Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

Forfatterne takker det første tilknyttede hospital i Gannan Medical University for at støtte dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (bevillingsnumre 82260422).

Humant leverkræftvæv blev indsamlet fra patienter diagnosticeret med levermalignitet på First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Alle patienter underskrev en informeret samtykkeformular, og indsamlingen af humane vævsprøver blev godkendt af den etiske komité på First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, alt udstyr og al software, der bruges i denne protokol.
1. Forberede...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Denne protokol beskriver en gentagelig metode til ekstraktion af sEV'er fra leverkræftvæv. SEV'er af høj kvalitet opnås ved skarp vævsisolering, behandling med fordøjelsesenzymer, differentiel ultracentrifugering og 0,22 μm filtermembranfiltrering og oprensning. Til downstream-analyse er det ekstremt vigtigt at sikre EV'ernes høje renhed. Ved differentiel centrifugering vises et lag hvide stoffer (ukendt sammensætning) på overfladen af supernatanten. Da dette lag ville forurene sEV'erne, fjernede vi det så meg...

Små ekstracellulære vesikler (sEV'er) er ca. 30 nm til 150 nm i diameter og udskilles af forskellige celler1. De kan kommunikere med vævsceller og regulere det lokale eller fjerne mikromiljø ved at transportere vigtige biologiske molekyler såsom lipider, proteiner, DNA og RNA til forskellige organer, væv, celler og intracellulære dele. Således kan de også ændre modtagercellernes opførsel 2,3. Isolering og oprensning af specifikke sEV'er er en væsentlig forudsætning for at studere deres biologiske adfærd under sygdomsudvikling og sygdomsforløb. Differentiel ultracentrifugering - betragtes som guldstandarden - bruges almindeligvis til at adskille sEV'er fra vævene, hvor de normalt befinder sig4. Vævsaffald, celleaffald, store vesikler og apoptotiske legemer kan fjernes ved hjælp af denne teknik, så kun sEV'erne efterlades.
Collagenase D og DNase I har vist sig ikke at påvirke cellernes eller vesiklers molekylære egenskaber, idet begge enzymers egenskaber bidrager til frigivelsen af vesikler i den ekstracellulære matrix 5. Disse enzymer er blevet brugt til at ekstrahere sEV'er fra humant metastatisk melanomvæv, tyktarmskræftvæv og tyktarmsslimhindevæv 5,6,7. Imidlertid er koncentrationen og fordøjelsestiden for collagenase D og DNase I i disse metoder forskellige, hvilket fører til inkonsekvente konklusioner. For at undgå samtidig udfældning af andre undertyper af sEV'er har forskere fjernet større ekstracellulære vesikler (0,1 μm eller 0,2 μm i diameter) ved filtrering og / eller differentiel centrifugering8. Afhængigt af udgangsvævet kan der kræves forskellige metoder til isolering og oprensning 9,10.
Anvendelse af den traditionelle differentiale ultracentrifugeringsmetode til ekstraktion af sEV fra levervæv resulterer i et lag hvidt stof på supernatantens overflade, uden at det er muligt at bestemme dets egenskaber. I en tidligere undersøgelse11 viste dette lag af hvidt stof sig at påvirke renheden af sEV'erne. Selv om partikelantallet og proteinkoncentrationen i prøver isoleret ved den traditionelle metode var højere end ved den nuværende metode, var variationskoefficienten stor, muligvis fordi mange forurenende stoffer kan føre til dårlig repeterbarhed af resultaterne. Det vil sige ved anvendelse af vaskemiddel (dvs. detektering af opløseligheden af partikler i 1% Triton X-100), fandt vi, at renheden af sEV'er opnået ved denne metode var større. Derfor bruger vi denne metode til at isolere og rense sEV'er afledt af kolorektal cancervæv til proteomisk forskning.
På nuværende tidspunkt er forskningen i sEV'er i leverkræft hovedsageligt fokuseret på serum, plasma og cellekulturens supernatant12,13,14. Imidlertid kan sEV'er afledt af leverkræftvæv mere nøjagtigt afspejle den fysiologiske patologi og det omgivende mikromiljø af leverkræft og effektivt undgå nedbrydning og forurening af andre EV'er15,16. Ved anvendelse af differentiel ultracentrifugering kan denne metode berige udbyttet og opnå sEV'er af høj kvalitet, hvilket giver et vigtigt grundlag for den videre undersøgelse af leverkræft. Denne metode gør det muligt at adskille leverkræftvævet ved skarp adskillelse og adskilles af kollagenase D og DNase I. Derefter fjernes det cellulære affald, store vesikler og apoptotiske legemer yderligere ved filtrering og differentiel ultracentrifugering. Endelig isoleres og renses EV'erne til senere undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Små ekstracellulære vesikler (sEV'er) afledt af væv kan afspejle kildecellernes funktionelle status og egenskaberne ved vævets interstitielle rum. Effektiv berigelse af disse EV'er er en vigtig forudsætning for undersøgelsen af deres biologiske funktion og en nøgle til udviklingen af kliniske detektionsteknikker og terapeutisk bærerteknologi. Det er vanskeligt at isolere sEV'er fra væv, fordi de normalt er stærkt forurenede. Denne undersøgelse giver en metode til hurtig berigelse af sEV'er af høj kvalitet fra leverkræftvæv. Metoden involverer en firetrinsproces: inkubation af fordøjelsesenzymer (collagenase D og DNase Ι) med væv, filtrering gennem en 70 μm cellesi, differentiel ultracentrifugering og filtrering gennem et 0,22 μm membranfilter. På grund af optimeringen af det differentielle ultracentrifugeringstrin og tilføjelsen af et filtreringstrin er renheden af de sEV'er, der opnås ved denne metode, højere end den, der opnås ved klassisk differentiel ultracentrifugering. Det giver en vigtig metode og understøttende data til undersøgelse af vævsafledte sEV'er.

