Name: isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Denna studie stöddes av Swiss National Fond (projektbidrag 310030_189262).

Alla djurförsök var i enlighet med schweiziska federala djurförordningar och godkända av veterinärkontoret i Zürich (nr 007/2017, 156/2019) som garanterar mänsklig vård. Manliga C57BL / 6-möss i åldern 10-12 veckor hölls på en 12 h dag / natt cykel med fri tillgång till mat och vatten. Varje försöksgrupp bestod av sex till åtta djur. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, utrustning och reagenser som används i detta protokoll.
1...

<ol>
	<li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal.">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+from+myth+to+mechanism.">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li><li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+hepatectomy+in+mice.">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 81-88 (2015).</li><li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration.">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice.">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li><li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liver Pathology. , (2019).</li><li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation.">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).</li><li>Smedsr&#248;d, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence.">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li><li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Aff&#242;, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers.">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2++on+enzymatic+dispersion+of+isolated,+perfused+liver.">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy.">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li><li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN+down-regulation+promotes+&#946;-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice.">PTEN down-regulation promotes &#946;-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li><li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease.">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).</li><li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+(HABR)+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation.">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).</li><li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse.">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li><li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2/3+partial+hepatectomy+in+mice.">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li><li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration.">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li><li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver.">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li><li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation.">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li><li>Roche, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liberase TM Research Grade. , (2020).</li><li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes,+which+inhibits+viral+replication.">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li><li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes.">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li><li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+failure+following+partial+hepatectomy.">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li><li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles.">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li><li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar-sweetened+beverage,+diet+soda,+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years:+the+Framingham+Heart+Study.">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li><li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma:+a+problem+of+growing+magnitude.">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li><li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+body+weight+and+metabolic+(dysfunction)-associated+fatty+liver+disease+(MAFLD).">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li></ol>

Det publicerade protokollet ger en tillförlitlig och enkel metod för att isolera ett högt utbyte av normala och steatotiska murina hepatocyter för encellsanalyser nedströms eller bulkanalys av celler efter FACS-sortering. Den distinkta fördelen jämfört med densitetsgradientrening är att det cellulära lipidinnehållet i huvudsak inte har någon inverkan på det effektiva utbytet av hepatocyter. Således kommer fraktionen av steatotiska hepatocyter att behållas och inkluderas i nedströmsanalyser. Detta är inte...

