Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Swiss National Fond (projectsubsidie 310030_189262).

Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Zwitserse federale diervoorschriften en goedgekeurd door het Veterinair Bureau van Zürich (nr. 007/2017, 156/2019) om de menselijke zorg te garanderen. Mannelijke C57BL/6 muizen in de leeftijd van 10-12 weken werden gehouden op een 12 uur dag/nacht cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. Elke experimentele groep bestond uit zes tot acht dieren. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, apparatuur en reagentia die in di...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

Het gepubliceerde protocol biedt een betrouwbare en eenvoudige methode om een hoge opbrengst van normale en steatotische muizenhepatocyten te isoleren voor eencellige downstream-analyses of bulkanalyse van cellen na FACS-sortering. Het duidelijke voordeel ten opzichte van dichtheidsgradiëntzuivering is dat het cellulaire lipidengehalte in wezen geen invloed heeft op de effectieve opbrengst van hepatocyten. Zo zal de fractie van steatotische hepatocyten worden behouden en opgenomen in downstream-analyses. Dit is niet all...

De lever kan zichzelf regenereren, zelfs na groot weefselverlies. Dit unieke regeneratieve vermogen wordt expliciet geïllustreerd door het experimentele model van partiële (70%) hepatectomie, voor het eerst beschreven bij ratten door Higgins en Anderson in 19311. In dit model wordt 70% van de lever operatief verwijderd van dieren door grotere leverkwabben af te knippen. De resterende lobben groeien vervolgens door compenserende hypertrofie om de oorspronkelijke levermassa binnen ongeveer 1 week na de operatie te herstellen, zij het zonder herstel van de oorspronkelijke leverarchitectuur 2,3. Aanvullende hepatectomie met verschillende hoeveelheden weefselverwijdering zijn ontwikkeld, zoals 86% verlengde hepatectomie waarbij het leverrestant te klein is om te herstellen, wat uiteindelijk leidt tot posthepatectomie leverfalen (PHLF) en daaropvolgende dood bij 30% -50% van de dieren 4,5,6. Deze modellen maken de studie van normale en mislukte leverregeneratie mogelijk, afhankelijk van de hoeveelheid gereseceerd weefsel (figuur 1).
Hoewel muismodellen van hepatectomie al vele jaren met succes worden gebruikt, hebben pas onlangs meer geavanceerde analytische methoden een dieper inzicht op eencellig niveau mogelijk gemaakt. Voor de meeste van deze methoden is de aanwezigheid van individuele hepatocyten echter een basisvoorwaarde. De meeste protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten zijn gebaseerd op een tweestaps collagenaseperfusietechniek en daaropvolgende dichtheidsgradiëntzuivering om levensvatbare hepatocyten te scheiden van puin en niet-parenchymaal, evenals dode cellen 7,8,9. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Berry en Friend in 196910 en aangepast door Seglen en collega's in 197211,12. Omdat gradiëntcentrifugatie echter afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, gaan lipide-beladen hepatocyten vaak verloren tijdens standaardzuivering. Hoewel een dergelijk verlies voor veel onderzoeksvragen verwaarloosbaar kan zijn, is het een cruciaal aspect voor vroege leverregeneratie. Tijdens de eerste 2 dagen accumuleren hepatocyten in de regenererende muizenlever lipiden, waardoor ze in omvang toenemen en in dichtheid dalen. Deze voorbijgaande regeneratie-geassocieerde steatose (TRAS) dient om regeneratieve brandstof te leveren en is tijdelijk, maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase en is ongelijk verdeeld binnen de leverkwabben - de functionele eenheden van de lever13,14. Na verlengde 86%-hepatectomie treedt TRAS echter ook op, maar blijft bestaan, omdat de regeneratie is vastgelopen en lipiden niet worden geoxideerd14. Daarom zal gradiëntzuivering van hepatocyten na 70% - of 86% -hepatectomie niet-representatieve fracties opleveren, omdat de meeste lipide-beladen hepatocyten verloren gaan vanwege hun lage dichtheid15.
In dit aangepaste isolatieprotocol worden hepatocyten van C57BL/6-muizen 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Meestal worden cannulatie en perfusie van het restant voor celisolatie gedaan via de poortader. De portovasculaire weerstand in kleine resten die overblijven na een grote resectie is echter hoog16, en dus is perfusie delicaat. Omdat de vena cava onaangetast blijft door hepatectomie, kan perfusie gemakkelijk in retrograde richting worden uitgevoerd via cannulatie van de vena cava. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het leverrest, met behulp van retrograde perfusie met uitstroom door de poortader (aanvullende figuur S1). Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenasen en vrijgegeven uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig verwerken van levensvatbare hepatocyten door stapsgewijze isolatie met behulp van een centrifugatiebenadering met lage snelheid, kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

