Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
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Cette étude a été soutenue par le Fonds national suisse (subvention de projet 310030_189262).

Toutes les expérimentations sur les animaux étaient conformes à la réglementation fédérale sur les animaux et approuvées par l’Office vétérinaire de Zurich (n° 007/2017, 156/2019) garantissant les soins aux humains. Les souris C57BL/6 mâles âgées de 10 à 12 semaines ont été maintenues sur un cycle jour/nuit de 12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau. Chaque groupe expérimental était composé de six à huit animaux. Voir le tableau des matériaux pour plus de détail...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

Le protocole publié fournit une méthode fiable et simple pour isoler un rendement élevé d’hépatocytes murins normaux et stéatotiques pour des analyses en aval de cellules uniques ou une analyse en vrac de cellules après tri FACS. L’avantage distinct par rapport à la purification par gradient de densité est que la teneur en lipides cellulaires n’a essentiellement aucun impact sur le rendement effectif des hépatocytes. Ainsi, la fraction des hépatocytes stéatotiques sera retenue et incluse dans les analys...

Le foie peut se régénérer même après une perte tissulaire importante. Cette capacité de régénération unique est explicitement illustrée par le modèle expérimental d’hépatectomie partielle (70%), décrit pour la première fois chez le rat par Higgins et Anderson en 19311. Dans ce modèle, 70% du foie est enlevé chirurgicalement des animaux en coupant les lobes hépatiques plus gros. Les lobes restants se développent ensuite par hypertrophie compensatoire pour restaurer la masse hépatique d’origine dans environ 1 semaine après la chirurgie, mais sans restauration de l’architecture hépatique d’origine 2,3. D’autres hépatectomies avec des quantités variables d’ablation de tissus ont été développées, telles que l’hépatectomie étendue à 86% où le reste du foie est trop petit pour récupérer, conduisant éventuellement à une insuffisance hépatique post-hépatectomie (PHLF) et à la mort subséquente chez 30% à 50% des animaux 4,5,6. Ces modèles permettent d’étudier la régénération hépatique normale et défaillante, en fonction de la quantité de tissu réséqué (Figure 1).
Bien que les modèles murins d’hépatectomies soient utilisés avec succès depuis de nombreuses années, ce n’est que récemment que des méthodes analytiques plus avancées ont permis une compréhension plus approfondie au niveau de la cellule unique. Pour la plupart de ces méthodes, cependant, la présence d’hépatocytes individuels est une condition préalable de base. La plupart des protocoles d’isolement des hépatocytes primaires sont basés sur une technique de perfusion de collagénase en deux étapes et une purification subséquente par gradient de densité pour séparer les hépatocytes viables des débris et des cellules non parenchymateuses 7,8,9. Cette méthode a été décrite pour la première fois par Berry et Friend en 196910 et adaptée par Seglen et ses collègues en 197211,12. Cependant, comme la centrifugation par gradient dépend de la densité et de la taille des cellules, les hépatocytes chargés de lipides sont souvent perdus lors de la purification standard. Bien qu’une telle perte puisse être négligeable pour de nombreuses questions de recherche, il s’agit d’un aspect crucial pour la régénération précoce du foie. Au cours des 2 premiers jours, les hépatocytes dans le foie de souris en régénération accumulent des lipides, augmentant ainsi en taille et en densité. Cette stéatose transitoire associée à la régénération (TRAS) sert à fournir un carburant régénératif et est temporaire, mais chevauche partiellement la phase proliférative majeure et est inégalement répartie dans les lobules hépatiques - les unités fonctionnelles du foie13,14. Après une hépatectomie prolongée à 86%, cependant, TRAS se produit également mais persiste, car la régénération est bloquée et les lipides ne sont pas oxydés14. Par conséquent, la purification par gradient des hépatocytes après des hépatectomies à 70% ou 86% produira des fractions non représentatives, car la plupart des hépatocytes chargés de lipides sont perdus en raison de leur faible densité15.
Dans ce protocole d’isolement modifié, les hépatocytes de souris C57BL/6 sont isolés 24 à 48 h après l’hépatectomie par une approche classique de perfusion de collagénase en deux étapes. Habituellement, la canulation et la perfusion du reste pour l’isolement cellulaire se font via la veine porte. Cependant, la résistance portovasculaire dans les petits restes laissés après une résection majeure est élevée16, et donc la perfusion est délicate. Parce que la veine cave reste non affectée par les hépatectomies, la perfusion peut être facilement effectuée dans le sens rétrograde par canulation de la veine cave. Une pompe péristaltique standard conduit les solutions chauffées via la veine cave inférieure cathétérisée dans le reste du foie, en utilisant une perfusion rétrograde avec écoulement par la veine porte (figure supplémentaire S1). Les hépatocytes sont dissociés par les collagénases et libérés de la capsule de Glisson. Après lavage et traitement soigneux des hépatocytes viables par isolement progressif à l’aide d’une approche de centrifugation à basse vitesse, les hépatocytes peuvent être utilisés pour toutes les analyses en aval.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