Levern kan regenerera sig även efter större vävnadsförlust. Denna unika regenerativa kapacitet illustreras uttryckligen av den experimentella modellen för partiell (70%) hepatektomi, som först beskrevs hos råttor av Higgins och Anderson 19311. I denna modell avlägsnas 70% av levern kirurgiskt från djur genom att klippa av större leverlober. De återstående loberna växer sedan genom kompensatorisk hypertrofi för att återställa den ursprungliga levermassan inom cirka 1 vecka efter operationen, om än utan återställande av den ursprungliga leverarkitekturen 2,3. Ytterligare hepatektomier med varierande mängder vävnadsavlägsnande har utvecklats, såsom 86%-förlängd hepatektomi där leverresterna är för små för att återhämta sig, vilket så småningom leder till posthepatektomi leversvikt (PHLF) och efterföljande död hos 30% -50% av djuren 4,5,6. Dessa modeller möjliggör studier av normal och misslyckad leverregenerering, beroende på mängden resekterad vävnad (figur 1).
Även om musmodeller av hepatektomi har använts framgångsrikt i många år, har först nyligen mer avancerade analysmetoder möjliggjort en djupare insikt på encellsnivå. För de flesta av dessa metoder är emellertid närvaron av enskilda hepatocyter en grundläggande förutsättning. De flesta protokoll för isolering av primära hepatocyter är baserade på en tvåstegs kollagenasperfusionsteknik och efterföljande densitetsgradientrening för att separera livskraftiga hepatocyter från skräp och icke-parenkymala, såväl som döda celler 7,8,9. Denna metod beskrevs först av Berry and Friend 196910 och anpassades av Seglen och kollegor 197211,12. Men eftersom gradientcentrifugering är beroende av cellernas densitet och storlek, förloras lipidbelastade hepatocyter ofta under standardrening. Även om sådan förlust kan vara försumbar för många forskningsfrågor, är det en avgörande aspekt för tidig leverregenerering. Under de första 2 dagarna ackumulerar hepatocyter i den regenererande musleveren lipider och växer därmed i storlek och doppar i densitet. Denna övergående regenereringsassocierade steatos (TRAS) tjänar till att ge regenerativt bränsle och är tillfällig, men överlappar delvis den stora proliferativa fasen och är ojämnt fördelad inom leverlobulerna - de funktionella enheterna i levern13,14. Efter förlängd 86%-hepatektomi förekommer emellertid TRAS också men kvarstår, eftersom regenereringen stoppas och lipider oxiderasinte 14. Därför kommer gradientrening av hepatocyter efter 70%- eller 86%-hepatektomier att ge icke-representativa fraktioner, eftersom de flesta lipidbelastade hepatocyter går förlorade på grund av deras låga densitet15.
I detta modifierade isoleringsprotokoll isoleras hepatocyter från C57BL / 6-möss 24-48 timmar efter hepatektomi genom en klassisk tvåstegs kollagenasperfusionsmetod. Vanligtvis görs kanylering och perfusion av resterna för cellisolering via portalvenen. Det portovaskulära motståndet i små rester kvar efter större resektion är dock högt16, och perfusion är därför känslig. Eftersom vena cava förblir opåverkad av hepatektomier, kan perfusion enkelt utföras i retrograd riktning via kanylering av vena cava. En standard peristaltisk pump driver de uppvärmda lösningarna via den kateteriserade underlägsna vena cava in i leverresten, med retrograd perfusion med utflöde genom portalvenen (kompletterande figur S1). Hepatocyter dissocieras av kollagenaser och frigörs från Glissons kapsel. Efter tvättning och noggrann bearbetning av livskraftiga hepatocyter genom stegvis isolering med hjälp av en låghastighetscentrifugeringsmetod kan hepatocyterna användas för alla nedströmsanalyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Zombie green</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423111</td>
			<td>Amine-reactive viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td>
			<td>Provet AG</td>
			<td>QN01AB06</td>
			<td>CAUTION: needs ventilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008-100ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001229</td>
			<td>Dilute with water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A5256701</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9269-6x600ML</td>
			<td>For digestion/preservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6648-6x500ML</td>
			<td>For perfusion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264-100ML-F</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate)</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>1050052</td>
			<td>For stabilization of cannulation site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 Staining Dye Solution</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228550</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Lyophilized collagenases I/II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>123</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paralube Vet Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>17033-211-38</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1286301</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan IV &#8211; Lipid staining</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V001423</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Indivior Europe Ltd.</td>
			<td>345928</td>
			<td>Narcotics. Store securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Williams&#8217; Medium E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4128-500ML</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL serological pipette, Greiner Cellstar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P7865</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tubes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>391349</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper, rotating blade width 25 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99004</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer 100 &#181;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenestrated sterile surgical drape</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Reusable cloth material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm)</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>FILLINGNOZZLE#16</td>
			<td>To go into the tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes, 5 mL</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>LM41</td>
			<td>Connection tube to syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 96 x 21 mm</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8614H</td>
			<td>To retract the sternum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 6-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8695H</td>
			<td>For skin suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolene 8-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>EH7470E</td>
			<td>Ligature gall bladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm</td>
			<td>Drifton</td>
			<td>SC0374T</td>
			<td>Perfusion tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isis rodent shaver</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT421</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluran station</td>
			<td>Provet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed centrifuge &#8211; Scanspeed 416</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer-improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen concentrator &#8211; EverFlo</td>
			<td>Philips&#160;</td>
			<td>1020007</td>
			<td>0 &#8211; 5 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy &#8211; Pipettor Turbo-Fix</td>
			<td>TPP</td>
			<td>94700</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shenchen perfusion pump &#8211; YZ1515x</td>
			<td>Shenchen</td>
			<td>YZ1515x</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope &#8211; SZX9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoLux warming mat</td>
			<td>Thermo Lux</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>7-0092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath &#8211; Precision GP 02</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjust to 42 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice

