Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo Swiss National Fond (bolsa de projeto 310030_189262).

Todos os experimentos com animais foram de acordo com o Regulamento Federal Suíço de Animais e aprovados pelo Escritório Veterinário de Zurique (n° 007/2017, 156/2019), garantindo cuidados humanos. Camundongos machos C57BL/6 com idade entre 10-12 semanas foram mantidos em um ciclo de 12 h dia/noite com livre acesso a alimentos e água. Cada grupo experimental foi composto por seis a oito animais. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, equipamentos e rea...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

O protocolo publicado fornece um método confiável e direto para isolar um alto rendimento de hepatócitos murinos normais e esteatóticos para análises a jusante de célula única ou análise em massa de células após a classificação FACS. A vantagem distinta sobre a purificação do gradiente de densidade é que o conteúdo lipídico celular não tem essencialmente impacto no rendimento efetivo dos hepatócitos. Assim, a fração de hepatócitos esteatóticos será retida e incluída nas análises a jusante. Isso ...

O fígado pode regenerar-se mesmo após uma grande perda de tecido. Essa capacidade regenerativa única é explicitamente ilustrada pelo modelo experimental de hepatectomia parcial (70%), descrito pela primeira vez em ratos por Higgins e Anderson em 19311. Neste modelo, 70% do fígado é removido cirurgicamente dos animais, cortando lobos hepáticos maiores. Os lobos restantes crescem então através de hipertrofia compensatória para restaurar a massa hepática original dentro de cerca de 1 semana após a cirurgia, embora sem restauração da arquitetura hepática original 2,3. Hepatectomias adicionais com quantidades variadas de remoção tecidual têm sido desenvolvidas, como a hepatectomia prolongada a 86%, onde o remanescente hepático é muito pequeno para se recuperar, levando eventualmente à insuficiência hepática pós-hepatectomia (PHLF) e subsequente morte em 30%-50% dos animais 4,5,6. Esses modelos possibilitam o estudo da regeneração hepática normal e falha, dependendo da quantidade de tecido ressecado (Figura 1).
Embora os modelos de hepatectomias em camundongos tenham sido usados com sucesso por muitos anos, apenas recentemente métodos analíticos mais avançados permitiram uma visão mais profunda no nível de célula única. Para a maioria desses métodos, no entanto, a presença de hepatócitos individuais é um pré-requisito básico. A maioria dos protocolos para o isolamento de hepatócitos primários baseia-se em uma técnica de perfusão de colagenase em duas etapas e subsequente purificação de gradiente de densidade para separar hepatócitos viáveis de detritos e não parenquimatos, bem como células mortas 7,8,9. Esse método foi descrito pela primeira vez por Berry e Friend em 196910 e adaptado por Seglen e colegas em 197211,12. No entanto, como a centrifugação por gradiente depende da densidade e do tamanho das células, os hepatócitos carregados de lipídios são frequentemente perdidos durante a purificação padrão. Embora essa perda possa ser insignificante para muitas questões de pesquisa, é um aspecto crucial para a regeneração hepática precoce. Durante os primeiros 2 dias, os hepatócitos dentro do fígado de rato em regeneração acumulam lípidos, crescendo assim em tamanho e mergulhando em densidade. Essa esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) serve para fornecer combustível regenerativo e é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à fase proliferativa principal e é distribuída de forma desigual dentro dos lóbulos hepáticos - as unidades funcionais do fígado13,14. Após a hepatectomia prolongada de 86%, no entanto, a SRAT também ocorre, mas persiste, pois a regeneração é paralisada e os lipídios não estão sendo oxidados14. Portanto, a purificação gradiente de hepatócitos após hepatectomias de 70% ou 86% produzirá frações não representativas, pois a maioria dos hepatócitos carregados de lipídios é perdida devido à sua baixa densidade15.
Neste protocolo de isolamento modificado, hepatócitos de camundongos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Normalmente, a canulação e a perfusão do remanescente para isolamento celular são feitas através da veia porta. No entanto, a resistência portovascular em pequenos remanescentes deixados após ressecção maior é alta16 e, portanto, a perfusão é delicada. Como a veia cava permanece não afetada pelas hepatectomias, a perfusão pode ser facilmente realizada na direção retrógrada através da canulação da veia cava. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente hepático, utilizando perfusão retrógrada com saída pela veia porta (Figura Suplementar S1). Os hepatócitos são dissociados pelas colagenases e liberados da cápsula de Glisson. Após a lavagem e o processamento cuidadoso de hepatócitos viáveis por isolamento gradual usando uma abordagem de centrifugação de baixa velocidade, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

