Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

Gli autori ringraziano il First Affiliated Hospital della Gannan Medical University per aver sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82260422).

Il tessuto del cancro del fegato umano è stato raccolto da pazienti con diagnosi di malignità epatica presso il primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Tutti i pazienti hanno firmato un modulo di consenso informato e la raccolta di campioni di tessuto umano è stata approvata dal comitato etico del primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo pro...

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	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Questo protocollo descrive un metodo ripetibile per estrarre i sEV dal tessuto del cancro del fegato. I sEV di alta qualità sono ottenuti mediante isolamento dei tessuti acuti, trattamento con enzimi digestivi, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione e purificazione della membrana filtrante da 0,22 μm. Per l'analisi a valle, è estremamente importante garantire l'elevata purezza dei sEV. Nel processo di centrifugazione differenziale, uno strato di sostanze bianche (composizione sconosciuta) apparirà sulla sup...

Le piccole vescicole extracellulari (sEV) hanno un diametro di circa 30-150 nm e sono secrete da varie cellule1. Possono comunicare con le cellule dei tessuti e regolare il microambiente locale o distante trasportando importanti molecole biologiche come lipidi, proteine, DNA e RNA a vari organi, tessuti, cellule e parti intracellulari. Pertanto, possono anche modificare il comportamento delle celle riceventi 2,3. L'isolamento e la purificazione di specifici sEV è un prerequisito essenziale per studiare il loro comportamento biologico durante lo sviluppo e il decorso della malattia. L'ultracentrifugazione differenziale, considerata il gold standard, è comunemente usata per separare i sEV dai tessuti in cui risiedono normalmente4. Detriti tissutali, detriti cellulari, grandi vescicole e corpi apoptotici possono essere rimossi con questa tecnica, lasciando solo i sEV.
È stato dimostrato che la collagenasi D e la DNasi I non influenzano le caratteristiche molecolari delle cellule o delle vescicole, con le proprietà di entrambi gli enzimi che contribuiscono al rilascio di vescicole nella matrice extracellulare 5. Questi enzimi sono stati utilizzati per estrarre sEVs dal tessuto melanoma metastatico umano, dal tessuto del cancro del colon e dal tessuto della mucosa del colon 5,6,7. Tuttavia, la concentrazione e il tempo di digestione della collagenasi D e della DNasi I in questi metodi differiscono, portando a conclusioni incoerenti. Per evitare la coprecipitazione di altri sottotipi di sEV, i ricercatori hanno rimosso vescicole extracellulari più grandi (0,1 μm o 0,2 μm di diametro) mediante filtrazione e/o centrifugazione differenziale8. A seconda del tessuto di origine, possono essere necessari diversi metodi di isolamento e purificazione 9,10.
Utilizzando il tradizionale metodo di ultracentrifugazione differenziale per estrarre i sEV dal tessuto epatico si ottiene uno strato di sostanza bianca sulla superficie del surnatante, senza alcun modo di determinarne le proprietà. In uno studio precedente11, questo strato di sostanza bianca è stato trovato per influenzare la purezza dei sEV. Sebbene il numero di particelle e la concentrazione proteica dei campioni isolati con il metodo tradizionale fossero superiori a quelli del metodo attuale, il coefficiente di variazione era elevato, probabilmente perché molti inquinanti possono portare a una scarsa ripetibilità dei risultati. Cioè, usando il detergente (cioè, rilevando la solubilità delle particelle in 1% Triton X-100), abbiamo scoperto che la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo era maggiore. Quindi, usiamo questo metodo per isolare e purificare i sEV derivati dal tessuto del cancro del colon-retto per la ricerca proteomica.
Attualmente, la ricerca sulle EV nel cancro del fegato si concentra principalmente sul siero, sul plasma e sul surnatante della coltura cellulare12,13,14. Tuttavia, le sEV derivate dal tessuto del cancro del fegato possono riflettere più accuratamente la patologia fisiologica e il microambiente circostante del cancro del fegato ed evitare efficacemente la degradazione e l'inquinamento di altri EV15,16. Con l'uso dell'ultracentrifugazione differenziale, questo metodo può arricchire la resa e ottenere sEV di alta qualità, fornendo una base importante per l'ulteriore studio del cancro del fegato. Questo metodo consente al tessuto del cancro del fegato di essere separato da una netta separazione e di essere dissociato dalla collagenasi D e DNasi I. Quindi, i detriti cellulari, le grandi vescicole e i corpi apoptotici vengono ulteriormente rimossi mediante filtrazione e ultracentrifugazione differenziale. Infine, i sEV vengono isolati e purificati per studi successivi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate dal tessuto possono riflettere lo stato funzionale delle cellule sorgente e le caratteristiche dello spazio interstiziale del tessuto. L'arricchimento efficiente di questi veicoli elettrici è un prerequisito importante per lo studio della loro funzione biologica e una chiave per lo sviluppo di tecniche di rilevamento clinico e tecnologia di supporto terapeutico. È difficile isolare i sEV dal tessuto perché di solito sono fortemente contaminati. Questo studio fornisce un metodo per il rapido arricchimento di sEV di alta qualità dal tessuto del cancro del fegato. Il metodo prevede un processo in quattro fasi: l'incubazione di enzimi digestivi (collagenasi D e DNasi Ι) con tessuto, filtrazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Grazie all'ottimizzazione della fase di ultracentrifugazione differenziale e all'aggiunta di una fase di filtrazione, la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo è superiore a quella ottenuta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Fornisce un'importante metodologia e dati di supporto per lo studio dei sEV derivati dai tessuti.

