Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

يشكر المؤلفون المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية على دعم هذا العمل. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 82260422).

تم جمع أنسجة سرطان الكبد البشري من المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالأورام الخبيثة الكبدية في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبية. وقع جميع المرضى على نموذج موافقة مستنيرة ، وتمت الموافقة على جمع عينات الأنسجة البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة جنان الطبي...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الكبد. يتم الحصول على sEVs عالية الجودة عن طريق عزل الأنسجة الحادة ، والعلاج بالإنزيمات الهضمية ، والطرد المركزي التفاضلي ، وترشيح وتنقية غشاء المرشح 0.22 ميكرومتر. بالنسبة لتحليل المصب ، من المهم للغاية ضمان النقاء العالي للم...

يبلغ قطر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) حوالي 30 نانومتر إلى 150 نانومتر وتفرزها خلايا مختلفة1. يمكنهم التواصل مع خلايا الأنسجة وتنظيم البيئة المكروية المحلية أو البعيدة عن طريق نقل جزيئات بيولوجية مهمة مثل الدهون والبروتينات والحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى مختلف الأعضاء والأنسجة والخلايا والأجزاء داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكنهم أيضا تغيير سلوك الخلايا المتلقية 2,3. يعد عزل وتنقية sEVs المحددة شرطا أساسيا لدراسة سلوكها البيولوجي أثناء تطور المرض ومساره. يستخدم الطرد المركزي التفاضلي - الذي يعتبر المعيار الذهبي - بشكل شائع لفصل sEVs عن الأنسجة التي يقيمون فيها عادة4. يمكن إزالة حطام الأنسجة وحطام الخلايا والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج بواسطة هذه التقنية ، مع ترك sEVs فقط.
لقد ثبت أن كولاجيناز D و DNase I لا يؤثران على الخصائص الجزيئية للخلايا أو الحويصلات ، حيث تساهم خصائص كلا الإنزيمين في إطلاق الحويصلات في المصفوفة خارج الخلية 5. تم استخدام هذه الإنزيمات لاستخراج sEVs من أنسجة سرطان الجلد النقيلي البشري ، وأنسجة سرطان القولون ، والأنسجة المخاطية القولونية5،6،7. ومع ذلك ، فإن تركيز ووقت هضم كولاجيناز D و DNase I في هذه الطرق يختلفان ، مما يؤدي إلى استنتاجات غير متسقة. لتجنب الترسيب المشترك لأنواع فرعية أخرى من sEVs ، قام الباحثون بإزالة حويصلات أكبر خارج الخلية (قطرها 0.1 ميكرومتر أو 0.2 ميكرومتر) عن طريق الترشيح و / أو الطرد المركزي التفاضلي8. اعتمادا على الأنسجة المصدر ، قد تكون هناك حاجة إلى طرق مختلفة للعزل والتنقية 9,10.
يؤدي استخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي التقليدي لاستخراج sEVs من أنسجة الكبد إلى طبقة من المادة البيضاء على سطح المادة الطافية ، دون أي طريقة لتحديد خصائصها. في دراسة سابقة11 ، وجد أن هذه الطبقة من المادة البيضاء تؤثر على نقاء sEVs. على الرغم من أن عدد الجسيمات وتركيز البروتين للعينات المعزولة بالطريقة التقليدية كانا أعلى من تلك الموجودة في الطريقة الحالية ، إلا أن معامل الاختلاف كان كبيرا ، ربما لأن العديد من الملوثات يمكن أن تؤدي إلى ضعف تكرار النتائج. أي باستخدام المنظفات (أي اكتشاف قابلية ذوبان الجسيمات في 1٪ Triton X-100) ، وجدنا أن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة كان أكبر. ومن ثم ، فإننا نستخدم هذه الطريقة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان القولون والمستقيم للبحث البروتيني.
في الوقت الحاضر ، تركز الأبحاث حول sEVs في سرطان الكبد بشكل أساسي على المصل والبلازما والمادة الطافية لثقافة الخلايا12،13،14. ومع ذلك ، يمكن أن تعكس sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بشكل أكثر دقة علم الأمراض الفسيولوجية والبيئة المكروية المحيطة بسرطان الكبد وتتجنب بشكل فعال تدهور وتلوث المركبات الكهربائية الأخرى15,16. مع استخدام الطرد المركزي التفاضلي ، يمكن لهذه الطريقة إثراء الغلة والحصول على sEVs عالية الجودة ، مما يوفر أساسا مهما لمزيد من الدراسة لسرطان الكبد. تتيح هذه الطريقة فصل أنسجة سرطان الكبد عن طريق الفصل الحاد وفصلها عن طريق كولاجيناز D و DNase I. بعد ذلك ، تتم إزالة الحطام الخلوي والحويصلات الكبيرة والأجسام المبرمج عن طريق الترشيح والطرد المركزي التفاضلي. أخيرا ، يتم عزل sEVs وتنقيتها للدراسات اللاحقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

