Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Swiss National Fond (prosjektstipend 310030_189262).

Alle dyreforsøk var i samsvar med sveitsiske føderale dyreforskrifter og godkjent av veterinærkontoret i Zürich (nr. 007/2017, 156/2019) som sikrer menneskelig omsorg. Mannlige C57BL/6 mus i alderen 10-12 uker ble holdt på en 12 timers dag / natt syklus med fri tilgang til mat og vann. Hver forsøksgruppe besto av seks til åtte dyr. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, utstyr og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. Delvis hepat...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

Den publiserte protokollen gir en pålitelig og enkel metode for å isolere et høyt utbytte av normale og steatotiske murine hepatocytter for enkeltcelle nedstrømsanalyser eller bulkanalyse av celler etter FACS-sortering. Den klare fordelen over tetthetsgradientrensing er at det cellulære lipidinnholdet i hovedsak ikke har noen innvirkning på det effektive utbyttet av hepatocytter. Dermed vil fraksjonen av steatotiske hepatocytter beholdes og inkluderes i nedstrømsanalyser. Dette er ikke bare avgjørende for studiet...

Leveren kan regenerere seg selv selv etter stort vevstap. Denne unike regenerative kapasiteten er eksplisitt illustrert av den eksperimentelle modellen for delvis (70%) hepatektomi, først beskrevet hos rotter av Higgins og Anderson i 19311. I denne modellen fjernes 70% av leveren kirurgisk fra dyr ved å klippe av større leverlapper. De resterende vokser deretter gjennom kompenserende hypertrofi for å gjenopprette den opprinnelige levermassen innen ca. 1 uke etter operasjonen, om enn uten restaurering av den opprinnelige leverarkitekturen 2,3. Ytterligere hepatektomier med varierende mengder vevsfjerning har blitt utviklet, for eksempel 86% utvidet hepatektomi hvor leverresten er for liten til å gjenopprette, noe som til slutt fører til posthepatektomi leversvikt (PHLF) og etterfølgende død hos 30% -50% av dyrene 4,5,6. Disse modellene muliggjør studier av normal og mislykket leverregenerering, avhengig av mengden resektert vev (figur 1).
Selv om musemodeller av hepatektomier har blitt brukt med suksess i mange år, har bare nylig mer avanserte analysemetoder tillatt en dypere innsikt på enkeltcellenivå. For de fleste av disse metodene er imidlertid tilstedeværelsen av individuelle hepatocytter en grunnleggende forutsetning. De fleste protokoller for isolering av primære hepatocytter er basert på en to-trinns kollagenaseperfusjonsteknikk og påfølgende tetthetsgradientrensing for å skille levedyktige hepatocytter fra rusk og ikke-parenkymal, samt døde celler 7,8,9. Denne metoden ble først beskrevet av Berry og Friend i 196910 og tilpasset av Seglen og kolleger i 197211,12. Imidlertid, da gradientsentrifugering er avhengig av tettheten og størrelsen på cellene, går lipidbelastede hepatocytter ofte tapt under standard rensing. Selv om et slikt tap kan være ubetydelig for mange forskningsspørsmål, er det et avgjørende aspekt for tidlig leverregenerering. I løpet av de første 2 dagene akkumulerer hepatocytter i den regenererende museleveren lipider, og vokser dermed i størrelse og dypper i tetthet. Denne forbigående regenereringsassosierte steatosen (TRAS) tjener til å gi regenerativt drivstoff og er midlertidig, men overlapper delvis den viktigste proliferative fasen og er ujevnt fordelt i leverlobulene - de funksjonelle enhetene i leveren13,14. Etter utvidet 86% -hepatektomi oppstår imidlertid TRAS også, men vedvarer, fordi regenerering er stoppet og lipider ikke blir oksidert14. Derfor vil gradientrensing av hepatocytter etter 70%- eller 86%-hepatektomier gi ikke-representative fraksjoner, da de fleste lipidbelastede hepatocytter går tapt på grunn av deres lave tetthet15.
I denne modifiserte isolasjonsprotokollen isoleres hepatocytter fra C57BL/6-mus 24-48 timer etter hepatektomi ved en klassisk to-trinns kollagenaseperfusjonstilnærming. Vanligvis gjøres kanylering og perfusjon av resten for celleisolasjon via portalvenen. Portovaskulær resistens i små rester etter større reseksjon er imidlertid høy16, og perfusjonen er derfor ømfintlig. Fordi vena cava forblir upåvirket av hepatektomier, kan perfusjon lett utføres i retrograd retning via kanylering av vena cava. En standard peristaltisk pumpe driver de oppvarmede løsningene via den kateteriserte vena cava inferior inn i leverresten, ved bruk av retrograd perfusjon med utstrømning gjennom portvenen (tilleggsfigur S1). Hepatocytter dissocieres av kollagenaser og frigjøres fra Glissons kapsel. Etter vask og forsiktig behandling av levedyktige hepatocytter ved trinnvis isolasjon ved hjelp av en lavhastighets sentrifugeringsmetode, kan hepatocytter brukes til alle nedstrømsanalyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

