءه. استمر في طرد الحيوان لمدة ثلاث إلى أربع دقائق ولاحظ المخزن المؤقت الواضح المتدفق من الوريد البابي. ثبت الوريد البابي لمدة ثلاث إلى أربع ثوان قبل أن يصل المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد.تأكد من استرخاء الكبد عند إطلاق المشبك وأن سائل التروية يظل صافيا. بمجرد وصول المخزن المؤقت للهضم إلى الكبد ، قم بتثبيت الوريد البابي مرة أخرى. يجب ألا يسترخي الكبد بعد إطلاق التثبيت.هضم لمدة أربع دقائق تقريبا بمعدل تدفق خمسة ملليلتر في الدقيقة. مع تقدم عملية الهضم ، ابحث عن علامات بدء انتفاخ الكبد وأقسام شفافة صغيرة على سطح الكبد. لاحظ أن الكبد يأخذ نسيج قطعة قماش مبللة ويبدو رطبا تقريبا.تحقق من الاتساق عن طريق لمسه بعناية بقطعة قطن رطبة ومعقمة. استمر في التروية حتى يمكن ملاحظة اختلاف ملحوظ في نسيج سطح الكبد. لاحظ أن الكبد يفترض لونا فاتحا جدا ومظهرا شمبانيا يشير إلى انفصال كبسولة جليسون عن الحمة.توقف عن الهضم بمجرد أن يكتسب الكبد هذه الخصائص. قم بإزالة الإبرة قبل دخول الهواء إلى الكبد. أمسك النسيج الضام المركزي بين الفصوص باستخدام الملقط وارفعه قليلا لأعلى باستخدامه كنقطة ربط.قطع جميع وصلات الكبد إلى الأعضاء الأخرى وإزالة المرارة. إزالة الكبد بلطف من تجويف البطن. كن حذرا لأنها ستكون واهية وهشة في هذه المرحلة.ضع الكبد في مخزن حفظ الجليد البارد. انقل الكبد إلى طبق بتري طوله 10 سم وأضف 10 ملليلتر من الثلج البارد Williams'Medium E.Rupture كبسولة Glisson مع ملاقط ذات أطراف دقيقة في مواقع قليلة على طول سطح الكبد. أمسك جزءا مركزيا بزوجين من الملقط.اسحبها ببطء بعيدا ، مما يسمح للكبسولة بالتمزق دون الإضرار بخلايا الكبد وإطلاق الخلايا عن طريق هز الكبسولة برفق. قم بتصفية خمسة ملليلتر من لب الكبد من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. شطف المرشح مع 10 ملليلتر من وسط بارد الجليد الطازج وتصفية الخمسة ملليلتر المتبقية من اللب من خلال مصفاة الخلية.تدور المستخلص عند 50 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. نضح معظم المادة الطافية ، وترك ملليلتر واحد لإعادة تعليق الخلايا عن طريق تحريك الأنبوب برفق. أضف 40 ملليلترا من Williams'E Medium البارد وكرر الخطوة ثلاث مرات.المضي قدما في عزل خلايا الكبد كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد استئصال الكبد بنسبة 70٪ في الفئران ، كان العائد النهائي لخلايا الكبد حوالي 10 إلى 15 × 10 إلى السادس مع 78٪ متوسط الجدوى النهائية. بينما بعد استئصال الكبد الممتد بنسبة 86٪ ، كان إنتاج خلايا الكبد من أربعة إلى تسعة × 10 إلى 6 مع 65٪ متوسط قابلية للحياة.بعد استئصال الكبد الجزئي ، تظهر خلايا الكبد زيادة في حجم الخلية مقارنة بالكبد الطبيعي المقابل لزيادة محتوى الدهون. لوحظت زيادة محتوى الدهون في خلايا الكبد الفئران بعد 24 ساعة من استئصال الكبد الجزئي ، وينظر إليها على أنها زيادة في التحبب أو لوحظت مباشرة من خلال وجود حويصلات دهنية داخل خلايا الكبد المتضخمة. أثناء استخدام طريقة تنقية تدرج الكثافة الكلاسيكية ، فقدت خلايا الكبد الدهنية الكبيرة في المادة الطافية ويتم جمع خلايا الكبد الخالية من الدهون الأصغر فقط في حبيبات الخلية.مع البروتوكول المحسن ، لم تفقد خلايا الكبد المملوءة بالدهون وتم تكوير جميع خلايا الكبد. التثبيت المتكرر يسهل عملية التنظيف. مع ذلك ، يتم تطهير الكبد على النحو الأمثل من مكونات الدم المتبقية التي يمكن أن تمنع إنزيمات الهضم.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

نموذج من تصلب الشرايين الناتج عن تدفق ديستيربد في الشريان السباتي الماوس بواسطة الربط الجزئي وطريقة بسيطة لعزل الحمض النووي الريبي من بطانة الشريان السباتي

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

تقييم التغيرات في المتطايرة العام التخدير حساسية من الفئران بعد التدخل الدوائي المحلي أو الجهازية

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

الحقن الشريان السباتي لوأضافا الدوائية وتحليل Taxanes في الفئران

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

التصور الأوعية الدموية ومتني التجديد بعد استئصال الكبد الجزئي 70٪ في الفئران العادية

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

إينتراسبلينيك زرع خلايا الكبد بعد ظهرت جزئيا في إيماءة. الفئران مشمولان

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

أرتيرياليزيد إعادة "زرع الكبد الجزئي الفئران" مع في فيفو المنحى السفينة 70% ظهرت

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

زرع صفحة الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية للحد من تسرب بعد Colectomy الجزئية في نموذج الفئران

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

انسداد الابهري كاملة وجزئية لعلاج الصدمة النزفية في الخنازير

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...