Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Este estudio fue apoyado por el Fondo Nacional Suizo (subvención del proyecto 310030_189262).

Todos los experimentos con animales fueron de acuerdo con las Regulaciones Federales Alimentarias Suizas y aprobados por la Oficina Veterinaria de Zurich (n° 007/2017, 156/2019) asegurando el cuidado humano. Los ratones machos C57BL / 6 de 10 a 12 semanas se mantuvieron en un ciclo de día / noche de 12 h con acceso gratuito a alimentos y agua. Cada grupo experimental consistió de seis a ocho animales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos ...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

El protocolo publicado proporciona un método fiable y sencillo para aislar un alto rendimiento de hepatocitos murinos normales y esteatósicos para análisis descendentes unicelulares o análisis masivos de células después de la clasificación FACS. La clara ventaja sobre la purificación del gradiente de densidad es que el contenido de lípidos celulares no tiene esencialmente ningún impacto en el rendimiento efectivo de los hepatocitos. Por lo tanto, la fracción de hepatocitos esteatósicos se retendrá e incluir?...

El hígado puede regenerarse incluso después de una pérdida importante de tejido. Esta capacidad regenerativa única se ilustra explícitamente en el modelo experimental de hepatectomía parcial (70%), descrito por primera vez en ratas por Higgins y Anderson en 19311. En este modelo, el 70% del hígado se extirpa quirúrgicamente de los animales cortando lóbulos hepáticos más grandes. Los lóbulos restantes crecen a través de la hipertrofia compensatoria para restaurar la masa hepática original dentro de aproximadamente 1 semana después de la cirugía, aunque sin restauración de la arquitectura hepática original 2,3. Se han desarrollado hepatectomías adicionales con cantidades variables de extirpación de tejido, como la hepatectomía extendida al 86% donde el remanente hepático es demasiado pequeño para recuperarse, lo que finalmente conduce a insuficiencia hepática posthepatectomía (PHLF) y posterior muerte en 30% -50% de los animales 4,5,6. Estos modelos permiten estudiar la regeneración hepática normal y fallida, dependiendo de la cantidad de tejido resecado (Figura 1).
Aunque los modelos de hepatectomías en ratones se han utilizado con éxito durante muchos años, solo recientemente los métodos analíticos más avanzados han permitido una visión más profunda a nivel de una sola célula. Para la mayoría de estos métodos, sin embargo, la presencia de hepatocitos individuales es un requisito previo básico. La mayoría de los protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios se basan en una técnica de perfusión de colagenasa de dos pasos y la posterior purificación del gradiente de densidad para separar los hepatocitos viables de los desechos y no parenquimatosos, así como las células muertas 7,8,9. Este método fue descrito por primera vez por Berry y Friend en 196910 y adaptado por Seglen y colegas en 197211,12. Sin embargo, como la centrifugación por gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, los hepatocitos cargados de lípidos a menudo se pierden durante la purificación estándar. Si bien tal pérdida puede ser insignificante para muchas preguntas de investigación, es un aspecto crucial para la regeneración temprana del hígado. Durante los primeros 2 días, los hepatocitos dentro del hígado de ratón regenerador acumulan lípidos, creciendo así en tamaño y disminuyendo en densidad. Esta esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) sirve para proporcionar combustible regenerativo y es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal y se distribuye de manera desigual dentro de los lóbulos hepáticos, las unidades funcionales del hígado13,14. Sin embargo, después de una hepatectomía extendida del 86%, la TRAS también ocurre pero persiste, porque la regeneración está estancada y los lípidos no se oxidan14. Por lo tanto, la purificación por gradiente de los hepatocitos después de hepatectomías al 70% u 86% producirá fracciones no representativas, ya que la mayoría de los hepatocitos cargados de lípidos se pierden debido a su baja densidad15.
En este protocolo de aislamiento modificado, los hepatocitos de ratones C57BL / 6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Por lo general, la canulación y la perfusión del remanente para el aislamiento celular se realizan a través de la vena porta. Sin embargo, la resistencia portovascular en pequeños restos que quedan después de la resección mayor es alta16, y por lo tanto la perfusión es delicada. Debido a que la vena cava no se ve afectada por las hepatectomías, la perfusión se puede realizar fácilmente en la dirección retrógrada a través de la canulación de la vena cava . Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente hepático, utilizando perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta (Figura suplementaria S1). Los hepatocitos son disociados por colagenasas y liberados de la cápsula de Glisson. Después del lavado y el procesamiento cuidadoso de hepatocitos viables mediante aislamiento gradual utilizando un enfoque de centrifugación de baja velocidad, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