يمكن أن تعكس الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) المشتقة من الأنسجة الحالة الوظيفية للخلايا المصدر وخصائص الفضاء الخلالي للنسيج. يعد الإثراء الفعال لهذه المركبات الكهربائية شرطا أساسيا مهما لدراسة وظيفتها البيولوجية ومفتاحا لتطوير تقنيات الكشف السريري وتكنولوجيا الناقل العلاجي. من الصعب عزل sEVs عن الأنسجة لأنها عادة ما تكون ملوثة بشدة. توفر هذه الدراسة طريقة للإثراء السريع ل sEVs عالية الجودة من أنسجة سرطان الكبد. تتضمن الطريقة عملية من أربع خطوات: حضانة الإنزيمات الهاضمة (كولاجيناز D و DNase Ι) بالأنسجة ، والترشيح من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر. نظرا لتحسين خطوة الطرد المركزي التفاضلي وإضافة خطوة ترشيح ، فإن نقاء sEVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة أعلى من تلك التي حققها الطرد المركزي التفاضلي الكلاسيكي. يوفر منهجية مهمة وبيانات داعمة لدراسة sEVs المشتقة من الأنسجة.

لعبت sEVs من أنسجة سرطان الكبد البشرية دورا حاسما في تشخيص وعلاج وتشخيص مرضى سرطان الكبد. استخدمت هذه الطريقة أدوات مخبرية شائعة لعزل وتنقية sEVs المشتقة من أنسجة سرطان الكبد. قد يوفر هذا دعما منهجيا لدراسة المركبات الكهربائية السريعة. يوضح الشكل 2 العملية العامة لإثراء sEVs من ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

هنا نصف إثراء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد من خلال طريقة الطرد المركزي التفاضلي الأمثل.

طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

تسمح هذه الطريقة بعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد بنقاوة أعلى من تلك التي تحققها الطرد المركزي الكلاسيكي التفاضلي. هذه التقنية بسيطة ومريحة وسهلة التشغيل ، والتي يمكن أن توفر الدعم المنهجي لدراسة الحويصلات الصغيرة خارج الخلية. للبدء ، قم بإزالة عينة الأنسجة من الفريزر 80 درجة مئوية.ضع ما يقرب من 400 ملليغرام من الأنسجة في طبق زراعة الخلايا 10 سم على صندوق الثلج ، وفرم الأنسجة جيدا بمشرط. نقل الأنسجة إلى لوحة ستة آبار مع 1.5 ملليلتر من محلول الجهاز الهضمي. بعد ذلك ، ضع اللوحة على شاكر إزالة اللون ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة للتفكك الكامل لأنسجة سرطان الكبد وإطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية ، أو sEVs.بعد الحضانة ، ضع صفيحة الآبار الستة على صندوق الثلج. أضف 80 ميكرولترا من مثبطات الفوسفاتيز و 200 ميكرولتر من محلول مثبطات الأنزيم البروتيني الكامل لإيقاف عملية الهضم. بعد ذلك ، انقل محلول الهضم إلى مصفاة خلية 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب طرد مركزي سعة 2 ملليلتر ، وقم بترشيحه ببطء لإزالة أي حطام كبير للأنسجة.أجهزة الطرد المركزي الترشيح في 500 غرام لمدة 10 دقائق لإزالة حطام الأنسجة الصغيرة ، وجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي جديد 2 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي طاف في 3،000 غرام لمدة 20 دقيقة لإزالة حطام الخلية. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد حتى يوشك طرف الماصة على لمس الحطام الأبيض في الأسفل.بعد تكرار الطرد المركزي للسائل المتبقي ، قم بتجميع المادة الطافية في الأنبوب دون إزعاج الحطام. أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها في 12،000 غرام لمدة 20 دقيقة ، ونقل 900 ميكرولتر من الطافية إلى أنبوب الطرد المركزي 4.7 ملم. كرر الطرد المركزي للسائل المتبقي ، ثم قم بجمع وخلط كل من المواد الطافية في نفس أنبوب الطرد المركزي الفائق.املأ الأنبوب بالكامل باستخدام برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي طاف في 100،000 غرام لمدة 60 دقيقة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات عن طريق ملء أنبوب الطرد المركزي الفائق ب PBS.بعد تكرار الطرد المركزي عند 100،000 غرام لمدة 60 دقيقة ، أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من PBS. نضح تعليق sEV باستخدام حقنة معقمة سعة ملليلتر واحد ، وقم بترشيحه من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 600 ميكرولتر. قم بتخزين المرشح عند 80 درجة مئوية لمزيد من التحليل.استخدم مقياس تدفق الجسيمات النانوية لتحديد توزيع حجم ونقاء sEVs. تحقق من حجم محلول التنظيف. ثم لاحظ الفرق بين مستويات الغمد وسائل النفايات.بعد 20 ثانية من تشغيل مصدر الطاقة الرئيسي للأداة ، قم بتشغيل الكمبيوتر. انتظر أصوات التنبيه التي تشير إلى أن الجهاز متصل بشكل صحيح لتشغيل البرنامج. انقر فوق بدء التشغيل لتشغيل الكاميرا والليزر ومضخة الهواء.بعد ذلك ، انقر فوق غمد فلو ، وحدد بدء التشغيل.ضع المياه فائقة النقاء على منصة التحميل. بعد أربع دقائق ، انقر فوق عينة وتعزيز، ثم حدد تفريغ في عينة. بعد 30 ثانية ، ضع الأنبوب الفارغ على منصة التحميل.انقر فوق عينة، وحدد تعزيز، ثم حدد تفريغ في عينة. ثم ضع الأنبوب الذي يحتوي على الماء عالي النقاء على منصة التحميل. في نفس الوقت ، انقر فوق عينة وتعزيز، متبوعا بتدفق غمد وتطهير.انقر فوق التشغيل اليدوي ، وضع أنبوب تركيز الجسيمات على منصة التحميل. ثم ، انقر فوق عينة ، وحدد تعزيز لمدة دقيقة واحدة ، وفي نفس الوقت حدد 250 نانومتر مراقبة جودة الكريات النانوية السيليكا الفلورية القياسية في معلومات العينة. حدد أخذ العينات من عينة ، وقم بتشغيل الكاشف بالنقر فوق SPCM.ثم ، انقر فوق أخذ العينات التلقائي ، وأدخل 1.0 في مجموعة أخذ العينات لإصلاح الضغط عند كيلو باسكال واحد. انقر فوق شريط الأدوات ، وحدد إشارة كبيرة. اضبط الوضع الأفقي لليزر ، واضبط الليزر على ميكرومترين.ثم ، انقر باستمرار على L و R للتأكد من أن الإشارة قوية وموحدة. انقر فوق Time to Record لجمع البيانات ، والتي تنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. ثم احفظ البيانات في ملف Nfa ، وانقر فوق نموذج لتحديد تفريغ.ضع أنبوب محلول التنظيف على منصة التحميل. انقر فوق عينة ، وحدد تعزيز ، وبعد دقيقة واحدة انقر فوق عينة وتفريغ. استخدم الماء عالي النقاء لإزالة محلول التنظيف المتبقي من طرف الشعيرات الدموية.ضع الأنبوب القياسي لحجم الجسيمات على منصة التحميل ، وانقر فوق تعزيز العينة لمدة دقيقة واحدة. حدد 68 إلى 155 S16M-Exo لمراقبة الجودة في معلومات العينة ، وانقر فوق عينة ، ثم أخذ العينات. بعد ذلك ، انقر فوق شريط الأدوات ، وحدد إشارة صغيرة.انقر فوق Time to Record لجمع البيانات ، والتي تنتقل تلقائيا إلى Buffer عند الانتهاء. بعد ذلك ، احفظ البيانات في ملف Nfa ، وانقر فوق نموذج لتحديد تفريغ. بعد إزالة البقايا بمحلول التنظيف ، ضع أنبوب PBS على منصة التحميل ، وقم بتنفيذ الخطوات الموضحة للأنبوب القياسي لحجم الجسيمات.بعد ذلك ، قم بتنظيف الطرف الشعري كما هو موضح سابقا ، وقم بتحميل عينة sEV لتحليل البيانات الموضحة سابقا للأنبوب القياسي لحجم الجسيمات. تم فحص sEVs المنقى تحت المجهر الإلكتروني النافذ ، والذي كشف عن وجود sEVs مع مورفولوجيا على شكل كوب. تم إجراء قياس التدفق الخلوي ل sEVs.وتراوح حجم الجسيمات من 40 إلى 200 نانومتر ، وكان متوسط حجم الجسيمات 89 نانومتر. تم العثور على نقاء sEVs المخصب ليكون 68.32٪ تم الكشف عن علامات البروتين من sEVs مثل CD63 و CD9 و TSG101 بواسطة اللطخة الغربية. تم استخدام GM130 كعلامة تحكم سلبية ل sEVs ، والتي تم العثور عليها في خلايا الأنسجة ولكن ليس في sEVs.من الأهمية بمكان تنفيذ خطوات الهضم الأنزيمي ، والطرد المركزي التفاضلي ، والترشيح الغشائي بعناية فائقة لضمان نقاء الحويصلات الصغيرة خارج الخلية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Osteosarcoma متلازمة لي-Fraumeni الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث المستمدة من المريض باستخدام النمذجة

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

دراسة آثار إشعاع الأنسجة الطبيعية باستخدام هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة Exosome تحمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة من الخلايا الجذعية الجنينية

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

التسلسل الصغيرة غير الترميز RNA من Formalin-الانسجه الثابتة ومصل المشتقات Exosomes من المرضي سرطان البروستاتا المقاوم

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

توسيع وإثراء الخلايا التائية من منتج بشري غير مشفر

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

في فيفو فحص المناعة للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الورم عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

نموذج كروي ثلاثي الأبعاد للتحقيق في التفاعل الورمي-السترومالي في سرطان الكبد

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...