sEV'er fra humant leverkræftvæv har spillet en afgørende rolle i diagnosen, behandlingen og prognosen hos patienter med leverkræft. Denne metode anvendte almindelige laboratorieinstrumenter til at isolere og rense sEV'er afledt af leverkræftvæv; dette kan give metodologisk støtte til undersøgelsen af sEV'er. Figur 2 illustrerer den generelle proces med berigelse af sEV'er fra leverkræftvæv. sEV'er i vævets intercellulære rum frigives fuldt ud gennem vævsskæring og enzymatisk hy...

Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Her beskriver vi berigelsen af små ekstracellulære vesikler afledt af leverkræftvæv gennem en optimeret differentiel ultracentrifugeringsmetode.

En berigelsesmetode til små ekstracellulære vesikler afledt af leverkræftvæv

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Denne metode muliggør isolering af små ekstracellulære vesikler afledt af leverkræftvæv med en renhed, der er højere end den, der opnås ved klassisk, differentiel ultracentrifugering. Denne teknologi er enkel, praktisk og nem at betjene, hvilket kan give metodologisk støtte til undersøgelse af små ekstracellulære vesikler. Til at begynde med skal du fjerne vævsprøven fra fryseren med 80 grader Celsius.Placer ca. 400 milligram af vævet i en 10 centimeter cellekulturskål på isboksen, og hak vævet fint med en skalpel. Overfør vævet til en seks-brøndplade med 1,5 ml fordøjelsesopløsningen. Placer derefter pladen på overførselsaffarvningsrysteren og inkuber ved 37 grader Celsius i 20 minutter for fuldstændig dissociation af leverkræftvævet og frigivelse af de små ekstracellulære vesikler eller sEV'er.Efter inkubation skal du placere seksbrøndpladen på isboksen. Tilsæt 80 mikroliter fosfatasehæmmer og 200 mikroliter komplet proteasehæmmeropløsning for at stoppe fordøjelsen. Overfør derefter fordøjelsesopløsningen til en 70 mikrometer cellesil placeret på et to-milliliter centrifugerør, og filtrer det langsomt for at fjerne store vævsrester.Filtratet centrifugeres ved 500 g i 10 minutter for at fjerne de små vævsrester, og supernatanten opsamles i et nyt to-ml-centrifugeglas. Supernatanten centrifugeres ved 3.000 g i 20 minutter for at fjerne celleresterne. Supernatanten overføres forsigtigt til et nyt centrifugeglas, indtil pipettens spids er ved at berøre det hvide snavs i bunden.Efter gentagen centrifugering af den resterende væske samles supernatanten i glasset uden at forstyrre snavset. Den opsamlede supernatant centrifugeres ved 12.000 g i 20 minutter, og 900 mikroliter supernatant overføres til et 4,7 millimeter ultracentrifugeglas. Centrifugeringen af den resterende væske gentages, hvorefter begge supernatanter opsamles og blandes i samme ultracentrifugeglas.Fyld røret helt med PBS. Supernatanten centrifugeres ved 100.000 g i 60 minutter. Efter at supernatanten er kasseret, resuspenderes pelletten ved at fylde ultracentrifugeglasset med PBS.Efter gentagelse af centrifugeringen ved 100.000 g i 60 minutter resuspenderes pelleten med 50 mikroliter PBS. Opsug sEV-suspensionen ved hjælp af en steril sprøjte på en milliliter, og filtrer den gennem et 0,22 mikrometer membranfilter ind i et 600 mikroliter centrifugerør. Opbevar filtratet ved 80 grader Celsius til yderligere analyse.Brug et nanopartikelflowcytometer til at bestemme størrelsesfordelingen og renheden af sEV'erne. Kontroller rengøringsopløsningens volumen. Bemærk derefter forskellen mellem niveauerne af kappen og affaldsvæsken.Efter 20 sekunder efter at have tændt instrumentets hovedstrømforsyning, skal du tænde computeren. Vent på biplyd, der angiver, at instrumentet er korrekt tilsluttet til at køre softwaren. Klik på Start Up for at tænde kameraet, laseren og luftpumpen.Klik derefter på Sheath Flow, og vælg Start Up.Placer ultrarent vand på læsseplatformen. Efter fire minutter skal du klikke på Sample and Boosting og derefter vælge Unload in Sample. Efter 30 sekunder placeres det tomme rør