Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

De auteurs bedanken het First Affiliated Hospital van Gannan Medical University voor het ondersteunen van dit werk. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82260422).

Menselijk leverkankerweefsel werd verzameld van patiënten met de diagnose levermaligniteit in het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University. Alle patiënten ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier en de verzameling van menselijke weefselmonsters werd goedgekeurd door de ethische commissie van het First Affiliated Hospital van de Gannan Medical University. Zie de Materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, apparatuur en software die in dit protocol worden gebr...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een herhaalbare methode voor het extraheren van sEV's uit leverkankerweefsel. Hoogwaardige sEV's worden verkregen door scherpe weefselisolatie, behandeling met spijsverteringsenzymen, differentiële ultracentrifugatie en 0,22 μm filtermembraanfiltratie en -zuivering. Voor downstream-analyse is het uiterst belangrijk om de hoge zuiverheid van de sEV's te waarborgen. Tijdens het proces van differentiële centrifugatie verschijnt een laag witte stoffen (onbekende samenstelling) op het oppervlak van ...

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) hebben een diameter van ongeveer 30 nm tot 150 nm en worden uitgescheiden door verschillende cellen1. Ze kunnen communiceren met weefselcellen en de lokale of verre micro-omgeving reguleren door belangrijke biologische moleculen zoals lipiden, eiwitten, DNA en RNA naar verschillende organen, weefsels, cellen en intracellulaire delen te transporteren. Zo kunnen ze ook het gedrag van ontvangende cellen veranderen 2,3. De isolatie en zuivering van specifieke sEV's is een essentiële voorwaarde voor het bestuderen van hun biologische gedrag tijdens de ontwikkeling en het verloop van de ziekte. Differentiële ultracentrifugatie - beschouwd als de gouden standaard - wordt vaak gebruikt om sEV's te scheiden van de weefsels waarin ze zich normaal bevinden4. Weefselresten, celresten, grote blaasjes en apoptotische lichamen kunnen met deze techniek worden verwijderd, waardoor alleen de sEV's overblijven.
Van collagenase D en DNase I is aangetoond dat ze de moleculaire kenmerken van cellen of blaasjes niet beïnvloeden, waarbij de eigenschappen van beide enzymen bijdragen aan de afgifte van blaasjes in de extracellulaire matrix 5. Deze enzymen zijn gebruikt om sEV's te extraheren uit menselijk gemetastaseerd melanoomweefsel, darmkankerweefsel en darmslijmvliesweefsel 5,6,7. De concentratie en verteringstijd van collagenase D en DNase I in deze methoden verschillen echter, wat leidt tot inconsistente conclusies. Om de coprecipitatie van andere subtypen van sEV's te voorkomen, hebben onderzoekers grotere extracellulaire blaasjes (0,1 μm of 0,2 μm in diameter) verwijderd door filtratie en / of differentiële centrifugatie8. Afhankelijk van het bronweefsel kunnen verschillende methoden van isolatie en zuivering nodig zijn 9,10.
Het gebruik van de traditionele differentiële ultracentrifugatiemethode om sEV's uit leverweefsel te extraheren, resulteert in een laag witte stof op het oppervlak van het supernatant, zonder enige manier om de eigenschappen ervan te bepalen. In een eerdere studie11 bleek deze laag witte stof de zuiverheid van de sEV's te beïnvloeden. Hoewel het aantal deeltjes en de eiwitconcentratie van monsters die met de traditionele methode werden geïsoleerd hoger waren dan die van de huidige methode, was de variatiecoëfficiënt groot, mogelijk omdat veel verontreinigende stoffen kunnen leiden tot een slechte herhaalbaarheid van de resultaten. Dat wil zeggen, met behulp van detergent (d.w.z. het detecteren van de oplosbaarheid van deeltjes in 1% Triton X-100), vonden we dat de zuiverheid van sEV's verkregen door deze methode groter was. Daarom gebruiken we deze methode om sEV's afgeleid van colorectaal kankerweefsel te isoleren en te zuiveren voor proteomisch onderzoek.
Op dit moment is het onderzoek naar sEV's bij leverkanker voornamelijk gericht op serum, plasma en het supernatant van de celcultuur12,13,14. SEV's afgeleid van leverkankerweefsel kunnen echter nauwkeuriger de fysiologische pathologie en de omliggende micro-omgeving van leverkanker weerspiegelen en effectief de afbraak en vervuiling van andere EV's voorkomen15,16. Met het gebruik van differentiële ultracentrifugatie kan deze methode de opbrengst verrijken en hoogwaardige sEV's verkrijgen, wat een belangrijke basis vormt voor de verdere studie van leverkanker. Deze methode maakt het mogelijk om het leverkankerweefsel te scheiden door scherpe scheiding en te worden gedissocieerd door collagenase D en DNase I. Vervolgens worden het cellulaire puin, grote blaasjes en apoptotische lichamen verder verwijderd door filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Ten slotte worden de sEV's geïsoleerd en gezuiverd voor latere studies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) afgeleid van weefsel kunnen de functionele status van de broncellen en de kenmerken van de interstitiële ruimte van het weefsel weerspiegelen. De efficiënte verrijking van deze sEV's is een belangrijke voorwaarde voor de studie van hun biologische functie en een sleutel tot de ontwikkeling van klinische detectietechnieken en therapeutische dragertechnologie. Het is moeilijk om sEV's uit weefsel te isoleren omdat ze meestal zwaar verontreinigd zijn. Deze studie biedt een methode voor de snelle verrijking van hoogwaardige sEV's uit leverkankerweefsel. De methode omvat een proces in vier stappen: de incubatie van spijsverteringsenzymen (collagenase D en DNase Ι) met weefsel, filtratie door een 70 μm celzeef, differentiële ultracentrifugatie en filtratie door een membraanfilter van 0,22 μm. Door de optimalisatie van de differentiële ultracentrifugatiestap en de toevoeging van een filtratiestap is de zuiverheid van de sEV's die met deze methode worden verkregen hoger dan die van klassieke differentiële ultracentrifugatie. Het biedt een belangrijke methodologie en ondersteunende gegevens voor de studie van weefsel-afgeleide sEV's.