A hepatectomia parcial tem sido amplamente utilizada para investigar a regeneração hepática em camundongos, mas o isolamento de altos rendimentos de hepatócitos viáveis para aplicações unicelulares a jusante é um desafio. Um acúmulo acentuado de lipídios dentro de hepatócitos em regeneração é observado durante os primeiros 2 dias de regeneração hepática normal em camundongos. Esta chamada esteatose associada à regeneração transitória (TRAS) é temporária, mas se sobrepõe parcialmente à principal fase proliferativa. A purificação do gradiente de densidade é a espinha dorsal da maioria dos protocolos existentes para o isolamento de hepatócitos primários. Como a purificação do gradiente depende da densidade e do tamanho das células, ela separa as populações de hepatócitos não esteatóticos dos esteatóticos. Portanto, hepatócitos gordurosos muitas vezes são perdidos, produzindo frações de hepatócitos não representativas. 
O protocolo apresentado descreve um método fácil e confiável para o isolamento in vivo de hepatócitos regeneradores, independentemente de seu conteúdo lipídico. Hepatócitos de camundongos machos C57BL/6 são isolados 24-48 h após a hepatectomia por uma abordagem clássica de perfusão de colagenase em duas etapas. Uma bomba peristáltica padrão conduz as soluções aquecidas através da veia cava inferior cateterizada para o remanescente, usando uma técnica de perfusão retrógrada com saída pela veia porta. Os hepatócitos são dissociados pela colagenase para sua liberação da cápsula de Glisson. Após a lavagem e centrifugação cuidadosa, os hepatócitos podem ser usados para qualquer análise a jusante. Em conclusão, este trabalho descreve uma técnica simples e reprodutível para o isolamento de uma população representativa de hepatócitos regenerados após hepatectomia parcial em camundongos. O método também pode ajudar no estudo da doença hepática gordurosa.

O TRAS atinge o pico às 16 h após a hepatectomia e desaparece gradualmente 32-48 h após a hepatectomia padrão, mas persiste além de 48 h após a hepatectomia prolongada. Macroscopicamente, o TRAS é facilmente visível como uma tez pálida do remanescente hepático (Figura 1F) e pode ser observado em camundongos hepatectomizados entre 16 h e 48 h após a cirurgia.
O rendimento final estimado é de 10-15 × 10 6 hepatócitos após hepatectomia a 70%...

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Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