Partiell hepatektomi har använts i stor utsträckning för att undersöka leverregenerering hos möss, men isoleringen av höga utbyten av livskraftiga hepatocyter för nedströms encellsapplikationer är utmanande. En markant ackumulering av lipider inom regenererande hepatocyter observeras under de första 2 dagarna av normal leverregenerering hos möss. Denna så kallade övergående regenereringsassocierade steatos (TRAS) är tillfällig men överlappar delvis den stora proliferativa fasen. Densitetsgradientrening är ryggraden i de flesta befintliga protokoll för isolering av primära hepatocyter. Eftersom gradientrening är beroende av cellernas densitet och storlek, separerar den icke-steatotiska från steatotiska hepatocytpopulationer. Därför förloras ofta feta hepatocyter, vilket ger icke-representativa hepatocytfraktioner. 
Det presenterade protokollet beskriver en enkel och tillförlitlig metod för in vivo-isolering av regenererande hepatocyter oavsett deras lipidinnehåll. Hepatocyter från manliga C57BL / 6-möss isoleras 24-48 timmar efter hepatektomi genom en klassisk tvåstegs kollagenasperfusionsmetod. En standard peristaltisk pump driver de uppvärmda lösningarna via den kateteriserade underlägsna vena cava in i resten, med hjälp av en retrograd perfusionsteknik med utflöde genom portalvenen. Hepatocyter dissocieras av kollagenas för deras frisättning från Glissons kapsel. Efter tvättning och noggrann centrifugering kan hepatocyterna användas för alla nedströmsanalyser. Sammanfattningsvis beskriver detta dokument en enkel och reproducerbar teknik för isolering av en representativ population av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss. Metoden kan också hjälpa till att studera fettlever.

TRAS når sin topp vid 16 timmar efter hepatektomi och försvinner gradvis 32-48 timmar efter standardhepatektomi, men kvarstår efter 48 timmar efter förlängd hepatektomi. Makroskopiskt är TRAS lätt synlig som en blek hy av leverrester (figur 1F) och kan observeras hos hepatektomerade möss mellan 16 timmar och 48 timmar efter operationen.
Den uppskattade slutliga avkastningen är 10-15 × 10 6 hepatocyter efter 70% -hepatektomi och 4-9 × 106 efte...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice at JoVE.com

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Lipidbelastade hepatocyter är inneboende för leverregenerering men förloras vanligtvis vid densitetsgradientcentrifugering. Här presenterar vi ett optimerat cellisoleringsprotokoll som behåller steatotiska hepatocyter, vilket ger representativa populationer av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss.

