Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af Swiss National Fond (projekttilskud 310030_189262).

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med schweiziske føderale dyreforordninger og godkendt af Zürichs veterinærkontor (nr. 007/2017, 156/2019), der sikrer menneskelig pleje. C57BL/6-hanmus i alderen 10-12 uger blev holdt på en 12 timers dag/nat-cyklus med fri adgang til mad og vand. Hver forsøgsgruppe bestod af seks til otte dyr. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, udstyr og reagenser, der anvendes i denne protokol.
1. Delvis hepate...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

Den offentliggjorte protokol giver en pålidelig og ligetil metode til at isolere et højt udbytte af normale og steatotiske murinhepatocytter til enkeltcelle downstream-analyser eller bulkanalyse af celler efter FACS-sortering. Den klare fordel i forhold til densitetsgradientrensning er, at det cellulære lipidindhold i det væsentlige ikke har nogen indflydelse på det effektive udbytte af hepatocytter. Således vil fraktionen af steatotiske hepatocytter blive bevaret og inkluderet i downstream-analyser. Dette er ikke ...

Leveren kan regenerere sig selv selv efter større vævstab. Denne unikke regenerative kapacitet illustreres eksplicit af den eksperimentelle model af delvis (70%) hepatektomi, først beskrevet hos rotter af Higgins og Anderson i 19311. I denne model fjernes 70% af leveren kirurgisk fra dyr ved at klippe større leverlober af. De resterende lapper vokser derefter gennem kompenserende hypertrofi for at genoprette den oprindelige levermasse inden for ca. 1 uge efter operationen, omend uden restaurering af den oprindelige leverarkitektur 2,3. Yderligere hepatektomier med varierende mængder vævsfjernelse er blevet udviklet, såsom 86% forlænget hepatektomi, hvor leverresten er for lille til at komme sig, hvilket i sidste ende fører til posthepatektomi leversvigt (PHLF) og efterfølgende død hos 30% -50% af dyrene 4,5,6. Disse modeller muliggør undersøgelse af normal og mislykket leverregenerering, afhængigt af mængden af resekteret væv (figur 1).
Selvom musemodeller af hepatektomier er blevet brugt med succes i mange år, har først for nylig mere avancerede analysemetoder givet mulighed for en dybere indsigt på enkeltcelleniveau. For de fleste af disse metoder er tilstedeværelsen af individuelle hepatocytter imidlertid en grundlæggende forudsætning. De fleste protokoller til isolering af primære hepatocytter er baseret på en to-trins kollaganaseperfusionsteknik og efterfølgende densitetsgradientrensning for at adskille levedygtige hepatocytter fra affald og ikke-parenkymale såvel som døde celler 7,8,9. Denne metode blev først beskrevet af Berry and Friend i 196910 og tilpasset af Seglen og kolleger i 197211,12. Da gradientcentrifugering imidlertid er afhængig af cellernes tæthed og størrelse, går lipidbelastede hepatocytter ofte tabt under standardrensning. Mens et sådant tab kan være ubetydeligt for mange forskningsspørgsmål, er det et afgørende aspekt for tidlig leverregenerering. I løbet af de første 2 dage akkumulerer hepatocytter i den regenererende muselever lipider og derved vokser i størrelse og dypper i densitet. Denne forbigående regenereringsassocierede steatose (TRAS) tjener til at tilvejebringe regenerativt brændstof og er midlertidig, men overlapper delvist den store proliferative fase og er ujævnt fordelt i leverlobulerne - leverens funktionelle enheder13,14. Efter udvidet 86%-hepatektomi forekommer TRAS imidlertid også, men vedvarer, fordi regenerering er gået i stå, og lipider ikke oxideres14. Derfor vil gradientoprensning af hepatocytter efter 70% eller 86% -hepatektomier give ikke-repræsentative fraktioner, da de fleste lipidbelastede hepatocytter går tabt på grund af deres lave densitet15.
I denne modificerede isolationsprotokol isoleres hepatocytter fra C57BL/6-mus 24-48 timer efter hepatektomi ved en klassisk to-trins kollaganaseperfusionsmetode. Normalt udføres kanylering og perfusion af resten til celleisolering via portalvenen. Imidlertid er portovaskulær resistens i små rester, der er tilbage efter større resektion, høj16, og perfusion er således delikat. Fordi vena cava forbliver upåvirket af hepatektomier, kan perfusion let udføres i retrograd retning via kanylering af vena cava. En standard peristaltisk pumpe driver de opvarmede opløsninger via det kateteriserede inferior vena cava ind i leverresten ved hjælp af retrograd perfusion med udstrømning gennem portalvenen (supplerende figur S1). Hepatocytter dissocieres af collagenaser og frigives fra Glissons kapsel. Efter vask og omhyggelig behandling af levedygtige hepatocytter ved trinvis isolering ved hjælp af en lavhastighedscentrifugeringsmetode kan hepatocytterne anvendes til eventuelle downstream-analyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

