Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
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著者らは、この研究を支援してくれた甘南医科大学第一付属病院に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82260422)の支援を受けました。

ヒト肝癌組織は、甘南医科大学第一附属病院で肝悪性腫瘍と診断された患者から採取されました。すべての患者がインフォームドコンセントフォームに署名し、ヒト組織サンプルの収集は甘南医科大学第一付属病院の倫理委員会によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料の表 を参照してく...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

このプロトコルは、肝臓癌組織からsEVを抽出するための再現性のある方法について説明しています。高品質のsEVは、鋭い組織分離、消化酵素による処理、差動超遠心分離、および0.22μmフィルター膜ろ過および精製によって得られます。ダウンストリーム分析では、sEVの高純度を確保することが非常に重要です。差動遠心分離の過程で、上清の表面に白い物質(未知の組成)の層が現れます。こ?...

小さな細胞外小胞(sEV)は、直径が約30 nmから150 nmで、さまざまな細胞から分泌されます1。それらは組織細胞と通信し、脂質、タンパク質、DNA、RNAなどの重要な生体分子をさまざまな臓器、組織、細胞、および細胞内部分に輸送することにより、局所または遠隔の微小環境を調節することができます。したがって、それらはまた、受信者セル2、3の挙動を変えることができる。特定のsEVの単離と精製は、病気の発症および経過中の生物学的挙動を研究するための不可欠な前提条件です。ゴールドスタンダードと見なされている差動超遠心分離は、sEVを通常存在する組織から分離するために一般的に使用されます4。組織破片、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、sEVのみを残してこの技術によって除去することができます。
コラゲナーゼDおよびDNaseIは、細胞または小胞の分子特性に影響を及ぼさないことが示されており、両方の酵素の特性が細胞外マトリックス5における小胞の放出に寄与する。これらの酵素は、ヒト転移性黒色腫組織、結腸癌組織、および結腸粘膜組織からsEVを抽出するために使用されています5、6、7。しかし、これらの方法におけるコラゲナーゼDとDNase Iの濃度と消化時間は異なり、一貫性のない結論につながります。他のサブタイプのsEVの共沈を避けるために、研究者はろ過および/または示差遠心分離によってより大きな細胞外小胞(直径0.1 μmまたは0.2 μm)を除去しました8。ソース組織に応じて、単離および精製の異なる方法が必要とされる場合がある9、10。
従来の差動超遠心分離法を使用して肝臓組織からsEVを抽出すると、上清の表面に白質の層が形成され、その特性を決定する方法はありません。以前の研究11では、この白質の層がsEVの純度に影響を与えることがわかりました。従来の方法で分離されたサンプルの粒子数とタンパク質濃度は現在の方法よりも高かったが、多くの汚染物質が結果の再現性を低下させる可能性があるため、変動係数は大きかった。すなわち、洗剤を用いて(すなわち、1%Triton X-100中の粒子の溶解度を検出する)と、この方法で得られたsEVの純度が高いことを見出した。そこで、この方法を用いて大腸がん組織由来のsEVを単離・精製し、プロテオミクス研究を行っています。
現在、肝臓がんにおけるsEVの研究は、主に血清、血漿、および細胞培養の上清に焦点を当てています12,13,14。しかし、肝臓がん組織由来のsEVは、肝臓がんの生理学的病理と周囲の微小環境をより正確に反映し、他のEVの劣化や汚染を効果的に回避することができます15,16。示差超遠心法を使用することで、この方法は収量を豊かにし、高品質のsEVを得ることができ、肝臓がんのさらなる研究のための重要な基礎を提供します。この方法により、肝癌組織を鋭利な分離により分離し、コラゲナーゼDおよびDNaseIによって解離させることができます。次いで、細胞破片、大きな小胞、およびアポトーシス小体は、濾過および示差超遠心分離によってさらに除去される。最後に、sEVは後の研究のために分離および精製されます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

組織由来の小さな細胞外小胞(sEV)は、ソース細胞の機能状態と組織の間質空間の特性を反映することができます。これらのsEVの効率的な濃縮は、それらの生物学的機能の研究にとって重要な前提条件であり、臨床検出技術と治療キャリア技術の開発の鍵です。sEVは通常ひどく汚染されているため、組織から分離することは困難です。この研究は、肝癌組織から高品質のsEVを迅速に濃縮する方法を提供します。この方法には、消化酵素(コラゲナーゼDおよびDNase Ι)と組織とのインキュベーション、70 μmセルストレーナーによるろ過、差動超遠心分離、および0.22 μmメンブレンフィルターによるろ過の4段階のプロセスが含まれます。差動超遠心分離ステップの最適化とろ過ステップの追加により、この方法で得られるsEVの純度は、従来の示差超遠心分離によって達成されるものよりも高くなります。これは、組織由来sEVの研究のための重要な方法論と裏付けとなるデータを提供します。

ヒト肝がん組織由来のsEVは、肝臓がん患者の診断、治療、予後において重要な役割を果たしてきました。この方法では、一般的な実験機器を使用して、肝臓がん組織に由来するsEVを分離および精製しました。これは、sEVの研究に方法論的サポートを提供する可能性があります。図2は、肝がん組織からsEVを濃縮する一般的なプロセスを示しています。組織の細胞間空間に...