L’hépatectomie partielle a été largement utilisée pour étudier la régénération du foie chez la souris, mais l’isolement des rendements élevés d’hépatocytes viables pour des applications unicellulaires en aval est difficile. Une accumulation marquée de lipides au sein des hépatocytes en régénération est observée pendant les 2 premiers jours de régénération hépatique normale chez la souris. Cette stéatose associée à la régénération transitoire (TRAS) est temporaire mais chevauche partiellement la phase proliférative majeure. La purification par gradient de densité est l’épine dorsale de la plupart des protocoles existants pour l’isolement des hépatocytes primaires. Comme la purification par gradient repose sur la densité et la taille des cellules, elle sépare les populations d’hépatocytes non stéatotiques des populations d’hépatocytes stéatotiques. Par conséquent, les hépatocytes gras sont souvent perdus, produisant des fractions hépatocytes non représentatives. 
Le protocole présenté décrit une méthode simple et fiable pour l’isolement in vivo des hépatocytes en régénération, quelle que soit leur teneur en lipides. Les hépatocytes de souris mâles C57BL/6 sont isolés 24 à 48 h après l’hépatectomie par une approche classique de perfusion de collagénase en deux étapes. Une pompe péristaltique standard conduit les solutions chauffées via la veine cave inférieure cathétérisée dans le reste, en utilisant une technique de perfusion rétrograde avec écoulement par la veine porte. Les hépatocytes sont dissociés par la collagénase pour leur libération de la capsule de Glisson. Après un lavage et une centrifugation soigneuse, les hépatocytes peuvent être utilisés pour toutes les analyses en aval. En conclusion, cet article décrit une technique simple et reproductible pour l’isolement d’une population représentative d’hépatocytes en régénération après hépatectomie partielle chez la souris. La méthode peut également aider à l’étude de la stéatose hépatique.

Le TRAS culmine à 16 heures après l’hépatectomie et disparaît progressivement 32 à 48 heures après l’hépatectomie standard, mais persiste au-delà de 48 heures après une hépatectomie étendue. Macroscopiquement, TRAS est facilement visible comme un teint pâle du reste du foie (Figure 1F) et peut être observé chez les souris hépatectomisées entre 16 h et 48 h après la chirurgie.
Le rendement final estimé est de 10-15 × 10 6 hépatocytes après ...

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Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Les hépatocytes chargés de lipides sont inhérents à la régénération du foie, mais sont généralement perdus lors de la centrifugation par gradient de densité. Ici, nous présentons un protocole d’isolement cellulaire optimisé qui conserve les hépatocytes stéatotiques, produisant des populations représentatives d’hépatocytes en régénération après hépatectomie partielle chez la souris.

