Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
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लेखक इस काम का समर्थन करने के लिए गन्नान मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल को धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82260422) द्वारा समर्थित किया गया था।

गन्नान मेडिकल यूनिवर्सिटी के पहले संबद्ध अस्पताल में यकृत घातकता के निदान वाले रोगियों से मानव यकृत कैंसर ऊतक एकत्र किया गया था। सभी रोगियों ने एक सूचित सहमति फॉर्म पर हस्ताक्षर किए, और मानव ऊतक के नम?...

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	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल यकृत कैंसर ऊतक से एसईवी निकालने के लिए एक दोहराने योग्य विधि का वर्णन करता है। उच्च गुणवत्ता वाले एसईवी तेज ऊतक अलगाव, पाचन एंजाइमों के साथ उपचार, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और 0.22 μm फ़िल?...

छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) व्यास में लगभग 30 एनएम से 150 एनएम होते हैं औरविभिन्न कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं। वे ऊतक कोशिकाओं के साथ संवाद कर सकते हैं और लिपिड, प्रोटीन, डीएनए और आरएनए जैसे महत्वपूर्ण जैविक अणुओं को विभिन्न अंगों, ऊतकों, कोशिकाओं और इंट्रासेल्युलर भागों में परिवहन करके स्थानीय या दूर के माइक्रोएन्वायरमेंट को विनियमित कर सकते हैं। इस प्रकार, वे प्राप्तकर्ता कोशिकाओं2,3 के व्यवहार को भी बदल सकते हैं। विशिष्ट एसईवी का अलगाव और शुद्धिकरण रोग के विकास और पाठ्यक्रम के दौरान उनके जैविक व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक शर्त है। विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-जिसे सोने के मानक के रूप में माना जाता है- आमतौर पर एसईवी को उन ऊतकों से अलग करने के लिए उपयोग कियाजाता है जिनमें वे सामान्य रूप से रहते हैं। ऊतक मलबे, सेल मलबे, बड़े पुटिकाओं और एपोप्टोटिक निकायों को इस तकनीक द्वारा हटाया जा सकता है, केवल एसईवी को छोड़कर।
कोलेजनेज डी और डीनेस आई को कोशिकाओं या पुटिकाओं की आणविक विशेषताओं को प्रभावित नहीं करने के लिए दिखाया गया है, दोनों एंजाइमों के गुण बाह्य मैट्रिक्स 5 में पुटिकाओं की रिहाई में योगदान करते हैं। इन एंजाइमों का उपयोग मानव मेटास्टैटिक मेलेनोमा ऊतक, बृहदान्त्र कैंसर ऊतक और कोलोनिक म्यूकोसल ऊतक 5,6,7 से एसईवी निकालने के लिए किया गया है। हालांकि, इन विधियों में कोलेजनेज डी और डीनेस आई की एकाग्रता और पाचन समय भिन्न होता है, जिससे असंगत निष्कर्ष निकलते हैं। एसईवी के अन्य उपप्रकारों के सह-फैलाव से बचने के लिए, शोधकर्ताओं ने निस्पंदन और / या अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन8 द्वारा बड़े बाह्य पुटिकाओं (0.1 μm या व्यास में 0.2 μm) को हटा दिया है। स्रोत ऊतक के आधार पर, अलगाव और शुद्धिकरण के विभिन्न तरीकों की आवश्यकता हो सकती है 9,10।
यकृत ऊतक से एसईवी निकालने के लिए पारंपरिक अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि का उपयोग करने से सुपरनैटेंट की सतह पर सफेद पदार्थ की एक परत होती है, इसके गुणों को निर्धारित करने का कोई तरीका नहीं होता है। पिछले अध्ययन11 में, सफेद पदार्थ की यह परत एसईवी की शुद्धता को प्रभावित करने के लिए पाई गई थी। यद्यपि पारंपरिक विधि द्वारा पृथक नमूनों की कण संख्या और प्रोटीन एकाग्रता वर्तमान विधि की तुलना में अधिक थी, भिन्नता का गुणांक बड़ा था, संभवतः क्योंकि कई प्रदूषक परिणामों की खराब पुनरावृत्ति का कारण बन सकते हैं। यही है, डिटर्जेंट का उपयोग करके (यानी, 1% ट्राइटन एक्स -100 में कणों की घुलनशीलता का पता लगाना), हमने पाया कि इस विधि द्वारा प्राप्त एसईवी की शुद्धता अधिक थी। इसलिए, हम प्रोटिओमिक अनुसंधान के लिए कोलोरेक्टल कैंसर ऊतक से प्राप्त एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए इस विधि का उपयोग करते हैं।
वर्तमान में, यकृत कैंसर में एसईवी पर शोध मुख्य रूप से सीरम, प्लाज्मा और सेल कल्चर के सुपरनैटेंट 12,13,14 पर केंद्रित है। हालांकि, यकृत कैंसर ऊतक से प्राप्त एसईवी शारीरिक विकृति और यकृत कैंसर के आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित कर सकते हैं और प्रभावी ढंग से अन्य ईवी15,16 के क्षरण और प्रदूषण से बच सकते हैं। विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के उपयोग के साथ, यह विधि उपज को समृद्ध कर सकती है और उच्च गुणवत्ता वाले एसईवी प्राप्त कर सकती है, जो यकृत कैंसर के आगे के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण आधार प्रदान करती है। यह विधि यकृत कैंसर ऊतक को तेज पृथक्करण द्वारा अलग करने और कोलेजनेज डी और डीनेस आई द्वारा अलग करने में सक्षम बनाती है। फिर, सेलुलर मलबे, बड़े पुटिकाओं और एपोप्टोटिक निकायों को निस्पंदन और अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया जाता है। अंत में, एसईवी को बाद के अध्ययनों के लिए अलग और शुद्ध किया जाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