Le sEV provenienti da tessuti di cancro del fegato umano hanno svolto un ruolo cruciale nella diagnosi, nel trattamento e nella prognosi dei pazienti con cancro al fegato. Questo metodo ha utilizzato strumenti di laboratorio comuni per isolare e purificare i sEV derivati dai tessuti del cancro del fegato; ciò può fornire un supporto metodologico per lo studio delle EV. La Figura 2 illustra il processo generale di arricchimento delle EV dai tessuti del cancro del fegato. Le sEV negli spazi ...

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An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.

Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Questo metodo consente l'isolamento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato con una purezza superiore a quella raggiunta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Questa tecnologia è semplice, conveniente e facile da usare, che può fornire supporto metodologico per lo studio di piccole vescicole extracellulari. Per iniziare, rimuovere il campione di tessuto dal congelatore a 80 gradi Celsius.Posizionare circa 400 milligrammi di tessuto in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri sulla ghiacciaia e tritare finemente il tessuto con un bisturi. Trasferire il tessuto in una piastra a sei pozzetti con 1,5 millilitri della soluzione digestiva. Quindi, posizionare la piastra sullo shaker di decolorazione del transfert e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti per la completa dissociazione del tessuto del cancro del fegato e il rilascio delle piccole vescicole extracellulari o sEV.Dopo l'incubazione, posizionare la piastra a sei pozzetti sulla ghiacciaia. Aggiungere 80 microlitri di inibitore della fosfatasi e 200 microlitri di soluzione completa di inibitore della proteasi per fermare la digestione. Quindi, trasferire la soluzione digestiva in un filtro cellulare da 70 micrometri posto su un tubo da centrifuga da due millilitri e filtrarlo lentamente per rimuovere eventuali detriti di tessuto di grandi dimensioni.Centrifugare il filtrato a 500 g per 10 minuti per rimuovere i piccoli detriti tissutali e raccogliere il surnatante in una nuova provetta da centrifuga da due millilitri. Centrifugare il surnatante a 3.000 g per 20 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da centrifuga fino a quando la punta della pipetta sta per toccare i detriti bianchi sul fondo.Dopo aver ripetuto la centrifugazione del liquido rimanente, raggruppare il surnatante nel tubo senza disturbare i detriti. Centrifugare il surnatante raccolto a 12.000 g per 20 minuti e trasferire 900 microlitri di surnatante in una provetta ultracentrifuga da 4,7 millimetri. Ripetere la centrifugazione del liquido rimanente, quindi raccogliere e mescolare entrambi i surnatanti nello stesso tubo di ultracentrifuga.Riempire completamente il tubo con PBS. Centrifugare il surnatante a 100.000 g per 60 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet riempiendo il tubo ultracentrifuga con PBS.Dopo aver ripetuto la centrifugazione a 100.000 g per 60 minuti, risospendere il pellet con 50 microlitri di PBS. Aspirare la sospensione sEV utilizzando una siringa sterile da un millilitro e filtrarla attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri in una provetta da centrifuga da 600 microlitri. Conservare il filtrato a 80 gradi Celsius per ulteriori analisi.Utilizzare un citometro a flusso di nanoparticelle per determinare la distribuzione dimensionale e la purezza dei sEV. Controllare il volume della soluzione detergente. Quindi, notare la differenza tra i livelli della guaina e del liquido di scarto.Dopo 20 secondi dall'accensione dell'alimentatore principale dello strumento, accendere il computer. Attendere i segnali acustici che indicano che lo strumento è collegato correttamente per eseguire il software. Fare clic su Start Up per accendere la fotocamera, il laser e la pompa dell'aria.Quindi, fare clic su Sheath Flow e selezionare Start Up.Posizionare l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Dopo quattro minuti, fare clic su Campione e potenziamento, quindi selezionare Scarica nel campione. Dopo 30 secondi, posizionare il tubo bianco sulla piattaforma di carico.Fare clic su Campione, selezionare Boosting, quindi selezionare Scarica nel campione. Quindi, posizionare il tubo contenente