sEV's uit menselijke leverkankerweefsels hebben een cruciale rol gespeeld bij de diagnose, behandeling en prognose van patiënten met leverkanker. Deze methode maakte gebruik van gemeenschappelijke laboratoriuminstrumenten om sEV's afkomstig van leverkankerweefsels te isoleren en te zuiveren; dit kan methodologische ondersteuning bieden voor de studie van sEV's. Figuur 2 illustreert het algemene proces van het verrijken van sEV's uit leverkankerweefsels. sEV's in de intercellulaire ruimtes v...

Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Hier beschrijven we de verrijking van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel door middel van een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode.

Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Deze methode maakt de isolatie mogelijk van leverkankerweefsel afgeleide kleine extracellulaire blaasjes met een zuiverheid die hoger is dan die bereikt door klassieke, differentiële ultracentrifugatie. Deze technologie is eenvoudig, handig en gemakkelijk te bedienen, wat methodologische ondersteuning kan bieden voor de studie van kleine extracellulaire blaasjes. Verwijder om te beginnen het weefselmonster uit de vriezer van 80 graden Celsius.Plaats ongeveer 400 milligram van het weefsel in een celkweekschaal van 10 centimeter op de ijskist en hak het weefsel fijn met een scalpel. Breng het weefsel over naar een plaat met zes putten met 1,5 milliliter van de spijsverteringsoplossing. Plaats vervolgens de plaat op de transferieontkleuringsschudder en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius voor volledige dissociatie van het leverkankerweefsel en afgifte van de kleine extracellulaire blaasjes of sEV's.Plaats na de incubatie de plaat met zes putten op de ijskist. Voeg 80 microliter fosfataseremmer en 200 microliter complete proteaseremmeroplossing toe om de spijsvertering te stoppen. Breng vervolgens de spijsverteringsoplossing over naar een 70-micrometer celzeef op een centrifugebuis van twee milliliter en filter deze langzaam om grote weefselresten te verwijderen.Centrifugeer het filtraat gedurende 10 minuten op 500 g om het kleine weefselresten te verwijderen en verzamel het supernatant in een nieuwe centrifugebuis van twee milliliter. Centrifugeer het supernatant op 3.000 g gedurende 20 minuten om het celafval te verwijderen. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe centrifugebuis totdat de punt van de pipet op het punt staat het witte vuil aan de onderkant te raken.Na het herhalen van de centrifugatie van de resterende vloeistof, poolt u het supernatant in de buis zonder het vuil te verstoren. Centrifugeer het verzamelde supernatant op 12.000 g gedurende 20 minuten en breng 900 microliter van het supernatant over in een ultracentrifugebuis van 4,7 millimeter. Herhaal de centrifugatie van de resterende vloeistof en verzamel en meng vervolgens beide supernatanten in dezelfde ultracentrifugebuis.Vul de tube volledig met PBS. Centrifugeer het supernatant op 100.000 g gedurende 60 minuten. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspendeert u de pellet door de ultracentrifugebuis te vullen met PBS.Na het herhalen van de centrifugatie bij 100.000 g gedurende 60 minuten, resuspensie de pellet met 50 microliter PBS. Zuig de sEV-suspensie op met een steriele spuit van één milliliter en filter deze door een membraanfilter van 0,22 micrometer in een centrifugebuis van 600 microliter. Bewaar het filtraat bij 80 graden Celsius voor verdere analyse.Gebruik een nanodeeltjesstroomcytometer om de grootteverdeling en zuiverheid van de sEV's te bepalen. Controleer het volume van de reinigingsoplossing. Let vervolgens op het verschil tussen de niveaus van de schede en de afvalvloeistof.Na 20 seconden de hoofdvoeding van het instrument in te schakelen, schakelt u de computer in. Wacht tot de pieptonen aangeven dat het instrument correct is aangesloten om de software uit te