Delvis hepatektomi har været meget udbredt til at undersøge leverregenerering hos mus, men isoleringen af høje udbytter af levedygtige hepatocytter til nedstrøms enkeltcelleapplikationer er udfordrende. En markant ophobning af lipider inden for regenererende hepatocytter observeres i løbet af de første 2 dage af normal leverregenerering hos mus. Denne såkaldte forbigående regenereringsassocierede steatose (TRAS) er midlertidig, men overlapper delvist den store proliferative fase. Densitetsgradientrensning er rygraden i de fleste eksisterende protokoller til isolering af primære hepatocytter. Da gradientrensning er afhængig af cellernes tæthed og størrelse, adskiller den ikke-steatotiske fra steatotiske hepatocytpopulationer. Derfor går fede hepatocytter ofte tabt, hvilket giver ikke-repræsentative hepatocytfraktioner. 
Den præsenterede protokol beskriver en nem og pålidelig metode til in vivo-isolering af regenererende hepatocytter uanset deres lipidindhold. Hepatocytter fra mandlige C57BL/6-mus isoleres 24-48 timer efter hepatektomi ved en klassisk to-trins kollaganaseperfusionsmetode. En standard peristaltisk pumpe driver de opvarmede opløsninger via det kateteriserede ringere vena cava ind i resten ved hjælp af en retrograd perfusionsteknik med udstrømning gennem portalvenen. Hepatocytter dissocieres af kollagenase for deres frigivelse fra Glissons kapsel. Efter vask og omhyggelig centrifugering kan hepatocytterne anvendes til eventuelle downstream-analyser. Afslutningsvis beskriver dette papir en ligetil og reproducerbar teknik til isolering af en repræsentativ population af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus. Metoden kan også hjælpe undersøgelsen af fedtleversygdom.

TRAS topper ved 16 timer efter hepatektomi og forsvinder gradvist 32-48 timer efter standard hepatektomi, men fortsætter ud over 48 timer efter forlænget hepatektomi. Makroskopisk er TRAS let synlig som en bleg teint af leverresten (figur 1F) og kan observeres hos hepatektomiserede mus mellem 16 timer og 48 timer efter operationen.
Det estimerede endelige udbytte er 10-15 × 10 6 hepatocytter efter 70% -hepatektomi og 4-9 × 106 efter forlænget 86%<s...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Lipidbelastede hepatocytter er iboende for leverregenerering, men går normalt tabt ved densitetsgradientcentrifugering. Her præsenterer vi en optimeret celleisoleringsprotokol, der bevarer steatotiske hepatocytter, hvilket giver repræsentative populationer af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus.