Delvis hepatektomi har vært mye brukt til å undersøke leverregenerering hos mus, men isolering av høye utbytter av levedyktige hepatocytter for nedstrøms enkeltcelleapplikasjoner er utfordrende. En markert akkumulering av lipider i regenererende hepatocytter observeres i løpet av de første 2 dagene av normal leverregenerering hos mus. Denne såkalte transiente regenereringsassosierte steatosen (TRAS) er midlertidig, men overlapper delvis den store proliferative fasen. Density-gradient rensing er ryggraden i de fleste eksisterende protokoller for isolering av primære hepatocytter. Siden gradientrensing er avhengig av tettheten og størrelsen på cellene, skiller den ikke-steatotisk fra steatotiske hepatocyttpopulasjoner. Derfor går fete hepatocytter ofte tapt, noe som gir ikke-representative hepatocytfraksjoner. 
Den presenterte protokollen beskriver en enkel og pålitelig metode for in vivo-isolering av regenererende hepatocytter uavhengig av lipidinnholdet. Hepatocytter fra mannlige C57BL/6-mus isoleres 24-48 timer etter hepatektomi ved en klassisk to-trinns kollagenaseperfusjonstilnærming. En standard peristaltisk pumpe driver de oppvarmede løsningene via den kateteriserte dårligere vena cava inn i resten, ved hjelp av en retrograd perfusjonsteknikk med utstrømning gjennom portalvenen. Hepatocytter dissocieres av kollagenase for frigjøring fra Glissons kapsel. Etter vask og forsiktig sentrifugering kan hepatocytter brukes til eventuelle nedstrømsanalyser. Avslutningsvis beskriver dette papiret en enkel og reproduserbar teknikk for isolering av en representativ populasjon av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus. Metoden kan også hjelpe studiet av fettleversykdom.

TRAS topper ved 16 timer etter hepatektomi og forsvinner gradvis 32-48 timer etter standard hepatektomi, men vedvarer utover 48 timer etter utvidet hepatektomi. Makroskopisk er TRAS lett synlig som en blek hudfarge i leverresten (figur 1F) og kan observeres hos hepatektomiserte mus mellom 16 timer og 48 timer etter operasjonen.
Det estimerte endelige utbyttet er 10-15 × 10 6 hepatocytter etter 70% -hepatektomi og 4-9 × 106 etter utvidet 86%...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Lipidbelastede hepatocytter er iboende for leverregenerering, men går vanligvis tapt ved sentrifugering av tetthetsgradient. Her presenterer vi en optimalisert celleisolasjonsprotokoll som beholder steatotiske hepatocytter, noe som gir representative populasjoner av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus.