ऊतक से प्राप्त छोटे बाह्य पुटिका (एसईवी) स्रोत कोशिकाओं की कार्यात्मक स्थिति और ऊतक के अंतरालीय स्थान की विशेषताओं को प्रतिबिंबित कर सकते हैं। इन एसईवी का कुशल संवर्धन उनके जैविक कार्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है और नैदानिक पहचान तकनीकों और चिकित्सीय वाहक प्रौद्योगिकी के विकास की कुंजी है। ऊतक से एसईवी को अलग करना मुश्किल है क्योंकि वे आमतौर पर भारी दूषित होते हैं। यह अध्ययन यकृत कैंसर ऊतक से उच्च गुणवत्ता वाले एसईवी के तेजी से संवर्धन के लिए एक विधि प्रदान करता है। विधि में एक चार-चरण यी प्रक्रिया शामिल है: ऊतक के साथ पाचन एंजाइमों (कोलेजनेज डी और डीनेस ए) का इनक्यूबेशन, 70 μm सेल छन्नी के माध्यम से निस्पंदन, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, और 0.22 μm झिल्ली फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन। विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण के अनुकूलन और निस्पंदन चरण के अतिरिक्त के कारण, इस विधि द्वारा प्राप्त एसईवी की शुद्धता क्लासिक डिफरेंशियल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त की गई तुलना में अधिक है। यह ऊतक-व्युत्पन्न एसईवी के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति और सहायक डेटा प्रदान करता है।

मानव यकृत कैंसर ऊतकों से एसईवी ने यकृत कैंसर के रोगियों के निदान, उपचार और रोग का निदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इस विधि ने यकृत कैंसर के ऊतकों से प्राप्त एसईवी को अलग करने और शुद्ध करने के ल?...

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An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

यहां हम एक अनुकूलित अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि के माध्यम से यकृत कैंसर ऊतक से प्राप्त छोटे बाह्य पुटिकाओं के संवर्धन का वर्णन करते हैं।