Isolering av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Det övergripande målet med detta protokoll är att presentera en optimerad metod för hepatocytisolering hos möss efter partiell hepatektomi utan behov av densitetsgradientcentrifugering. Vi ser vanligtvis en stor andel lipidbelastade hepatocyter under tidig regenerering. De steatotiska hepatocyter som vanligtvis förloras vid densitetsgradientcentrifugering på grund av den låga densiteten behålls med detta protokoll.För att förbereda perfusionsutrustningen, anslut en 26 gauge IUI-kanyl till slangens utloppsände med en Luer-låskontakt. Spola sedan slangen och sätt in rörets inloppsände i det förvärmda perfusionsbuffertröret i vattenbadet. Fyll den med varm perfusionsbuffert med en pumphastighet på tre milliliter per minut.Innan du fortsätter med operationen, se till att musen är tillräckligt bedövad. Rengör sedan buken med en kirurgisk skrubblösning och 70% etanol. Skär sedan suturerna för att öppna mittlinjesnittet som tidigare gjorts för partiell hepatektomi och dra försiktigt sårkanterna isär.Om hepatektomi är äldre än 24 till 48 timmar, ta bort suturen och skär huden med sax eller skalpell. Använd en retractor eller enkla klämmor för att hålla buken öppen. Bukhålan bör exponeras så mycket som möjligt för att optimera åtkomst och visualisering.Fixa en 5-0 polypropensutur till bröstbenet. Dra det kraniellt och fixa det i det här läget. Flytta tarmarna till höger med sterila bomullspinnar för att avslöja portvenen och vena cava.Använd en våt trasa för att behålla tarmarna. Placera ett tungt föremål med ungefär två centimeter höjd, till exempel en metallviktring intill musens bakben. Placera sedan slangen med den anslutna 26 gauge IUI-kanylen på föremålet och placera nålen försiktigt ovanpå vena cava.Justera slangens längd efter behov. Överför kollagenasstamlösningen till det förvärmda rötningsbuffertröret. Förbered 10 till 20 ml matsmältningsbuffert per djur.Slå på pumpen efter justering av pumphastigheten till tre milliliter per minut. Kassera de första två till tre milliliterna av den förvärmda perfusionsbufferten när bufferten når nålen. För att utföra kanylering av den underlägsna vena cava, använd en steril bomullspinne för att försiktigt dra vena cava caudalt under punkteringen så att den medföljande spänningen underlättar införandet av kanylen i venen.För in 26 gauge IUI-kanylen i en grund vinkel i den nedre vena cava under njuren medan bufferten löper genom nålen. Se till att nålavfasningen pekar uppåt. Leta efter blod i kateterns blixtkammare när nålen kommer in i lumen.För nålen ytterligare två till tre millimeter framåt för att säkerställa att kateterns spets kommer in i venen. Skjut plastkatetern över nålen och in i vena cava ytterligare fem millimeter. Ta bort nålen långsamt och mycket försiktigt.Efter två till tre sekunder, leta efter vita fläckar som bildas i levern eller svullnad i portalvenen, vilket indikerar att perfusionsbufferten strömmar genom levern och kommer in i leverlobulerna från den centrala venen. Vänta tills portalvenen sväller synligt inom en till två sekunder efter att vita fläckar bildas på leverytan. Klipp portalvenen med sax så distalt som möjligt från leverhilusen.Öka flödeshastigheten till fyra till sju milliliter per minut beroende på djurets vikt, leverstorlek och omfattningen av den initiala hepatektomi. Kläm fast portalvenen med pincett eller en vaskulär klämma i sju till 10 sekunder. Se till att ingen vätska passerar igenom.Utför en andra klämma efter cirka 30 sekunder och se till att levern sväller och slappnar av. Fortsätt spola djuret i tre till fyra minuter och observera den klara bufferten som strömmar ut ur portvenen. Kläm fast portalvenen i tre till fyra sekunder innan matsmältningsbufferten når levern.Se till att levern slappnar av när klämman släpps och att perfusionsvätskan förblir klar. När matsmältningsbufferten når levern, kläm fast portalvenen igen. Levern ska inte slappna av efter att klämman släppts.Smält i cirka fyra minuter med en flödeshastighet av fem milliliter per minut. När matsmältningen fortskrider, leta efter tecken på levern börjar svälla och små genomskinliga sektioner på ytan av levern. Observera att levern tar på sig strukturen av en våt bit tyg och verkar nästan fuktig.Sondra konsistensen genom att försiktigt röra den med en