Partiële hepatectomie is op grote schaal gebruikt om leverregeneratie bij muizen te onderzoeken, maar de isolatie van hoge opbrengsten van levensvatbare hepatocyten voor downstream eencellige toepassingen is een uitdaging. Een duidelijke accumulatie van lipiden in regenererende hepatocyten wordt waargenomen tijdens de eerste 2 dagen van normale leverregeneratie bij muizen. Deze zogenaamde transient regeneration-associated steatose (TRAS) is tijdelijk maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase. Dichtheidsgradiëntzuivering is de ruggengraat van de meeste bestaande protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten. Omdat gradiëntzuivering afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, scheidt het niet-steatotische van steatotische hepatocytenpopulaties. Daarom gaan vette hepatocyten vaak verloren, wat niet-representatieve hepatocytenfracties oplevert. 
Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor de in vivo isolatie van regenererende hepatocyten, ongeacht hun lipidegehalte. Hepatocyten van mannelijke C57BL/6-muizen worden 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het restant, met behulp van een retrograde perfusietechniek met uitstroom door de poortader. Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenase voor hun afgifte uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig centrifugeren kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses. Concluderend beschrijft dit artikel een eenvoudige en reproduceerbare techniek voor de isolatie van een representatieve populatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen. De methode kan ook helpen bij de studie van leververvetting.

TRAS piekt 16 uur na hepatectomie en verdwijnt geleidelijk 32-48 uur na standaard hepatectomie, maar blijft langer dan 48 uur na langdurige hepatectomie. Macroscopisch is TRAS gemakkelijk zichtbaar als een bleke teint van het leverrestant (figuur 1F) en kan worden waargenomen bij hepatectomie muizen tussen 16 h en 48 h na de operatie.
De geschatte uiteindelijke opbrengst is 10-15 × 10 6 hepatocyten na 70%-hepatectomie en 4-9 × 106 na verlengde 86%<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.

Isolatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Het algemene doel van dit protocol is om een geoptimaliseerde methode te presenteren voor hepatocytenisolatie bij muizen na gedeeltelijke hepatectomie zonder de noodzaak van dichtheidsgradiëntcentrifugatie. We zien meestal een groot percentage lipide-beladen hepatocyten tijdens vroege regeneratie. Die steatotische hepatocyten die meestal verloren gaan bij dichtheidsgradiëntcentrifugatie vanwege de lage dichtheid, worden met dit protocol behouden.Om de perfusieapparatuur voor te bereiden, sluit u een 26 gauge IUI-canule aan op het uitlaatuiteinde van de slang met behulp van een Luer-vergrendelingsconnector. Spoel vervolgens de slang door en steek het inlaatuiteinde van de buis in de voorverwarmde perfusiebufferbuis in het waterbad. Primeer het met warme perfusiebuffer bij een pompsnelheid van drie milliliter per minuut.Voordat u doorgaat met de operatie, moet u ervoor zorgen dat de muis voldoende wordt verdoofd. Reinig vervolgens de buik met een chirurgische scruboplossing en 70% ethanol. Snijd vervolgens de hechtingen om de middellijnincisie te heropenen die eerder is gemaakt voor de gedeeltelijke hepatectomie en trek de wondranden voorzichtig uit elkaar.Als de hepatectomie ouder is dan 24 tot 48 uur, verwijder dan de hechting en knip de huid met een schaar of een scalpel. Gebruik een oprolmechanisme of eenvoudige clips om de buik open te houden. De buikholte moet zoveel mogelijk worden blootgesteld om de toegang en visualisatie te optimaliseren.Bevestig een 5-0 polypropyleen hechting aan het borstbeen. Trek er craniaal aan en bevestig het in deze positie. Beweeg de darmen naar rechts met behulp van steriele wattenstaafjes om de poortader en de vena cava te onthullen.Gebruik een natte doek om de darmen vast te houden. Plaats een zwaar voorwerp van ongeveer twee centimeter hoog, zoals een metalen gewichtsring, naast de achterpoten van de muis. Plaats vervolgens de slang met de aangesloten 26 gauge IUI-canule op het object en plaats de naald voorzichtig bovenop de vena cava.Pas de lengte van de slang naar wens aan. Breng de collagenase-stockoplossing over in de voorverwarmde verteringsbufferbuis. Bereid 10 tot 20 milliliter verteringsbuffer per dier voor.Zet de pomp aan nadat u de pompsnelheid hebt ingesteld op drie milliliter per minuut. Gooi de eerste twee tot drie milliliter van de voorverwarmde perfusiebuffer weg zodra de buffer de naald bereikt. Om cannulatie van de inferieure vena cava uit te voeren, gebruikt u een steriel wattenstaafje om de vena cava voorzichtig caudaal onder de punctie te trekken, zodat de geleverde spanning het inbrengen van de canule in de ader vergemakkelijkt.Steek de 26 gauge IUI-canule onder een ondiepe hoek in de inferieure vena cava onder de nier terwijl de buffer door de naald loopt. Zorg ervoor dat de naald naar boven wijst. Zoek naar bloed in de flitskamer van de katheter wanneer de naald het lumen binnenkomt.Verplaats de naald nog eens twee tot drie millimeter om ervoor te zorgen dat de punt van de katheter in de ader komt. Schuif de plastic katheter over de naald en nog eens vijf millimeter in de vena cava. Verwijder de naald langzaam en heel voorzichtig.Zoek na twee tot drie seconden naar witte vlekken in de lever of zwelling van de poortader, wat aangeeft dat de perfusiebuffer door de lever stroomt en vanuit de centrale ader de leverlobben binnendringt. Wacht tot de poortader zichtbaar opzwelt binnen één tot twee seconden na de vorming van witte vlekken op het leveroppervlak. Knip de poortader met een schaar zo distaal mogelijk van de lever hilus.Verhoog de stroomsnelheid tot vier tot zeven milliliter per minuut, afhankelijk van het gewicht van het dier, de levergrootte en de omvang van de initiële hepatectomie. Klem de poortader vast met een pincet of een vaatklem gedurende zeven tot 10 seconden. Zorg ervoor dat er geen vloeistof doorheen gaat.Voer na ongeveer 30 seconden een tweede klem uit en zorg ervoor dat de lever opzwelt en ontspant. Blijf het dier drie tot vier minuten spoelen en observeer de heldere buffer die uit de poortader stroomt. Klem de poortader drie tot vier seconden vast voordat de spijsverteringsbuffer de lever bereikt.Zorg ervoor dat de lever ontspant bij het loslaten van de klem en dat de perfusievloeistof helder blijft. Zodra de spijsverteringsbuffer de lever bereikt, klemt u de poortader opnieuw vast. De lever mag niet ontspannen na het loslaten van de klem.Verwerk gedurende ongeveer vier minuten met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut. Naarmate de spijsvertering vordert, moet u letten op tekenen dat de lever begint op te zwellen en kleine transparante secties op het oppervlak van de lever. Merk op