यकृत कैंसर ऊतक से प्राप्त छोटे बाह्य पुटिकाओं के लिए एक संवर्धन विधि

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

यह विधि क्लासिक, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त शुद्धता की तुलना में अधिक शुद्धता के साथ यकृत कैंसर ऊतक-व्युत्पन्न छोटे बाह्य पुटिकाओं के अलगाव की अनुमति देती है। यह तकनीक सरल, सुविधाजनक और संचालित करने में आसान है, जो छोटे बाह्य पुटिकाओं के अध्ययन के लिए मेथोलॉजिक समर्थन प्रदान कर सकती है। शुरू करने के लिए, 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से ऊतक का नमूना हटा दें।ऊतक के लगभग 400 मिलीग्राम को बर्फ बॉक्स पर 10 सेंटीमीटर सेल कल्चर डिश में रखें, और ऊतक को स्केलपेल के साथ बारीक कीमा करें। ऊतक को पाचन समाधान के 1.5 मिलीलीटर के साथ छह-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें। फिर, प्लेट को ट्रांसफ़रेंस डिकलरिंग शेकर पर रखें, और यकृत कैंसर ऊतक के पूर्ण पृथक्करण और छोटे बाह्य पुटिकाओं, या एसईवी की रिहाई के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन बाद, बर्फ के बॉक्स पर छह-वेल प्लेट रखें। पाचन को रोकने के लिए फॉस्फेट अवरोधक के 80 माइक्रोलीटर और पूर्ण प्रोटीज अवरोधक समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर, पाचन समाधान को दो-मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर रखे गए 70-माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर में स्थानांतरित करें, और किसी भी बड़े ऊतक मलबे को हटाने के लिए इसे धीरे-धीरे फ़िल्टर करें।छोटे ऊतक मलबे को हटाने के लिए 10 मिनट के लिए 500 ग्राम पर छानना, और एक नई दो मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सतह पर तैरने वाला एकत्र करना। सेल मलबे को हटाने के लिए 20 मिनट के लिए 3,000 ग्राम पर सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक एक नई सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जब तक कि पिपेट की नोक नीचे सफेद मलबे को छूने वाली न हो।शेष तरल के सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराने के बाद, मलबे को परेशान किए बिना ट्यूब में सतह पर तैरने वाले को पूल करें। एकत्रित सुपरनैटेंट को 20 मिनट के लिए 12,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट के 900 माइक्रोलीटर को 4.7 मिलीमीटर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष तरल के सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं, और फिर दोनों सुपरनैटेंट को एक ही अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और मिलाएं।ट्यूब को पूरी तरह से पीबीएस से भरें। 60 मिनट के लिए 100,000 ग्राम पर सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्यागने के बाद, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को पीबीएस से भरकर गोली को फिर से निलंबित करें।सेंट्रीफ्यूजेशन को 60 मिनट के लिए 100,000 ग्राम पर दोहराने के बाद, पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें। एक-मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का उपयोग करके एसईवी निलंबन को एस्पिरेट करें, और इसे 0.22-माइक्रोमीटर झिल्ली फ़िल्टर के माध्यम से 600-माइक्रोलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें। आगे के विश्लेषण के लिए छानने को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।एसईवी के आकार वितरण और शुद्धता को निर्धारित करने के लिए एक नैनोपार्टिकल प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करें। सफाई समाधान की मात्रा की जांच करें। फिर, म्यान और अपशिष्ट तरल के स्तर के बीच अंतर पर ध्यान दें।उपकरण की मुख्य बिजली आपूर्ति चालू करने के 20 सेकंड के बाद, कंप्यूटर चालू करें। बीप्स की प्रतीक्षा करें जो दर्शाता है कि उपकरण सॉफ्टवेयर चलाने के लिए ठीक से जुड़ा हुआ है। कैमरा, लेजर और एयर पंप चालू करने के लिए स्टार्ट अप पर क्लिक करें।इसके बाद, शीथ फ्लो पर क्लिक करें, और लोडिंग प्लेटफॉर्म पर स्टार्ट अप का चयन करें। चार मिनट के बाद, नमूना और बूस्टिंग पर क्लिक करें, और फिर नमूना में अनलोड का चयन करें। 30 सेकंड के बाद, खाली ट्यूब को लोडिंग प्लेटफॉर्म पर रखें।नमूना पर क्लिक करें, बूस्टिंग का चयन करें, और तब नमूना में अनलोड का चयन करें। फिर, अल्ट्राप्योर पानी युक्त ट्यूब को लोडिंग प्लेटफॉर्म पर रखें। इसके साथ ही, नमूना और बूस्टिंग पर क्लिक करें, इसके बाद शीथ फ्लो और पर्ज।मैन्युअल ऑपरेशन पर क्लिक करें, और कण एकाग्रता ट्यूब को लोडिंग प्लेटफॉर्म पर रखें। फिर, नमूना पर क्लिक करें, एक मिनट के लिए बूस्टिंग का चयन करें, और एक साथ नमूना जानकारी में 250 नैनोमीटर मानक फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोस्फीयर गुणवत्ता नियंत्रण का चयन करें। नमूना से नमूनाकरण का चयन करें, और एसपीसीएम पर क्लिक करके डिटेक्टर को चालू करें।फिर, ऑटो सैंपलिंग पर क्लिक करें, और एक किलोपास्कल पर दबाव को ठीक करने के लिए नमूनाकरण सेट में 1.0 दर्ज करें। उपकरण पट्टी पर क्लिक करें, और बड़े सिग्नल का चयन करें। लेजर की क्षैतिज स्थिति समायोजित करें, और लेजर को दो माइक्रोमीटर पर सेट करें।फिर, यह सुनिश्चित करने के लिए एल और आर पर लगातार क्लिक करें कि सिग्नल मजबूत और समान है। डेटा एकत्र करने के लिए टाइम टू रिकॉर्ड पर क्लिक करें, जो समाप्त होने पर स्वचालित रूप से बफर में कूद जाता है। उसके बाद, डेटा को NFA फ़ाइल में सहेजें, और अनलोड का चयन करने के लिए नमूना पर क्लिक करें।लोडिंग प्लेटफॉर्म पर सफाई समाधान ट्यूब रखें। नमूना पर क्लिक करें, बूस्टिंग का चयन करें, और एक मिनट के बाद नमूना और अनलोड पर क्लिक करें। केशिका सिरे से अवशिष्ट सफाई समाधान को हटाने के लिए अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करें।कण आकार मानक ट्यूब को लोडिंग प्लेटफॉर्म पर रखें, और एक मिनट के लिए नमूना बूस्टिंग पर क्लिक करें। नमूना जानकारी में 68 से 155 S16M-Exo गुणवत्ता नियंत्रण का चयन करें, और नमूना पर क्लिक करें, फिर नमूनाकरण। इसके बाद, टूलबार पर क्लिक करें, और छोटे सिग्नल का चयन करें।डेटा एकत्र करने के लिए टाइम टू रिकॉर्ड पर क्लिक करें, जो समाप्त होने पर स्वचालित रूप से बफर में कूद जाता है। फिर, डेटा को NFA फ़ाइल में सहेजें, और अनलोड का चयन करने के लिए नमूना पर क्लिक करें। सफाई समाधान के साथ अवशेषों को हटाने के बाद, पीबीएस ट्यूब को लोडिंग प्लेटफॉर्म पर रखें, और कण आकार मानक ट्यूब के लिए प्रदर्शित चरणों का प्रदर्शन करें।इसके बाद, केशिका टिप को साफ करें जैसा कि पहले दिखाया गया है, और कण आकार मानक ट्यूब के लिए पहले वर्णित डेटा का विश्लेषण करने के लिए एसईवी नमूना लोड करें। शुद्ध एसईवी की एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत जांच की गई, जिसने कप के आकार के आकार के आकृति विज्ञान के साथ एसईवी की उपस्थिति का खुलासा किया। एसईवी के लिए फ्लो साइटोमेट्री की गई थी।और कण का आकार 40 से 200 नैनोमीटर तक था, और औसत कण आकार 89 नैनोमीटर था। समृद्ध एसईवी की शुद्धता 68.32% पाई गई, सीडी 63, सीडी 9 और टीएसजी 101 जैसे एसईवी के प्रोटीन मार्करों का पता वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा लगाया गया था। जीएम 130 का उपयोग एसईवी के नकारात्मक नियंत्रण मार्कर के रूप में किया गया था, जो ऊतक कोशिकाओं में पाया गया था लेकिन एसईवी में नहीं।छोटे बाह्य पुटिकाओं की शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए अत्यंत सावधानी के साथ एंजाइमेटिक पाचन, अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और झिल्ली निस्पंदन के चरणों को करना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