Isolement des hépatocytes régénérants après hépatectomie partielle chez la souris

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

L’objectif global de ce protocole est de présenter une méthode optimisée pour l’isolement des hépatocytes chez la souris après hépatectomie partielle sans avoir besoin de centrifugation par gradient de densité. Nous voyons généralement un pourcentage élevé d’hépatocytes chargés de lipides au cours de la régénération précoce. Les hépatocytes stéatotiques habituellement perdus lors de la centrifugation du gradient de densité en raison de la faible densité sont conservés avec ce protocole.Pour préparer l’équipement de perfusion, connectez une canule IUI de calibre 26 à l’extrémité de sortie du tube à l’aide d’un connecteur Luer Lock. Ensuite, rincez le tube et insérez l’extrémité d’entrée du tube dans le tube tampon de perfusion préchauffé au bain-marie. Amorcez-le avec un tampon de perfusion chaud à une vitesse de pompe de trois millilitres par minute.Avant de procéder à la chirurgie, assurez-vous que la souris est correctement anesthésiée. Nettoyez ensuite l’abdomen avec une solution de gommage chirurgical et de l’éthanol à 70%. Ensuite, coupez les sutures pour rouvrir l’incision médiane précédemment faite pour l’hépatectomie partielle et écartez doucement les bords de la plaie.Si l’hépatectomie date de plus de 24 à 48 heures, retirez la suture et coupez la peau avec des ciseaux ou un scalpel. Utilisez un rétracteur ou de simples clips pour garder l’abdomen ouvert. La cavité abdominale doit être exposée autant que possible pour optimiser l’accès et la visualisation.Fixez une suture en polypropylène 5-0 au sternum. Tirez-le crânienne et fixez-le dans cette position. Déplacez les intestins vers la droite à l’aide de cotons-tiges stériles pour révéler la veine porte et la veine cave.Utilisez un chiffon humide pour retenir les intestins. Placez un objet lourd d’environ deux centimètres de hauteur, tel qu’un anneau de poids en métal adjacent aux pattes postérieures de la souris. Ensuite, placez le tube avec la canule IUI de calibre 26 connectée sur l’objet et positionnez soigneusement l’aiguille sur le dessus de la veine cave.Ajustez la longueur du tube au besoin. Transférer la solution mère de collagénase dans le tube tampon de digestion préchauffé. Préparez 10 à 20 millilitres de tampon de digestion par animal.Allumez la pompe après avoir réglé la vitesse de la pompe à trois millilitres par minute. Jetez les deux à trois premiers millilitres du tampon de perfusion préchauffé une fois que le tampon atteint l’aiguille. Pour effectuer la canulation de la veine cave inférieure, utilisez un coton-tige stérile pour tirer doucement la veine cave caudale sous la ponction afin que la tension fournie facilite l’insertion de la canule dans la veine.Insérez la canule IUI de calibre 26 à un angle peu profond dans la veine cave inférieure sous le rein pendant que le tampon traverse l’aiguille. Assurez-vous que le biseau de l’aiguille pointe vers le haut. Recherchez du sang dans la chambre flash du cathéter lorsque l’aiguille pénètre dans la lumière.Avancez l’aiguille de deux à trois millimètres supplémentaires pour vous assurer que l’extrémité du cathéter pénètre dans la veine. Faites glisser le cathéter en plastique sur l’aiguille et dans la veine cave encore cinq millimètres. Retirez l’aiguille lentement et très soigneusement.Après deux à trois secondes, recherchez des taches blanches se formant dans le foie ou un gonflement de la veine porte, ce qui indique que le tampon de perfusion circule dans le foie et pénètre dans les lobules hépatiques à partir de la veine centrale. Attendez que la veine porte gonfle visiblement dans les une à deux secondes de la formation de taches blanches à la surface du foie. Couper la veine porte avec des ciseaux aussi distalement que possible du hile du foie.Augmentez le débit à quatre à sept millilitres par minute en fonction du poids de l’animal, de la taille du foie et de l’étendue de l’hépatectomie initiale. Serrez la veine porte avec une pince à épiler ou une pince vasculaire pendant sept à 10 secondes. Assurez-vous qu’aucun liquide ne passe.Effectuez une deuxième pince après environ 30 