Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
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Les auteurs remercient le premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan pour son soutien à ce travail. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 82260422).

Le tissu cancéreux du foie humain a été recueilli chez des patients atteints de malignité hépatique au premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Tous les patients ont signé un formulaire de consentement éclairé et la collecte d’échantillons de tissus humains a été approuvée par le comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’Université médicale de Gannan. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et ...

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	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode reproductible pour extraire les sEV du tissu cancéreux du foie. Les sEVs de haute qualité sont obtenus par isolation nette des tissus, traitement avec des enzymes digestives, ultracentrifugation différentielle et filtration et purification de la membrane filtrante de 0,22 μm. Pour l’analyse en aval, il est extrêmement important de garantir la haute pureté des sEV. Dans le processus de centrifugation différentielle, une couche de substances blanches (composition inconnue) appara?...

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) mesurent environ 30 nm à 150 nm de diamètre et sont sécrétées par diverses cellules1. Ils peuvent communiquer avec les cellules tissulaires et réguler le microenvironnement local ou distant en transportant des molécules biologiques importantes telles que les lipides, les protéines, l’ADN et l’ARN vers divers organes, tissus, cellules et parties intracellulaires. Ainsi, ils peuvent également modifier le comportement des cellules receveuses 2,3. L’isolement et la purification de sEVs spécifiques est une condition préalable essentielle à l’étude de leur comportement biologique au cours du développement et de l’évolution de la maladie. L’ultracentrifugation différentielle, considérée comme l’étalon-or, est couramment utilisée pour séparer les sEV des tissus dans lesquels ils résident normalement4. Les débris tissulaires, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques peuvent être éliminés par cette technique, ne laissant que les sEV.
Il a été démontré que la collagénase D et la DNase I n’affectent pas les caractéristiques moléculaires des cellules ou des vésicules, les propriétés des deux enzymes contribuant à la libération de vésicules dans la matrice extracellulaire 5. Ces enzymes ont été utilisées pour extraire les sEV du tissu de mélanome métastatique humain, du tissu cancéreux du côlon et du tissu de la muqueuse colique 5,6,7. Cependant, la concentration et le temps de digestion de la collagénase D et de la DNase I dans ces méthodes diffèrent, ce qui conduit à des conclusions incohérentes. Pour éviter la coprécipitation d’autres sous-types de SEV, les chercheurs ont retiré des vésicules extracellulaires plus grandes (0,1 μm ou 0,2 μm de diamètre) par filtration et/ou centrifugation différentielle8. Selon le tissu source, différentes méthodes d’isolement et de purification peuvent être nécessaires 9,10.
L’utilisation de la méthode traditionnelle d’ultracentrifugation différentielle pour extraire les sEV du tissu hépatique entraîne une couche de substance blanche à la surface du surnageant, sans aucun moyen de déterminer ses propriétés. Dans une étude précédente11, cette couche de substance blanche affectait la pureté des sEV. Bien que le nombre de particules et la concentration en protéines des échantillons isolés par la méthode traditionnelle soient plus élevés que ceux de la méthode actuelle, le coefficient de variation était important, peut-être parce que de nombreux polluants peuvent entraîner une mauvaise répétabilité des résultats. C’est-à-dire qu’en utilisant un détergent (c’est-à-dire en détectant la solubilité des particules dans 1% Triton X-100), nous avons constaté que la pureté des sEV obtenus par cette méthode était plus grande. Par conséquent, nous utilisons cette méthode pour isoler et purifier les sEV dérivés du tissu du cancer colorectal pour la recherche protéomique.
À l’heure actuelle, la recherche sur les sEV dans le cancer du foie se concentre principalement sur le sérum, le plasma et le surnageant de la culture cellulaire12,13,14. Cependant, les sEV dérivés du tissu cancéreux du foie peuvent refléter plus précisément la pathologie physiologique et le microenvironnement environnant du cancer du foie et éviter efficacement la dégradation et la pollution d’autres VE15,16. Avec l’utilisation de l’ultracentrifugation différentielle, cette méthode peut enrichir le rendement et obtenir des EVE de haute qualité, fournissant une base importante pour l’étude ultérieure du cancer du foie. Cette méthode permet de séparer le tissu cancéreux du foie par séparation nette et d’être dissocié par la collagénase D et la DNase I. Ensuite, les débris cellulaires, les grandes vésicules et les corps apoptotiques sont éliminés par filtration et ultracentrifugation différentielle. Enfin, les sEV sont isolés et purifiés pour des études ultérieures.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) dérivées du tissu peuvent refléter l’état fonctionnel des cellules sources et les caractéristiques de l’espace interstitiel du tissu. L’enrichissement efficace de ces sEV est une condition préalable importante à l’étude de leur fonction biologique et une clé pour le développement de techniques de détection clinique et de technologie de support thérapeutique. Il est difficile d’isoler les sEV des tissus, car ils sont généralement fortement contaminés. Cette étude fournit une méthode pour l’enrichissement rapide de sEVs de haute qualité à partir de tissus cancéreux du foie. La méthode implique un processus en quatre étapes: l’incubation des enzymes digestives (collagénase D et DNase Ι) avec les tissus, la filtration à travers une passoire cellulaire de 70 μm, l’ultracentrifugation différentielle et la filtration à travers un filtre à membrane de 0,22 μm. Grâce à l’optimisation de l’étape d’ultracentrifugation différentielle et à l’ajout d’une étape de filtration, la pureté des sEV obtenus par cette méthode est supérieure à celle obtenue par l’ultracentrifugation différentielle classique. Il fournit une méthodologie importante et des données à l’appui pour l’étude des EV dérivés de tissus.