Isolering af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Det overordnede mål med denne protokol er at præsentere en optimeret metode til hepatocytisolering hos mus efter delvis hepatektomi uden behov for densitetsgradientcentrifugering. Vi ser normalt en stor procentdel af lipidbelastede hepatocytter under tidlig regenerering. De steatotiske hepatocytter, der normalt går tabt ved densitetsgradientcentrifugering på grund af den lave densitet, bevares med denne protokol.For at klargøre perfusionsudstyret skal du tilslutte en 26 gauge IUI-kanyle til slangens udløbende ved hjælp af et Luer-låsestik. Skyl derefter slangen og indsæt rørets indløbsende i det forvarmede perfusionsbufferrør i vandbadet. Prim den med varm perfusionsbuffer ved en pumpehastighed på tre ml pr. Minut.Før du fortsætter med operationen, skal du sikre dig, at musen er tilstrækkeligt bedøvet. Rens derefter maven med en kirurgisk skrubbeopløsning og 70% ethanol. Skær derefter suturerne for at genåbne midterlinjesnittet, der tidligere var lavet til den delvise hepatektomi, og træk forsigtigt sårkanterne fra hinanden.Hvis hepatektomien er ældre end 24 til 48 timer, skal du fjerne suturen og skære huden med en saks eller en skalpel. Brug en retraktor eller enkle klip til at holde maven åben. Bughulen skal udsættes så meget som muligt for at optimere adgang og visualisering.Fastgør en 5-0 polypropylensutur til brystbenet. Træk det kranielt og fastgør det i denne position. Flyt tarmene til højre ved hjælp af sterile vatpinde for at afsløre portalvenen og vena cava.Brug en våd klud til at fastholde tarmene. Placer en tung genstand på cirka to centimeter højde, såsom en metalvægtring ved siden af musens bagben. Placer derefter slangen med den tilsluttede 26 gauge IUI-kanyle på objektet, og placer nålen forsigtigt oven på vena cava.Juster slangens længde efter behov. Overfør kollagenasestamopløsningen til det forvarmede nedbrydningsbufferrør. Forbered 10 til 20 ml fordøjelsesbuffer pr. Dyr.Tænd pumpen efter justering af pumpehastigheden til tre ml pr. Minut. Kassér de første to til tre ml af den forvarmede perfusionsbuffer, når bufferen når nålen. For at udføre kanylering af den ringere vena cava skal du bruge en steril vatpind til forsigtigt at trække vena cava caudalt under punkteringen, så den tilvejebragte spænding letter indsættelsen af kanylen i venen.Indsæt 26 gauge IUI-kanylen i en lav vinkel i den ringere vena cava under nyrerne, mens bufferen løber gennem nålen. Sørg for, at kanylefacen peger opad. Se efter blod i kateterets flashkammer, når nålen kommer ind i lumen.Før nålen yderligere to til tre millimeter for at sikre, at kateterets spids kommer ind i venen. Skub plastikkateteret over nålen og ind i vena cava yderligere fem millimeter. Fjern nålen langsomt og meget forsigtigt.Efter to til tre sekunder skal du kigge efter hvide pletter, der dannes i leveren eller hævelse af portalvenen, hvilket indikerer, at perfusionsbufferen strømmer gennem leveren og kommer ind i leverlobulerne fra den centrale vene. Vent på, at portalvenen synligt svulmer op inden for et til to sekunder efter, at der dannes hvide pletter på leveroverfladen. Klip portalvenen med en saks så distalt som muligt fra leverhilusen.Forøg strømningshastigheden til fire til syv ml pr. Minut afhængigt af dyrets vægt, leverstørrelse og omfanget af den indledende hepatektomi. Klem portalvenen med pincet eller en vaskulær klemme i syv til 10 sekunder. Sørg for, at der ikke passerer væske igennem.Udfør en anden klemme efter ca. 30 sekunder, og sørg for, at leveren svulmer op og slapper af. Fortsæt med at skylle dyret i tre til fire minutter og observer den klare buffer, der strømmer ud af portalvenen. Klem portalvenen i tre til fire sekunder, før fordøjelsesbufferen når leveren.Sørg for, at leveren slapper af ved frigivelse af klemmen, og at perfusionsvæsken forbliver klar. Når fordøjelsesbufferen når leveren, skal du klemme portalvenen igen. Leveren bør ikke slappe af efter frigivelsen af fastspændingen.Fordøjes i cirka fire minutter med en strømningshastighed på fem ml pr. Minut. Efterhånden som fordøjelsen