Isolering av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Det overordnede målet med denne protokollen er å presentere en optimalisert metode for hepatocyttisolering hos mus etter delvis hepatektomi uten behov for sentrifugering av tetthetsgradient. Vi ser vanligvis en stor prosentandel av lipidbelastede hepatocytter under tidlig regenerering. De steatotiske hepatocytter som vanligvis går tapt ved sentrifugering av tetthetsgradient på grunn av den lave tettheten, beholdes med denne protokollen.For å klargjøre perfusjonsutstyret, koble en 26 gauge IUI-kanyle til utløpsenden av slangen ved hjelp av en Luer-låsekontakt. Skyll deretter slangen og sett innløpsenden av røret inn i det forvarmede perfusjonsbufferrøret i vannbadet. Prime den med varm perfusjonsbuffer med en pumpehastighet på tre milliliter per minutt.Før du fortsetter med operasjonen, må du sørge for at musen er tilstrekkelig bedøvet. Rengjør deretter magen med en kirurgisk skrubbeløsning og 70% etanol. Kutt deretter suturene for å gjenåpne midtlinjesnittet som tidligere ble laget for delvis hepatektomi og trekk forsiktig sårkantene fra hverandre.Hvis hepatektomi er eldre enn 24 til 48 timer, fjern suturen og kutt huden med saks eller skalpell. Bruk en retractor eller enkle klips for å holde magen åpen. Bukhulen bør eksponeres så mye som mulig for å optimalisere tilgang og visualisering.Fest en 5-0 polypropylen sutur til brystbenet. Trekk den kranialt og fest den i denne posisjonen. Flytt tarmene til høyre ved hjelp av sterile bomullspinner for å avsløre portalvenen og vena cava.Bruk en våt klut for å beholde tarmene. Plasser en tung gjenstand på omtrent to centimeter høyde, for eksempel en metallvektring ved siden av musens bakben. Plasser deretter slangen med den tilkoblede 26 gauge IUI-kanylen på gjenstanden og plasser nålen forsiktig på toppen av vena cava.Juster lengden på slangen etter behov. Overfør kollagenaseoppløsningen til det forvarmede fordøyelsesbufferrøret. Forbered 10 til 20 ml fordøyelsesbuffer per dyr.Slå på pumpen etter å ha justert pumpehastigheten til tre milliliter per minutt. Kast de første to til tre milliliter av den forvarmede perfusjonsbufferen når bufferen når nålen. For å utføre kanylering av den dårligere vena cava, bruk en steril bomullspinne for å forsiktig trekke vena cava kaudalt under punkteringen slik at den tilførte spenningen letter innføringen av kanylen i venen.Sett den 26 gauge IUI-kanylen i grunne vinkel inn i den dårligere vena cava under nyrene mens bufferen løper gjennom nålen. Pass på at nålens skråning peker oppover. Se etter blod i kateterets blitskammer når nålen kommer inn i lumen.Flytt nålen ytterligere to til tre millimeter for å sikre at kateterets spiss kommer inn i venen. Skyv plastkateteret over nålen og inn i vena cava ytterligere fem millimeter. Fjern nålen sakte og veldig forsiktig.Etter to til tre sekunder, se etter hvite flekker som dannes i leveren eller hevelse i portalvenen, noe som indikerer at perfusjonsbufferen strømmer gjennom leveren og kommer inn i leveren lobuler fra den sentrale venen. Vent til portalvenen synlig svulmer innen ett til to sekunder av hvite flekker som dannes på leveroverflaten. Klipp portalvenen med saks så distalt som mulig fra leverhilus.Øk strømningshastigheten til fire til syv milliliter per minutt, avhengig av dyrets vekt, leverstørrelse og omfanget av den første hepatektomien. Klem portalvenen med pinsett eller en vaskulær klemme i syv til 10 sekunder. Pass på at ingen væske passerer gjennom.Utfør en ny klemme etter ca. 30 sekunder og sørg for at leveren svulmer og slapper av. Fortsett å skylle dyret i tre til fire minutter og observer den klare bufferen som strømmer ut av portalvenen. Klem portalvenen i tre til fire sekunder før fordøyelsesbufferen når leveren.Sørg for at leveren slapper av når klemmen frigjøres, og at perfusjonsvæsken forblir klar. Når fordøyelsesbufferen når leveren, klemmer du portalvenen igjen. Leveren bør ikke slappe av etter frigjøring av klemmen.Fordøy i omtrent fire minutter med en strømningshastighet på fem milliliter per minutt. Etter hvert som fordøyelsen utvikler seg, se