Les sEV des tissus cancéreux du foie humain ont joué un rôle crucial dans le diagnostic, le traitement et le pronostic des patients atteints d’un cancer du foie. Cette méthode utilisait des instruments de laboratoire courants pour isoler et purifier les sEV dérivés des tissus cancéreux du foie; cela peut fournir un soutien méthodologique pour l’étude des EV. La figure 2 illustre le processus général d’enrichissement des EV à partir des tissus cancéreux du foie. Les sEVs da...

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An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Nous décrivons ici l’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées du tissu cancéreux du foie grâce à une méthode d’ultracentrifugation différentielle optimisée.

Procédé d’enrichissement de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Cette méthode permet d’isoler de petites vésicules extracellulaires dérivées de tissus cancéreux du foie avec une pureté supérieure à celle obtenue par ultracentrifugation différentielle classique. Cette technologie est simple, pratique et facile à utiliser, ce qui peut fournir un soutien méthodologique pour l’étude de petites vésicules extracellulaires. Pour commencer, retirez l’échantillon de tissu du congélateur à 80 degrés Celsius.Placez environ 400 milligrammes de tissu dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres sur la glacière et hachez finement le tissu avec un scalpel. Transférer le tissu dans une plaque à six puits avec 1,5 millilitre de solution digestive. Ensuite, placez la plaque sur le shaker décolorant de transfert et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes pour une dissociation complète du tissu cancéreux du foie et la libération des petites vésicules extracellulaires, ou sEV.Après l’incubation, placez la plaque à six puits sur la glacière. Ajouter 80 microlitres d’inhibiteur de phosphatase et 200 microlitres de solution complète d’inhibiteur de protéase pour arrêter la digestion. Ensuite, transférez la solution digestive dans une crépine cellulaire de 70 micromètres placée sur un tube à centrifuger de deux millilitres et filtrez-la lentement pour éliminer les gros débris tissulaires.Centrifuger le filtrat à 500 g pendant 10 minutes pour éliminer les petits débris tissulaires et recueillir le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de deux millilitres. Centrifuger le surnageant à 3 000 g pendant 20 minutes pour éliminer les débris cellulaires. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger jusqu’à ce que l’extrémité de la pipette soit sur le point de toucher les débris blancs au fond.Après avoir répété la centrifugation du liquide restant, enrouler le surnageant dans le tube sans déranger les débris. Centrifuger le surnageant collecté à 12 000 g pendant 20 minutes et transférer 900 microlitres du surnageant dans un tube à ultracentrifugation de 4,7 millimètres. Répéter la centrifugation du liquide restant, puis recueillir et mélanger les deux surnageants dans le même tube à ultracentrifugation.Remplissez complètement le tube avec du PBS. Centrifuger le surnageant à 100 000 g pendant 60 minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension en remplissant le tube à ultracentrifugeuses de PBS.Après avoir répété la centrifugation à 100 000 g pendant 60 minutes, remettre la pastille en suspension avec 50 microlitres de PBS. Aspirez la suspension sEV à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre et filtrez-la à travers un filtre à membrane de 0,22 micromètre dans un tube à centrifuger de 600 microlitres. Conservez le filtrat à 80 degrés Celsius pour une analyse plus approfondie.Utilisez un cytomètre à flux de nanoparticules pour déterminer la distribution granulométrique et la pureté des sEV. Vérifiez le volume de la solution de nettoyage. Ensuite, notez la différence entre les niveaux de la gaine et du liquide résiduaire.Après 20 secondes de mise sous tension de l’alimentation principale de l’instrument, allumez l’ordinateur. Attendez les bips indiquant que l’instrument est correctement connecté pour exécuter le logiciel. Cliquez sur Démarrer pour allumer la caméra, le laser et la pompe à air.Ensuite, cliquez sur Sheath Flow et sélectionnez Start Up.Placez de l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement. Après quatre minutes, cliquez sur Sample and Amping (Exemple et amplification), puis sélectionnez Décharger dans l’échantillon. Après 30 secondes, placez le tube vierge sur la plate-forme de chargement.Cliquez sur Sample, sélectionnez Boosting, puis sélectionnez Décharger dans