fuktig, steril bomullspinne. Fortsätt med perfusionen tills en markant skillnad i leverns ytstruktur kan observeras. Observera att levern antar en mycket ljus färg och ett bubbligt utseende som indikerar Glissons kapsel som skiljer sig från parenkymen.Stoppa matsmältningen så snart levern har förvärvat dessa egenskaper. Ta bort nålen innan luften kommer in i levern. Ta tag i den centrala bindväven mellan loberna med pincett och lyft den något uppåt med den som en förankringspunkt.Skär alla anslutningar i levern till andra organ och ta bort gallblåsan. Ta bort levern försiktigt från bukhålan. Var försiktig eftersom det blir tunt och ömtåligt i detta skede.Placera levern i den iskalla konserveringsbufferten. Överför levern till en 10 centimeter petriskål och tillsätt 10 ml iskall Williams'Medium E.Rupture glissons kapsel med pincett med fin spetspincett på några ställen längs leverytan. Ta tag i en central del med två par pincett.Dra dem långsamt isär, låt kapseln riva utan att skada hepatocyterna och släpp cellerna genom att försiktigt skaka kapseln. Filtrera fem milliliter levermassa genom en 100 mikrometer cellsil i ett 50 ml rör. Skölj filtret med 10 ml färskt iskallt medium och filtrera de återstående fem milliliter massa genom cellsilen.Snurra extraktet vid 50 G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera det mesta av supernatanten och lämna en milliliter för att resuspendera cellerna genom att försiktigt virvla röret. Tillsätt 40 ml kall Williams'E Medium och upprepa steget tre gånger.Fortsätt med isoleringen av hepatocyter som beskrivs i textmanuskriptet. Efter 70 % hepatektomi hos möss var det slutliga utbytet av hepatocyter cirka 10 till 15 x 10 till 6:e med 78 % genomsnittlig slutlig viabilitet. Medan efter förlängd 86% hepatektomi var hepatocytutbytet fyra till nio x 10 till 6: e med 65% genomsnittlig livskraft.Efter partiell hepatektomi uppvisar hepatocyter en ökad cellstorlek jämfört med normala lever motsvarande ökat lipidinnehåll. Ökat lipidinnehåll observerades hos murina hepatocyter 24 timmar efter partiell hepatektomi, sett som en ökning av granulariteten eller direkt observerat genom närvaron av lipidvesiklar inuti förstorade hepatocyter. Vid användning av den klassiska reningsmetoden för densitetsgradient förlorades stora feta hepatocyter i supernatanten och endast mindre magra hepatocyter samlas in i cellpelleten.Med det förbättrade protokollet förlorades inte de lipidfyllda hepatocyterna och alla hepatocyter pelleterades. Den repetitiva fastspänningen underlättar spolningsprocessen. Med det rensas levern optimalt från återstående blodkomponenter som kan hämma matsmältningsenzymerna.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

En modell av Disturbed Flow-Induced ateroskleros hos mus Carotid Artery genom partiell Ligation och en enkel metod för RNA Isolering från Carotid endotelet

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

Bedöma Förändringar i Volatile narkos Känslighet av möss efter lokal eller systemisk farmakologisk intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisering av Vascular och parenkymal Regeneration efter 70% partiell hepatektomi hos normala möss

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

Intrasplenic Transplantation av hepatocyter efter partiell Hepatectomy i NOD. SCID möss

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re Arterialized råtta delvis lever Transplantation med i vivo fartyget-orienterade 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation av fettvävnad-Derived stamceller blad att minska läckage efter partiell kolektomi i en råtta modell

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Complete and Partial Aortic Occlusion for the Treatment of Hemorrhagic Shock in Swine

Fullständig och partiell aorta ocklusion för behandling av hemorragisk chock hos svin

Hemorrhage remains the leading cause of preventable deaths in trauma. Endovascular management of non-compressible torso hemorrhage has been at the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Isolering av primära mus hepatocyter för begynnande proteinsyntes analys av icke-radioaktiva L-azidohomoalanine märkning metoden

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Lentiviral Vector-medierad genterapi av hepatocyter Ex Vivo för autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...