La hepatectomía parcial se ha utilizado ampliamente para investigar la regeneración hepática en ratones, pero el aislamiento de altos rendimientos de hepatocitos viables para aplicaciones de células individuales aguas abajo es un desafío. Se observa una marcada acumulación de lípidos dentro de los hepatocitos regeneradores durante los primeros 2 días de regeneración hepática normal en ratones. Esta llamada esteatosis asociada a la regeneración transitoria (TRAS) es temporal, pero se superpone parcialmente a la fase proliferativa principal. La purificación por gradiente de densidad es la columna vertebral de la mayoría de los protocolos existentes para el aislamiento de hepatocitos primarios. Como la purificación de gradiente depende de la densidad y el tamaño de las células, separa las poblaciones de hepatocitos no esteatósicos de las esteatósicas. Por lo tanto, los hepatocitos grasos a menudo se pierden, produciendo fracciones de hepatocitos no representativas. 
El protocolo presentado describe un método fácil y fiable para el aislamiento in vivo de hepatocitos regeneradores independientemente de su contenido lipídico. Los hepatocitos de ratones machos C57BL/6 se aíslan 24-48 h después de la hepatectomía mediante un enfoque clásico de perfusión de colagenasa de dos pasos. Una bomba peristáltica estándar impulsa las soluciones calentadas a través de la vena cava inferior cateterizada hacia el remanente, utilizando una técnica de perfusión retrógrada con flujo de salida a través de la vena porta. Los hepatocitos son disociados por la colagenasa para su liberación de la cápsula de Glisson. Después del lavado y la centrifugación cuidadosa, los hepatocitos se pueden usar para cualquier análisis posterior. En conclusión, este artículo describe una técnica sencilla y reproducible para el aislamiento de una población representativa de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones. El método también puede ayudar al estudio de la enfermedad del hígado graso.

El TRAS alcanza su punto máximo a las 16 h después de la hepatectomía y desaparece gradualmente 32-48 h después de la hepatectomía estándar, pero persiste más allá de 48 h después de la hepatectomía prolongada. Macroscópicamente, TRAS es fácilmente visible como una tez pálida del remanente hepático (Figura 1F) y se puede observar en ratones hepatectomizados entre 16 h y 48 h después de la cirugía.
El rendimiento final estimado es de 10-15 × 10 6 h...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Los hepatocitos cargados de lípidos son inherentes a la regeneración hepática, pero generalmente se pierden con la centrifugación por gradiente de densidad. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento celular optimizado que retiene hepatocitos esteatósicos, produciendo poblaciones representativas de hepatocitos regeneradores después de la hepatectomía parcial en ratones.

Aislamiento de hepatocitos regeneradores después de hepatectomía parcial en ratones