l’échantillon. Ensuite, placez le tube contenant l’eau ultrapure sur la plate-forme de chargement. Simultanément, cliquez sur Échantillon et Boosting, puis sur Sheath Flow et Purge.Cliquez sur Manual Operation (Fonctionnement manuel) et placez le tube de concentration de particules sur la plate-forme de chargement. Ensuite, cliquez sur Échantillon, sélectionnez Booster pendant une minute, puis sélectionnez simultanément le contrôle qualité des nanosphères de silice fluorescente standard de 250 nanomètres dans Informations sur l’échantillon. Sélectionnez Échantillonnage à partir de l’échantillon et allumez le détecteur en cliquant sur SPCM.Ensuite, cliquez sur Échantillonnage automatique et entrez 1.0 dans le jeu d’échantillonnage pour fixer la pression à un kilopascal. Cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Large Signal (Signal volumineux). Ajustez la position horizontale du laser et réglez le laser sur deux micromètres.Ensuite, cliquez continuellement sur L et R pour vous assurer que le signal est fort et uniforme. Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passent automatiquement à Buffer lorsque vous avez terminé. Ensuite, enregistrez les données dans le fichier Nfa et cliquez sur Exemple pour sélectionner Décharger.Placez le tube de solution de nettoyage sur la plate-forme de chargement. Cliquez sur Sample, sélectionnez Boosting, et après une minute, cliquez sur Sample and Unload. Utilisez de l’eau ultrapure pour éliminer la solution de nettoyage résiduelle de l’extrémité capillaire.Placez le tube standard de taille de particules sur la plate-forme de chargement et cliquez sur Sample Boosting pendant une minute. Sélectionnez 68 à 155 S16M-Exo quality control dans Sample Information (Informations sur l’échantillon), puis sur Sample (Échantillonnage), puis sur Sampling (Échantillonnage). Ensuite, cliquez sur la barre d’outils et sélectionnez Petit signal.Cliquez sur Time to Record pour collecter les données, qui passent automatiquement à Buffer lorsque vous avez terminé. Ensuite, enregistrez les données dans un fichier Nfa et cliquez sur Exemple pour sélectionner Décharger. Après avoir éliminé les résidus avec la solution de nettoyage, placez le tube PBS sur la plate-forme de chargement et effectuez les étapes indiquées pour le tube standard granulométrique.Ensuite, nettoyez l’extrémité capillaire comme démontré précédemment et chargez l’échantillon sEV pour analyser les données décrites précédemment pour le tube standard de taille de particule. Les sEV purifiés ont été examinés au microscope électronique à transmission, qui a révélé la présence de sEV avec une morphologie en forme de coupe. Une cytométrie en flux pour les sEV a été réalisée.Et la taille des particules variait de 40 à 200 nanomètres, et la taille moyenne des particules était de 89 nanomètres. La pureté des sEV enrichis s’est avérée être de 68,32%Les marqueurs protéiques des sEV tels que CD63, CD9 et TSG101 ont été détectés par transfert Western. GM130 a été utilisé comme marqueur de contrôle négatif des sEV, qui a été trouvé dans les cellules tissulaires mais pas dans les sEV.Il est crucial d’effectuer les étapes de la digestion enzymatique, de l’ultracentrifugation différentielle et de la filtration membranaire avec le plus grand soin pour assurer la pureté des petites vésicules extracellulaires.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Ostéosarcome utilisant le Syndrome de Li-Fraumeni cellules souches de pluripotentes induites Patient dérivé de modélisation

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome murin à partir de cellules souches de mélanocytes mutants

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolement de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes transportant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages à partir de cellules souches embryonnaires

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Étudier le cancer du sein triple négatif à l’aide d’un modèle orthotopique de cancer du sein

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Séquençage de petits ARN non codants à partir de tissus fixeds et d'exosomes dérivés du sérum provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Dépistage de l’immunogénicité des vésicules extracellulaires dérivées de tumeurs par cytométrie en flux de lymphocytes T spléniques

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Un modèle sphéroïde tridimensionnel pour étudier l’interaction tumeur-stromale dans le carcinome hépatocellulaire

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...