skrider frem, skal du kigge efter tegn på, at leveren begynder at svulme op og små gennemsigtige sektioner på leverens overflade. Bemærk, at leveren får tekstur af et vådt stykke klud og fremstår næsten sumpet.Undersøg konsistensen ved forsigtigt at røre ved den med en fugtig, steril vatpind. Fortsæt med perfusionen, indtil der kan observeres en markant forskel i leverens overfladestruktur. Bemærk, at leveren antager en meget lys farve og et boblende udseende, der indikerer Glissons kapsel, der adskiller sig fra parenchymen.Stop fordøjelsen, så snart leveren har erhvervet disse egenskaber. Fjern nålen, før luften kommer ind i leveren. Tag fat i det centrale bindevæv mellem lapperne ved hjælp af tang og løft det let opad ved hjælp af det som et ankerpunkt.Skær alle leverforbindelser til andre organer og fjern galdeblæren. Fjern leveren forsigtigt fra bukhulen. Vær forsigtig, da det vil være spinkelt og skrøbeligt på dette stadium.Placer leveren i den iskolde konserveringsbuffer. Overfør leveren til en 10 centimeter petriskål og tilsæt 10 ml iskold Williams'Medium E.Rupture Glisson's kapsel med pincet med fin spids et par steder langs leveroverfladen. Tag fat i en central del med to par pincet.Træk dem langsomt fra hinanden, så kapslen rives uden at beskadige hepatocytterne, og frigør cellerne ved forsigtigt at ryste kapslen. Filtrer fem ml levermasse gennem en 100 mikrometer cellesil i et 50 ml rør. Skyl filteret med 10 ml frisk iskoldt medium og filtrer de resterende fem ml papirmasse gennem cellesilen.Drej ekstraktet ved 50 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Opsug det meste af supernatanten, og lad en milliliter resuspendere cellerne ved forsigtigt at hvirvle røret. Tilsæt 40 ml kold Williams'E Medium og gentag trinnet tre gange.Fortsæt med isoleringen af hepatocytter som beskrevet i tekstmanuskriptet. Efter 70 % hepatektomi hos mus var det endelige hepatocytudbytte ca. 10 til 15 x 10 til 6. med 78 % gennemsnitlig endelig levedygtighed. Mens hepatocytudbyttet efter udvidet 86% hepatektomi var fire til ni x 10 til 6. med 65% gennemsnitlig levedygtighed.Efter partielle hepatektomier viser hepatocytter en øget cellestørrelse sammenlignet med normale lever svarende til øget lipidindhold. Øget lipidindhold blev observeret i murin hepatocytter 24 timer efter delvis hepatektomi, set som en stigning i granularitet eller direkte observeret ved tilstedeværelsen af lipidvesikler inde i forstørrede hepatocytter. Under anvendelse af den klassiske densitetsgradientrensningsmetode gik store fede hepatocytter tabt i supernatanten, og kun mindre magre hepatocytter opsamles i cellepelleten.Med den forbedrede protokol gik de lipidfyldte hepatocytter ikke tabt, og alle hepatocytter blev pelleteret. Den gentagne fastspænding letter skylningsprocessen. Med det ryddes leveren optimalt fra resterende blodkomponenter, der kan hæmme fordøjelsesenzymerne.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Vurdere ændringer i flygtige narkose Følsomhed af mus efter lokale eller systemiske farmakologisk intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisering af Vascular og parenkymale Regeneration efter 70% Delvis hepatektomi i normale mus

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Intrasplenic Transplantation af hepatocytter efter delvis Hepatectomy i NOD. SCID mus

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re Arterialized rotte delvis lever Transplantation med en i vivo fartøj-orienterede 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation af fedtvæv-afledte stamceller ark til at reducere udsivningen efter delvis kolektomi i en rotte Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

Fuldstændig og delvis aorta okklusion til behandling af blødende chok hos svin

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolering af primære mus hepatocytter for spirende Protein syntese analyse af ikke-radioaktive L-azidohomoalanine mærkning metode

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral vektor-medieret genterapi af hepatocytter Ex Vivo til autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...