på læsseplatformen.Klik på Sample, vælg Boosting, og vælg derefter Fjern i Sample. Placer derefter røret med det ultrarene vand på læsseplatformen. Klik samtidigt på Sample and Boostingefterfulgt af Sheath Flow and Purge.Klik på Manuel betjening, og placer partikelkoncentrationsrøret på læsseplatformen. Klik derefter på Sample, vælg Boosting i et minut, og vælg samtidig 250 nanometer Standard Fluorescent Silica Nanospheres kvalitetskontrol i Sample Information. Vælg Prøveudtagning fra prøve, og tænd detektoren ved at klikke på SPCM.Klik derefter på Automatisk prøveudtagning, og indtast 1.0 i Sampling Set for at fastsætte trykket til en kilopascal. Klik på værktøjslinjen, og vælg Stort signal. Juster laserens vandrette position, og indstil laseren til to mikrometer.Klik derefter kontinuerligt på L og R for at sikre, at signalet er stærkt og ensartet. Klik på Tid til optagelse for at indsamle dataene, som automatisk springer til buffer, når de er færdige. Gem derefter dataene i Nfa-filen, og klik på Prøve for at vælge Loss.Anbring rengøringsopløsningsrøret på læsseplatformen. Klik på Sample, vælg Boosting, og klik efter et minut på Sample and Unload. Brug ultrarent vand til at fjerne den resterende rengøringsopløsning fra kapillærspidsen.Placer standardrøret i partikelstørrelse på læsseplatformen, og klik på Sample Boosting i et minut. Vælg 68 til 155 S16M-Exo kvalitetskontrol i Eksempeloplysninger, og klik på Prøve og derefter Prøveudtagning. Klik derefter på værktøjslinjen, og vælg Lille signal.Klik på Tid til optagelse for at indsamle dataene, som automatisk springer til buffer, når de er færdige. Gem derefter dataene i en Nfa-fil, og klik på Prøve for at vælge Fjern. Når resterne er fjernet med rengøringsopløsningen, anbringes PBS-røret på læsseplatformen, og de trin, der er demonstreret for standardrøret til partikelstørrelse, udføres.Rens derefter kapillærspidsen som vist tidligere, og læg sEV-prøven for at analysere de tidligere beskrevne data for partikelstørrelsesstandardrøret. De oprensede sEV'er blev undersøgt under et transmissionselektronmikroskop, som afslørede tilstedeværelsen af sEV'er med en kopformet morfologi. Flowcytometri for sEV'erne blev udført.Og partikelstørrelsen varierede fra 40 til 200 nanometer, og den gennemsnitlige partikelstørrelse var 89 nanometer. Renheden af de berigede sEV'er viste sig at være 68,32%Proteinmarkørerne for sEV'er såsom CD63, CD9 og TSG101 blev påvist af western blot. GM130 blev anvendt som negativ kontrolmarkør for sEV'er, som blev fundet i vævsceller, men ikke i sEV'erne.Det er afgørende at udføre trinnene med enzymatisk fordøjelse, differentiel ultracentrifugering og membranfiltrering med yderste omhu for at sikre renheden af små ekstracellulære vesikler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom ved hjælp af Li-Fraumeni syndrom Patient-afledte inducerede pluripotente stamceller-celler

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normale vævs stråling effekter ved hjælp af ekstracellulære matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering af exosome-beriget ekstracellulære vesikler Transporterer Granulocyte-Makrofag Colony-stimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere Triple Negative Breast Cancer Brug Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Sequencing lille ikke-kodning RNA fra formalin-fast væv og serum-afledte Exosomer fra Kastrations resistente prostata cancer patienter

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Udvidelse og berigelse af Gamma-Delta (γδ) T-celler fra aferesed humant produkt

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Immunogenicitetsscreening af tumorafledte ekstracellulære vesikler ved flowcytometri af milt-T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensionel spheroid model til at undersøge tumor-stromal interaktion i hepatocellulær karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...