dat de lever de textuur van een nat stuk doek aanneemt en bijna drassig lijkt.Onderzoek de consistentie door het voorzichtig aan te raken met een vochtig, steriel wattenstaafje. Ga door met de perfusie totdat een duidelijk verschil in de oppervlaktestructuur van de lever kan worden waargenomen. Merk op dat de lever een zeer lichte kleur en een bruisend uiterlijk aanneemt, wat aangeeft dat de Glisson-capsule zich scheidt van het parenchym.Stop de spijsvertering zodra de lever deze eigenschappen heeft verworven. Verwijder de naald voordat de lucht in de lever komt. Pak het centrale bindweefsel tussen de lobben vast met een tang en til het iets omhoog met behulp van het als ankerpunt.Knip alle verbindingen van de lever met andere organen en verwijder de galblaas. Verwijder de lever voorzichtig uit de buikholte. Wees voorzichtig, want het zal in dit stadium dun en fragiel zijn.Plaats de lever in de ijskoude conserveringsbuffer. Breng de lever over in een petrischaaltje van 10 centimeter en voeg 10 milliliter ijskoude Williams'Medium E.Rupture de Glisson-capsule met een pincet met fijne punt toe op een paar plaatsen langs het leveroppervlak. Pak een centraal deel vast met twee pincetten.Trek ze langzaam uit elkaar, laat de capsule scheuren zonder de hepatocyten te beschadigen en laat de cellen los door de capsule voorzichtig te schudden. Filter vijf milliliter leverpulp door een 100 micrometer celzeef in een buis van 50 milliliter. Spoel het filter af met 10 milliliter vers ijskoud medium en filter de resterende vijf milliliter pulp door de celzeef.Draai het extract op 50 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Zuig het grootste deel van het supernatant op, waardoor er één milliliter overblijft om de cellen te resuspenderen door de buis voorzichtig rond te draaien. Voeg 40 milliliter koude Williams'E Medium toe en herhaal de stap drie keer.Ga verder met de isolatie van hepatocyten zoals beschreven in het tekstmanuscript. Na 70% hepatectomie bij muizen was de uiteindelijke hepatocytenopbrengst ongeveer 10 tot 15 x 10 tot de 6e met 78% gemiddelde uiteindelijke levensvatbaarheid. Terwijl na verlengde 86% hepatectomie, de hepatocytenopbrengst vier tot negen x 10 tot de 6e was met 65% gemiddelde levensvatbaarheid.Na partiële hepatectomie vertonen hepatocyten een verhoogde celgrootte in vergelijking met normale levers die overeenkomt met een verhoogd lipidegehalte. Verhoogd lipidegehalte werd waargenomen in muizenhepatocyten 24 uur na partiële hepatectomie, gezien als een toename van granulariteit of direct waargenomen door de aanwezigheid van lipideblaasjes in vergrote hepatocyten. Tijdens het gebruik van de klassieke dichtheidsgradiëntzuiveringsmethode gingen grote vette hepatocyten verloren in het supernatant en alleen kleinere magere hepatocyten werden verzameld in de celpellet.Met het verbeterde protocol gingen de met lipiden gevulde hepatocyten niet verloren en werden alle hepatocyten gepelletiseerd. Het herhaaldelijk klemmen vergemakkelijkt het spoelproces. Daarmee wordt de lever optimaal gezuiverd van resterende bloedbestanddelen die de spijsverteringsenzymen zouden kunnen remmen.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Een model van Disturbed Flow-geïnduceerde atherosclerose in Muis halsslagader op een gedeelte van ligatie en een eenvoudige methode van RNA isolatie van carotis Endotheel

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Het beoordelen van Veranderingen in Volatile narcose gevoeligheid van muizen na lokale of systemische farmacologische interventie

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halsslagader Infusions voor farmacokinetische en farmacodynamische analyse van Taxanen in Muizen

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisatie van vasculaire en Parenchymale Regeneratie na 70% Gedeeltelijke hepatectomy in normale muizen

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Intrasplenic transplantatie van hepatocyten na gedeeltelijke Hepatectomy in KNIPOOG. SCID muizen

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Opnieuw Arterialized Rat gedeeltelijke lever transplantatie met een in vivo vaartuig georiënteerde 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantatie van stamcellen adipeus weefsel afkomstige blad om lekkage na gedeeltelijke Colectomy in een Rat-Model

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

Volledige en gedeeltelijke aorta occlusie voor de behandeling van hemorragische schok in varkens

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolatie van primaire muisknop hepatocyten door niet-radioactieve L-azidohomoalanine Labeling methode p.a. ontluikende eiwit synthese

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...