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

El objetivo general de este protocolo es presentar un método optimizado para el aislamiento de hepatocitos en ratones después de una hepatectomía parcial sin necesidad de centrifugación por gradiente de densidad. Por lo general, vemos un gran porcentaje de hepatocitos cargados de lípidos durante la regeneración temprana. Los hepatocitos esteatósicos que generalmente se pierden en la centrifugación del gradiente de densidad debido a la baja densidad se conservan con este protocolo.Para preparar el equipo de perfusión, conecte una cánula IUI de calibre 26 al extremo de salida del tubo mediante un conector de bloqueo Luer. Luego enjuague el tubo e inserte el extremo de entrada del tubo en el tubo tampón de perfusión precalentado en el baño de agua. Prepárelo con tampón de perfusión caliente a una velocidad de bombeo de tres mililitros por minuto.Antes de proceder con la cirugía, asegúrese de que el ratón esté adecuadamente anestesiado. Luego limpie el abdomen con una solución exfoliante quirúrgica y etanol al 70%. Luego corte las suturas para volver a abrir la incisión de la línea media previamente hecha para la hepatectomía parcial y separe suavemente los bordes de la herida.Si la hepatectomía tiene más de 24 a 48 horas, retire la sutura y corte la piel con tijeras o un bisturí. Use un retractor o clips simples para mantener el abdomen abierto. La cavidad abdominal debe estar expuesta tanto como sea posible para optimizar el acceso y la visualización.Fije una sutura de polipropileno 5-0 al esternón. Tire de él cranealmente y fíjelo en esta posición. Mueva los intestinos hacia la derecha usando hisopos de algodón estériles para revelar la vena porta y la vena cava.Use un paño húmedo para retener los intestinos. Coloque un objeto pesado de aproximadamente dos centímetros de altura, como un anillo de peso de metal, adyacente a las patas traseras del ratón. Luego coloque el tubo con la cánula IUI de calibre 26 conectada sobre el objeto y coloque la aguja cuidadosamente sobre la vena cava.Ajuste la longitud del tubo según sea necesario. Transfiera la solución madre de colagenasa al tubo tampón de digestión precalentado. Prepare de 10 a 20 mililitros de tampón de digestión por animal.Encienda la bomba después de ajustar la velocidad de la bomba a tres mililitros por minuto. Deseche los primeros dos o tres mililitros del tampón de perfusión precalentado una vez que el tampón llegue a la aguja. Para realizar la canulación de la vena cava inferior, utilice un hisopo de algodón estéril para tirar suavemente de la vena cava caudalmente por debajo de la punción para que la tensión proporcionada facilite la inserción de la cánula en la vena.Inserte la cánula de IIU de calibre 26 en un ángulo poco profundo en la vena cava inferior debajo del riñón mientras el tampón pasa a través de la aguja. Asegúrese de que el bisel de la aguja apunte hacia arriba. Busque sangre en la cámara de destello del catéter cuando la aguja entre en la luz.Avance la aguja dos o tres milímetros adicionales para asegurarse de que la punta del catéter entre en la vena. Deslice el catéter de plástico sobre la aguja y dentro de la vena cava otros cinco milímetros. Retire la aguja lentamente y con mucho cuidado.Después de dos o tres segundos, busque manchas blancas que se forman en el hígado o hinchazón de la vena porta, lo que indica que el tampón de perfusión fluye a través del hígado y entra en los lóbulos hepáticos desde la vena central. Espere a que la vena porta se hinche visiblemente dentro de uno o dos segundos de la formación de manchas blancas en la superficie del hígado. Corte la vena porta con tijeras lo más distalmente posible del hilio hepático.Aumente la tasa de flujo de cuatro a siete mililitros por minuto dependiendo del peso del animal, el tamaño del hígado y la extensión de la hepatectomía inicial. Pinza la vena porta con pinzas o una pinza vascular durante siete a 10 segundos. Asegúrese de que no esté pasando líquido.Realice una segunda pinza después de aproximadamente 30 segundos y asegúrese de que el hígado se hinche y se relaje. Continúe enjuagando al animal durante tres o cuatro minutos y observe el tampón claro que fluye fuera de la vena porta. Sujete la vena porta durante tres o cuatro segundos antes de que el tampón de digestión llegue al hígado.Asegúrese de que el hígado se relaje al liberar la pinza y que el líquido de perfusión permanezca limpio. Una vez que el tampón de digestión llegue al hígado, sujete la vena porta una vez más. El hígado no debe relajarse después de la liberación del pinzamiento.Digiera durante aproximadamente cuatro minutos a un caudal de cinco mililitros por minuto. A medida que avanza la digestión, busque signos de que el hígado comienza a hincharse