ली-Fraumeni सिंड्रोम रोगी-व्युत्पंन प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग ऑस्टियो मॉडलिंग

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

पूरे ऊतक से Extracellular बुलबुले के निष्कर्षण

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Extracellular मैट्रिक्स hydrogels का उपयोग कर सामान्य ऊतक विकिरण प्रभाव का अध्ययन

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

स्थानिक और अस्थाई Mutant मेलेनोमा के नियंत्रण से उत्परिवर्ती Melanocyte स्टेम कोशिकाओं

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

भ्रूणीय स्टेम सेल से ग्रेनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक ले जाने वाले एक्सोसोम-समृद्ध एक्सेलरुलर वेसिकल्स का अलगाव

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

ऑर्थोटोपिक स्तन कैंसर मॉडल का उपयोग कर ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर का अध्ययन

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों और सीरम-व्युत्पन्न एक्सोसोम्स से कैस्टेशन-प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर रोगियों से छोटे गैर-कोडिंग आरएनए को अनुक्रमित करना

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

विस्तार और गामा-डेल्टा का संवर्धन (ππ) T कोशिकाओं Apheresed मानव उत्पाद से

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Vivo में इम्युनोजेनेसिटी स्प्लेनिक टी कोशिकाओं के प्रवाह Cytometry द्वारा ट्यूमर व्युत्पन्न बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं की स्क्रीनिंग

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा में ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन की जांच करने के लिए एक त्रि-आयामी गोलाकार मॉडल

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...