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An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。

肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

この方法は、肝臓癌組織由来の小さな細胞外小胞を、古典的な差動超遠心分離によって達成されるものよりも高い純度で単離することを可能にする。この技術は、シンプルで便利で操作が簡単で、小さな細胞外小胞の研究に方法論的サポートを提供できます。まず、80°Cの冷凍庫から組織サンプルを取り出します。アイスボックス上の10センチの細胞培養皿に約400ミリグラムの組織を入れ、メスで細かく刻みます。組織を1.5ミリリットルの消化液を含む6ウェルプレートに移します。次に、プレートを転移脱色シェーカーに置き、摂氏37度で20分間インキュベートして、肝臓がん組織を完全に解離させ、小さな細胞外小胞(sEV)を放出します。インキュベーション後、6ウェルプレートをアイスボックスに置きます。80マイクロリットルのホスファターゼ阻害剤と200マイクロリットルの完全プロテアーゼ阻害剤溶液を加えて消化を停止します。次に、消化液を2ミリリットルの遠沈管に置いた70マイクロメートルのセルストレーナーに移し、ゆっくりとろ過して大きな組織の破片を取り除きます。ろ液を500gで10分間遠心分離して小さな組織片を取り除き、新しい2ミリリットルの遠沈管に上清を回収します。上清を3, 000 gで20分間遠心分離して、細胞破片を除去します。ピペットの先端が底部の白い破片に触れるまで、上清を新しい遠心チューブに慎重に移します。残りの液体の遠心分離を繰り返した後、破片を乱すことなく上清をチューブにプールします。回収した上清を12, 000 gで20分間遠心分離し、900マイクロリットルの上清を4.7ミリメートルの超遠心管に移します。残りの液体の遠心分離を繰り返し、両方の上清を集めて同じ超遠心チューブに混合します。チューブをPBSで完全に満たします。上清を100, 000 gで60分間遠心分離します。上清を廃棄した後、超遠心チューブにPBSを充填してペレットを再懸濁する。100, 000gで60分間遠心分離を繰り返した後、ペレットを50マイクロリットルのPBSで再懸濁する。1ミリリットルの滅菌シリンジでsEV懸濁液を吸引し、0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターを通して600マイクロリットルの遠沈管にろ過します。さらなる分析のために、ろ液を摂氏80度で保管してください。ナノ粒子フローサイトメーターを使用して、sEVのサイズ分布と純度を測定します。洗浄液の量を確認してください。次に、シースと廃液のレベルの違いに注意してください。機器の主電源を20秒間オンにした後、コンピューターの電源を入れます。ソフトウェアを実行するには、機器が正しく接続されていることを示すビープ音が鳴るのを待ちます。[スタートアップ]をクリックして、カメラ、レーザー、エアポンプの電源を入れます。次に、シースフローをクリックし、起動を選択します。4 分後、[サンプルとブースト] をクリックし、[サンプルでアンロード] を選択します。30秒後、ブランクチューブをローディングプラットフォームに置きます。[サンプル] をクリックし、[ブースティング] を選択して、[サンプルでアンロード] を選択します。次に、超純水の入ったチューブを荷台に置きます。同時に、[サンプル]と[ブースト]をクリックし、続いて[シースフロー]と[パージ]をクリックします。手動操作をクリックし、粒子濃縮チューブをローディングプラットフォームに置きます。次に、[サンプル]をクリックし、[1分間ブースト]を選択し、同時に[サンプル情報]で250ナノメートルの標準蛍光シリカナノスフィアの品質管理を選択します。[サンプルからのサンプリング]を選択し、SPCMをクリックして検出器をオンにします。次に、[自動サンプリング]をクリックし、[サンプリングセット]に1.0と入力して、圧力を1キロパスカルに固定します。ツールバーをクリックし、[大信号]を選択します。レーザーの水平位置を調整し、レーザーを2マイクロメートルに設定します。次に、LとRを継続的にクリックして、信号が強く均一であることを確認します。[記録する時間]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データを Nfa ファイルに保存し、[サンプル] をクリックして [アンロード] を選択します。洗浄液チューブをローディングプラットフォームに置きます。[サンプル]をクリックし、[ブースト]を選択し、1分後に[サンプル]と[アンロード]をクリックします。超純水を使用して、キャピラリーチップから残留洗浄液を除去します。粒子サイズの標準チューブをローディングプラットフォームに置き、サンプルブーストを1分間クリックします。サンプル情報で68〜155 S16M-Exo品質管理を選択し、[サンプル]、[サンプリング]の順にクリックします。次に、ツールバーをクリックして、[小信号]を選択します。[記録する時間]をクリックしてデータを収集すると、終了すると自動的に[バッファ]にジャンプします。次に、データを Nfa ファイルに保存し、[サンプル] をクリックして [アンロード] を選択します。洗浄液で残留物を除去した後、PBSチューブをローディングプラットフォームに置き、粒子サイズ標準チューブについて実証された手順を実行します。次に、前に示したようにキャピラリーチップを洗浄し、sEVサンプルをロードして、粒子サイズ標準チューブについて前述のデータを分析します。精製したsEVを透過型電子顕微鏡で調べたところ、カップ状の形態を持つsEVの存在が明らかになりました。sEVのフローサイトメトリーを実施した。また、粒子サイズは40〜200ナノメートルの範囲であり、平均粒子サイズは89ナノメートルでした。濃縮されたsEVの純度は68.32%であることが判明しましたCD63、CD9、TSG101などのsEVのタンパク質マーカーはウェスタンブロットによって検出されました。GM130はsEVの陰性対照マーカーとして使用され、組織細胞には見られましたが、sEVには見られませんでした。酵素消化、示差超遠心、膜ろ過のステップは、小さな細胞外小胞の純度を確保するために細心の注意を払って実行することが重要です。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

全体組織からの細胞の小胞の抽出

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

胚性幹細胞からの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

インビボ 脾臓T細胞のフローサイトメトリーによる腫瘍由来細胞外小胞の免疫原性スクリーニング

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...