O objetivo geral deste protocolo é apresentar um método otimizado para o isolamento de hepatócitos em camundongos após hepatectomia parcial sem a necessidade de centrifugação por gradiente de densidade. Geralmente vemos uma grande porcentagem de hepatócitos carregados de lipídios durante a regeneração precoce. Os hepatócitos esteatóticos geralmente perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade devido à baixa densidade são mantidos com este protocolo.Para preparar o equipamento de perfusão, conecte uma cânula IUI de calibre 26 à extremidade de saída da tubulação usando um conector de bloqueio Luer. Em seguida, lave a tubulação e insira a extremidade de entrada do tubo no tubo tampão de perfusão pré-aquecido no banho de água. Prime-o com tampão de perfusão quente a uma velocidade de bomba de três mililitros por minuto.Antes de prosseguir com a cirurgia, certifique-se de que o rato está adequadamente anestesiado. Em seguida, limpe o abdômen com uma solução de esfoliação cirúrgica e etanol a 70%. Em seguida, corte as suturas para reabrir a incisão da linha média anteriormente feita para a hepatectomia parcial e puxe suavemente as bordas da ferida para longe.Se a hepatectomia tiver mais de 24 a 48 horas, retire a sutura e corte a pele com tesoura ou bisturi. Use um afastador ou clipes simples para manter o abdômen aberto. A cavidade abdominal deve ser exposta o máximo possível para otimizar o acesso e a visualização.Fixar uma sutura de polipropileno 5-0 no esterno. Puxe-o cranialmente e fixe-o nesta posição. Mova os intestinos para a direita usando cotonetes estéreis para revelar a veia porta e a veia cava.Use um pano úmido para reter os intestinos. Coloque um objeto pesado de aproximadamente dois centímetros de altura, como um anel de peso de metal adjacente às patas traseiras do mouse. Em seguida, coloque a tubulação com a cânula IUI de calibre 26 conectada no objeto e posicione a agulha cuidadosamente em cima da veia cava.Ajuste o comprimento da tubulação conforme necessário. Transfira a solução-mãe de colagenase para o tubo tampão de digestão pré-aquecido. Preparar 10 a 20 mililitros de tampão de digestão por animal.Ligue a bomba depois de ajustar a velocidade da bomba para três mililitros por minuto. Descarte os primeiros dois a três mililitros do tampão de perfusão pré-aquecido assim que o tampão atingir a agulha. Para realizar a canulação da veia cava inferior, use um cotonete estéril para puxar suavemente a veia cava caudalmente abaixo da punção, de modo que a tensão fornecida facilite a inserção da cânula na veia.Insira a cânula de IIU de calibre 26 em um ângulo raso na veia cava inferior abaixo do rim enquanto o tampão atravessa a agulha. Certifique-se de que o bisel da agulha aponte para cima. Procure sangue na câmara de flash do cateter quando a agulha entrar no lúmen.Avance a agulha mais dois a três milímetros para garantir que a ponta do cateter entre na veia. Deslize o cateter plástico sobre a agulha e na veia cava mais cinco milímetros. Retire a agulha lentamente e com muito cuidado.Após dois a três segundos, procure manchas brancas que se formam no fígado ou inchaço da veia porta, o que indica que o tampão de perfusão está fluindo através do fígado e entrando nos lóbulos hepáticos a partir da veia central. Espere que a veia porta inche visivelmente dentro de um a dois segundos de manchas brancas se formando na superfície do fígado. Corte a veia porta com uma tesoura o mais distalmente possível do hilo hepático.Aumente a taxa de fluxo para quatro a sete mililitros por minuto, dependendo do peso do animal, do tamanho do fígado e da extensão da hepatectomia inicial. Campe a veia porta com uma pinça ou um grampo vascular por sete a 10 segundos. Certifique-se de que nenhum fluido esteja passando.Realize um segundo grampo após aproximadamente 30 segundos e certifique-se de que o fígado incha e relaxa. Continue lavando o animal por três a quatro minutos e observe o tampão claro fluindo para fora da veia porta. Campe a veia porta por três a quatro segundos antes que o tampão de digestão atinja o fígado.Certifique-se de que o fígado relaxa após a liberação do grampo e que o fluido de perfusão permanece claro. Uma vez que o tampão de digestão atinge o fígado, prenda a veia porta mais uma vez. O fígado não deve relaxar após a liberação do clampeamento.Digerir por aproximadamente quatro minutos a uma taxa de fluxo de cinco mililitros por minuto. À medida que a digestão progride, procure sinais de que o fígado começa a inchar e pequenas seções transparentes na superfície do fígado. Observe que o fígado assume a textura de um pedaço de pano molhado e parece quase encharcado.Sonde a consistência tocando-a cuidadosamente com um cotonete úmido e estéril. Continue com a perfusão até que uma diferença marcante na textura da superfície do fígado possa ser observada. Observe que o fígado assume uma cor muito clara e uma aparência borbulhante, indicando a cápsula de Glisson se separando do parênquima.Pare a digestão assim que o fígado tiver adquirido essas propriedades. Remova a agulha antes que o ar entre no fígado. Segure o tecido conjuntivo central entre os lóbulos usando fórceps e levemente levante-o para cima usando-o como ponto de ancoragem.Corte todas as conexões do fígado para outros órgãos e remova a vesícula biliar. Remova o fígado suavemente da cavidade abdominal. Tenha cuidado, pois será frágil e frágil nesta fase.Coloque o fígado no tampão de preservação a frio. Transfira o fígado para uma placa de Petri de 10 centímetros e adicione 10 mililitros de Williams'Medium E.Break da cápsula de Glisson com pinças de ponta fina em alguns locais ao longo da superfície do fígado. Segure uma parte central com dois pares de pinças.Separe-os lentamente, permitindo que a cápsula se rasgue sem danificar os hepatócitos e libere as células agitando suavemente a cápsula. Filtre cinco mililitros de polpa hepática através de um filtro de células de 100 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Lave o filtro com 10 mililitros de meio gelado fresco e filtre os restantes cinco mililitros de polpa através do filtro celular.Gire o extrato a 50 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Aspirar a maior parte do sobrenadante, deixando um mililitro para ressuspender as células, girando suavemente o tubo. Adicione 40 mililitros de Williams'E Medium frio e repita o passo três vezes.Proceder ao isolamento dos hepatócitos conforme descrito no manuscrito do texto. Após 70% de hepatectomia em camundongos, o rendimento final dos hepatócitos foi de aproximadamente 10 a 15 x 10 até o 6º com viabilidade final média de 78%. Enquanto após a hepatectomia prolongada de 86%, o rendimento de hepatócitos foi de quatro a nove x 10 até o 6º com viabilidade média de 65%.Após hepatectomias parciais, os hepatócitos apresentam aumento do tamanho celular em relação aos fígados normais, correspondendo ao aumento do conteúdo lipídico. Observou-se aumento do conteúdo lipídico nos hepatócitos murinos 24 horas após a hepatectomia parcial, visto como aumento da granularidade ou diretamente observado pela presença de vesículas lipídicas no interior de hepatócitos aumentados. Usando o método clássico de purificação por gradiente de densidade, grandes hepatócitos gordurosos foram perdidos no sobrenadante e apenas hepatócitos menores magros são coletados na pelota celular.Com o protocolo melhorado, os hepatócitos preenchidos com lipídios não foram perdidos e todos os hepatócitos foram peletizados. O aperto repetitivo facilita o processo de lavagem. Com isso, o fígado é otimamente limpo dos componentes sanguíneos restantes que poderiam inibir as enzimas de digestão.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Medicina

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Avaliar as alterações na volátil Geral Anestésica Sensibilidade de Ratos após intervenção farmacológica local ou sistêmica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Intrasplenic transplante de hepatócitos após Hepatectomy parcial na NOD. Ratos SCID

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized transplante de fígado parcial de rato com na vivo orientado a embarcação 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplante de células-tronco derivadas de tecido adiposo folha para reduzir o vazamento após colectomia parcial em um modelo do rato

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

Oclusão da aorta total e parcial para o tratamento do choque hemorrágico em suínos

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...