secondes et assurez-vous que le foie gonfle et se détend. Continuez à rincer l’animal pendant trois à quatre minutes et observez le tampon clair qui s’écoule de la veine porte. Serrez la veine porte pendant trois à quatre secondes avant que le tampon de digestion n’atteigne le foie.Assurez-vous que le foie se détend lors de la libération de la pince et que le liquide de perfusion reste clair. Une fois que le tampon de digestion atteint le foie, serrez à nouveau la veine porte. Le foie ne doit pas se détendre après la libération du clampage.Digérer pendant environ quatre minutes à un débit de cinq millilitres par minute. Au fur et à mesure que la digestion progresse, recherchez des signes de gonflement du foie et de petites sections transparentes à la surface du foie. Observez que le foie prend la texture d’un morceau de tissu humide et semble presque détrempé.Sondez la consistance en la touchant soigneusement avec un coton-tige humide et stérile. Continuez avec la perfusion jusqu’à ce qu’une différence marquée dans la texture de surface du foie puisse être observée. Observez que le foie prend une couleur très claire et un aspect pétillant indiquant la capsule de Glisson se séparant du parenchyme.Arrêtez la digestion dès que le foie a acquis ces propriétés. Retirez l’aiguille avant que l’air ne pénètre dans le foie. Saisissez le tissu conjonctif central entre les lobes à l’aide d’une pince et soulevez-le légèrement vers le haut en l’utilisant comme point d’ancrage.Coupez toutes les connexions du foie à d’autres organes et retirez la vésicule biliaire. Retirez doucement le foie de la cavité abdominale. Soyez prudent car il sera fragile et fragile à ce stade.Placez le foie dans le tampon de conservation glacé. Transférer le foie dans une boîte de Petri de 10 centimètres et ajouter 10 millilitres de glaçon Williams’Medium E.Rupture de la capsule de Glisson avec une pince à épiler à pointe fine à quelques endroits le long de la surface du foie. Saisissez une partie centrale avec deux paires de pincettes.Séparez-les lentement, en permettant à la capsule de se déchirer sans endommager les hépatocytes et libérez les cellules en secouant doucement la capsule. Filtrer cinq millilitres de pulpe hépatique à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Rincez le filtre avec 10 millilitres de milieu glacé frais et filtrez les cinq millilitres restants de pulpe à travers la crépine cellulaire.Faire tourner l’extrait à 50 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez la majeure partie du surnageant, en laissant un millilitre pour remettre les cellules en suspension en faisant tourner doucement le tube. Ajouter 40 millilitres de Williams’E Medium froid et répéter l’étape trois fois.Procéder à l’isolement des hépatocytes comme décrit dans le manuscrit textuel. Après une hépatectomie de 70% chez la souris, le rendement final des hépatocytes était d’environ 10 à 15 x 10 à la 6ème avec une viabilité finale moyenne de 78%. Alors qu’après une hépatectomie étendue de 86%, le rendement en hépatocytes était de quatre à neuf x 10 à la 6ème avec une viabilité moyenne de 65%.Après des hépatectomies partielles, les hépatocytes présentent une taille cellulaire accrue par rapport aux foies normaux correspondant à une augmentation de la teneur en lipides. Une augmentation de la teneur en lipides a été observée dans les hépatocytes murins 24 heures après une hépatectomie partielle, considérée comme une augmentation de la granularité ou directement observée par la présence de vésicules lipidiques à l’intérieur des hépatocytes élargis. Lors de l’utilisation de la méthode classique de purification par gradient de densité, de gros hépatocytes gras ont été perdus dans le surnageant et seuls des hépatocytes maigres plus petits sont collectés dans le granulé cellulaire.Avec le protocole amélioré, les hépatocytes remplis de lipides n’ont pas été perdus et tous les hépatocytes ont été granulés. Le serrage répétitif facilite le processus de rinçage. Avec cela, le foie est éliminé de manière optimale des composants sanguins restants qui pourraient inhiber les enzymes de digestion.

Research

JoVE Journal

Medicine

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