l'acqua ultrapura sulla piattaforma di carico. Contemporaneamente, fai clic su Campione e Boosting, seguito da Sheath Flow e Purge.Fare clic su Operazione manuale e posizionare il tubo di concentrazione delle particelle sulla piattaforma di carico. Quindi, fare clic su Campione, selezionare Potenziamento per un minuto e contemporaneamente selezionare Controllo di qualità delle nanosfere di silice fluorescente standard a 250 nanometri in Informazioni campione. Selezionare Campionamento da campione e accendere il rilevatore facendo clic su SPCM.Quindi, fai clic su Campionamento automatico e inserisci 1.0 in Set di campionamento per fissare la pressione a un kilopascal. Fare clic sulla barra degli strumenti e selezionare Segnale grande. Regolare la posizione orizzontale del laser e impostare il laser su due micrometri.Quindi, fai clic continuamente su L e R per assicurarti che il segnale sia forte e uniforme. Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che passa automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in File NFA e fare clic su Campione per selezionare Scarica.Posizionare il tubo della soluzione detergente sulla piattaforma di carico. Fare clic su Campione, selezionare Boosting e dopo un minuto fare clic su Campione e scarica. Utilizzare acqua ultrapura per rimuovere la soluzione detergente residua dalla punta capillare.Posizionare il tubo standard di dimensioni delle particelle sulla piattaforma di carico e fare clic su Sample Boosting per un minuto. Selezionare il controllo di qualità da 68 a 155 S16M-Exo in Informazioni campione e fare clic su Campione, quindi su Campionamento. Quindi, fai clic sulla barra degli strumenti e seleziona Piccolo segnale.Fare clic su Time to Record per raccogliere i dati, che passa automaticamente a Buffer al termine. Quindi, salvare i dati in un file Nfa e fare clic su Campione per selezionare Scarica. Dopo aver rimosso i residui con la soluzione detergente, posizionare il tubo PBS sulla piattaforma di carico ed eseguire i passaggi dimostrati per il tubo standard di granulometria.Quindi, pulire la punta capillare come dimostrato in precedenza e caricare il campione sEV per analizzare i dati descritti in precedenza per il tubo standard di dimensione delle particelle. I sEV purificati sono stati esaminati al microscopio elettronico a trasmissione, che ha rivelato la presenza di sEV con una morfologia a forma di coppa. È stata effettuata la citometria a flusso per i sEV.E la dimensione delle particelle variava da 40 a 200 nanometri, e la dimensione media delle particelle era di 89 nanometri. La purezza dei sEV arricchiti è risultata essere del 68,32%I marcatori proteici di sEV come CD63, CD9 e TSG101 sono stati rilevati dal western blot. GM130 è stato utilizzato come marcatore di controllo negativo dei sEV, che è stato trovato nelle cellule tissutali ma non nei sEV.È fondamentale eseguire le fasi della digestione enzimatica, dell'ultracentrifugazione differenziale e della filtrazione a membrana con la massima cura per garantire la purezza delle piccole vescicole extracellulari.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Estrazione delle vescicole extracellulari dal tessuto intero

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studiare i normali effetti di radiazione dei tessuti utilizzando idrogel a matrice extracellulare

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Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolamento di vescicole extracellulari arricchite con esosomi che trasportano il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi da cellule staminali embrionali

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Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studiare il cancro al seno triplo negativo utilizzando il modello di cancro al seno ortotopico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

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Sequenziamento di piccoli RNA non codificanti da tessuti fissati in formalina ed esosomi derivati dal siero da pazienti affetti da cancro alla prostata resistenti alla castrazione

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Screening di immunogenicità delle vescicole extracellulari derivate dal tumore mediante citometria a flusso delle cellule T della milza

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...