etter tegn på at leveren begynner å hovne opp og små gjennomsiktige seksjoner på overflaten av leveren. Vær oppmerksom på at leveren tar på seg tekstur av et vått stykke klut og virker nesten fuktig.Undersøk konsistensen ved å berøre den forsiktig med en fuktig, steril bomullspinne. Fortsett med perfusjonen til en markert forskjell i leverens overflatetekstur kan observeres. Vær oppmerksom på at leveren antar en veldig lys farge og et boblende utseende som indikerer Glissons kapsel som skiller seg fra parenkymen.Stopp fordøyelsen så snart leveren har fått disse egenskapene. Fjern nålen før luften kommer inn i leveren. Ta tak i det sentrale bindevevet mellom ved hjelp av tang og løft det litt oppover ved å bruke det som ankerpunkt.Klipp alle tilkoblinger av leveren til andre organer og fjern galleblæren. Fjern leveren forsiktig fra bukhulen. Vær forsiktig da det vil være spinkelt og skjørt på dette stadiet.Plasser leveren i den iskalde bevaringsbufferen. Overfør leveren til en 10 centimeter petriskål og tilsett 10 milliliter iskald Williams'Medium E.Ruptur Glissons kapsel med fin spisspinsett på noen få steder langs leveroverflaten. Ta tak i en sentral del med to par pinsett.Trekk dem sakte fra hverandre, slik at kapselen kan rive uten å skade hepatocytter og frigjøre cellene ved å riste kapselen forsiktig. Filtrer fem milliliter levermasse gjennom en 100 mikrometer cellesil i et 50 milliliter rør. Skyll filteret med 10 ml fersk iskaldt medium og filtrer de resterende fem milliliter masse gjennom cellesilen.Spinn ekstrakten ved 50 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Aspirer det meste av supernatanten, og la en milliliter resuspendere cellene ved å virvle røret forsiktig. Tilsett 40 ml kald Williams'E Medium og gjenta trinnet tre ganger.Fortsett med isolering av hepatocytter som beskrevet i tekstmanuskriptet. Etter 70% hepatektomi hos mus var det endelige hepatocytutbyttet ca. 10 til 15 x 10 til 6. med 78% gjennomsnittlig endelig levedyktighet. Mens etter utvidet 86% hepatektomi, var hepatocytutbyttet fire til ni x 10 til 6th med 65% gjennomsnittlig levedyktighet.Etter partielle hepatektomier viser hepatocytter økt cellestørrelse sammenlignet med normal lever tilsvarende økt lipidinnhold. Økt lipidinnhold ble observert i murine hepatocytter 24 timer etter partiell hepatektomi, sett som en økning i granularitet eller direkte observert ved tilstedeværelse av lipidvesikler inne i forstørrede hepatocytter. Ved bruk av den klassiske tetthetsgradientrensingsmetoden gikk store fete hepatocytter tapt i supernatanten, og bare mindre magre hepatocytter samles i cellepelleten.Med den forbedrede protokollen gikk ikke de lipidfylte hepatocytter tapt, og alle hepatocytter ble pelletert. Den repeterende klemmingen letter spyleprosessen. Med det blir leveren optimalt fjernet fra gjenværende blodkomponenter som kan hemme fordøyelsesenzymer.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Vurdere endringer i Volatile Narkose Følsomhet av Mus etter lokale eller systemiske Farmakologisk Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisering av Vaskulær og Parenkymalt Regeneration etter 70% Delvis hepatectomy i normale mus

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Intrasplenic transplantasjon av hepatocytter etter delvis Hepatectomy i NIKK. SCID mus

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Nytt Arterialized Rat delvis leveren transplantasjon med en i vivo fartøyet orienterte 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantasjon av fettvev-avledet stilk cellen ark å redusere lekkasje etter delvis Colectomy i en rotte modell

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

Fullstendig og delvis aorta okklusjon for behandling av hemoragisk sjokk i svin

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolasjon hepatocytes hovedknappen på musen for begynnende Protein syntese analyse av ikke-radioaktivt L-azidohomoalanine merking metoden

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediert genterapi av hepatocytter Ex Vivo for autolog transplantasjon i svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...