voeren. Klik op Opstarten om de camera, laser en luchtpomp in te schakelen.Klik vervolgens op Sheath Flow en selecteer Start Up.Plaats ultrapuur water op het laadplatform. Klik na vier minuten op Sample and Boosting en selecteer vervolgens Unload in Sample. Plaats na 30 seconden de lege buis op het laadplatform.Klik op Voorbeeld, selecteer Boosten en selecteer vervolgens Verwijderen in Voorbeeld. Plaats vervolgens de buis met het ultrazuivere water op het laadplatform. Klik tegelijkertijd op Sample en Boosting, gevolgd door Sheath Flow en Purge.Klik op Handmatige bediening en plaats de deeltjesconcentratiebuis op het laadplatform. Klik vervolgens op Voorbeeld, selecteer Boosting gedurende één minuut en selecteer tegelijkertijd 250 nanometer Standard Fluorescent Silica Nanospheres kwaliteitscontrole in Sample Information. Selecteer Bemonstering uit monster en schakel de detector in door op SPCM te klikken.Klik vervolgens op Auto Sampling en voer 1.0 in Sampling Set in om de druk op één kilopascal vast te stellen. Klik op de werkbalk en selecteer Groot signaal. Pas de horizontale positie van de laser aan en stel de laser in op twee micrometer.Klik vervolgens continu op L en R om ervoor te zorgen dat het signaal sterk en uniform is. Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springt wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in Nfa-bestand en klik op Voorbeeld om Verwijderen te selecteren.Plaats de buis van de reinigingsoplossing op het laadplatform. Klik op Sample, selecteer Boosting en klik na één minuut op Sample and Unload. Gebruik ultrapuur water om de resterende reinigingsoplossing van de capillaire punt te verwijderen.Plaats de standaardbuis voor deeltjesgrootte op het laadplatform en klik gedurende één minuut op Sample Boosting. Selecteer 68 tot 155 S16M-Exo kwaliteitscontrole in Voorbeeldinformatie en klik op Voorbeeld en vervolgens op Bemonstering. Klik vervolgens op de werkbalk en selecteer Klein signaal.Klik op Tijd om op te nemen om de gegevens te verzamelen, die automatisch naar Buffer springt wanneer u klaar bent. Sla vervolgens de gegevens op in een Nfa-bestand en klik op Voorbeeld om Verwijderen te selecteren. Nadat u de residuen met de reinigingsoplossing hebt verwijderd, plaatst u de PBS-buis op het laadplatform en voert u de stappen uit die zijn gedemonstreerd voor de standaardbuis voor deeltjesgrootte.Reinig vervolgens de capillaire punt zoals eerder gedemonstreerd en laad het sEV-monster om de eerder beschreven gegevens voor de standaardbuis voor deeltjesgrootte te analyseren. De gezuiverde sEV's werden onderzocht onder een transmissie-elektronenmicroscoop, die de aanwezigheid van sEV's met een bekervormige morfologie onthulde. Flowcytometrie voor de sEV's werd uitgevoerd.De deeltjesgrootte varieerde van 40 tot 200 nanometer, en de gemiddelde deeltjesgrootte was 89 nanometer. De zuiverheid van de verrijkte sEV's bleek 68,32% te zijn: De eiwitmarkers van sEV's zoals CD63, CD9 en TSG101 werden gedetecteerd door western blot. GM130 werd gebruikt als de negatieve controlemarker van sEV's, die werd aangetroffen in weefselcellen, maar niet in de sEV's.Het is cruciaal om de stappen van enzymatische spijsvertering, differentiële ultracentrifugatie en membraanfiltratie met de grootste zorg uit te voeren om de zuiverheid van kleine extracellulaire blaasjes te garanderen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Het bestuderen van normale weefsel straling effecten met behulp van extracellulaire matrix hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Sequentiëren van klein niet-coderende RNA van Formalin-vaste weefsels en van serum afgeleide Exosomen van castratie bestendige prostaatkanker patiënten

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Immunogeniciteitsscreening van tumor-afgeleide extracellulaire blaasjes door flowcytometrie van milt-T-cellen

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...