y pequeñas secciones transparentes en la superficie del hígado. Observe que el hígado adquiere la textura de un trozo de tela mojado y parece casi empapado.Pruebe la consistencia tocándola cuidadosamente con un hisopo de algodón húmedo y estéril. Continuar con la perfusión hasta que se pueda observar una marcada diferencia en la textura superficial del hígado. Observe que el hígado asume un color muy claro y una apariencia burbujeante que indica la cápsula de Glisson que se separa del parénquima.Detenga la digestión tan pronto como el hígado haya adquirido estas propiedades. Retire la aguja antes de que el aire entre en el hígado. Agarre el tejido conectivo central entre los lóbulos con fórceps y levántelo ligeramente hacia arriba usándolo como punto de anclaje.Cortar todas las conexiones del hígado a otros órganos y extirpar la vesícula biliar. Retire el hígado suavemente de la cavidad abdominal. Tenga cuidado, ya que será endeble y frágil en esta etapa.Coloque el hígado en el tampón de conservación del hielo frío. Transfiera el hígado a una placa de Petri de 10 centímetros y agregue 10 mililitros de Williams'Medium E.Break la cápsula de Glisson helada con pinzas de punta fina en algunos lugares a lo largo de la superficie del hígado. Agarra una parte central con dos pares de pinzas.Separa lentamente, permitiendo que la cápsula se desgarre sin dañar los hepatocitos y libera las células agitando suavemente la cápsula. Filtre cinco mililitros de pulpa hepática a través de un filtro celular de 100 micrómetros en un tubo de 50 mililitros. Enjuague el filtro con 10 mililitros de medio fresco helado y filtre los cinco mililitros restantes de pulpa a través del colador celular.Girar el extracto a 50 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Aspire la mayor parte del sobrenadante, dejando un mililitro para resuspender las células girando suavemente el tubo. Agregue 40 mililitros de Williams'E Medium frío y repita el paso tres veces.Proceder con el aislamiento de los hepatocitos como se describe en el texto manuscrito. Después de una hepatectomía al 70% en ratones, el rendimiento final de hepatocitos fue de aproximadamente 10 a 15 x 10 hasta el 6º con una viabilidad final media del 78%. Mientras que después de una hepatectomía extendida del 86%, el rendimiento de hepatocitos fue de cuatro a nueve x 10 hasta el 6º con una viabilidad media del 65%.Después de las hepatectomías parciales, los hepatocitos muestran un aumento del tamaño celular en comparación con los hígados normales que corresponde a un mayor contenido de lípidos. Se observó un aumento del contenido de lípidos en hepatocitos murinos 24 horas después de la hepatectomía parcial, visto como un aumento en la granularidad u observado directamente por la presencia de vesículas lipídicas dentro de los hepatocitos agrandados. Mientras se usaba el método clásico de purificación de gradiente de densidad, los hepatocitos grasos grandes se perdieron en el sobrenadante y solo se recolectaron hepatocitos magros más pequeños en el pellet celular.Con el protocolo mejorado, los hepatocitos llenos de lípidos no se perdieron y todos los hepatocitos se granularon. La sujeción repetitiva facilita el proceso de lavado. Con eso, el hígado se limpia de manera óptima de los componentes sanguíneos restantes que podrían inhibir las enzimas de digestión.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Un modelo de Disturbed inducida por el flujo de Aterosclerosis en la arteria carótida del ratón por la ligadura parcial y un método sencillo para el aislamiento de ARN del endotelio carótida

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Investigación

Medicina

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

La evaluación de cambios en la volátil Anestésico general La sensibilidad de los ratones después de la intervención farmacológica local o sistémica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Volver a arterializada rata parcial trasplante del hígado con una en vivo orientada al barco 70% hepatectomía

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Trasplante de células madre derivadas de tejido adiposo hoja para reducir fugas después de colectomía parcial en un modelo de rata

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

Completa y parcial obstrucción aórtica para el tratamiento del choque hemorrágico en cerdos

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Aislamiento de hepatocitos primario de ratón para proteína naciente síntesis análisis por el método de etiquetado no radiactivo L-azidohomoalanine

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Terapia del Gene mediada por vectores lentivirales de hepatocitos Ex Vivo para trasplante autólogo en cerdos

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...