Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
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저자들은 이 작업을 지원해 준 간난 의과대학 제1부속병원에 감사를 표한다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 82260422)의 지원을 받았습니다.

인간 간암 조직은 간난 의과 대학 제 1 부속 병원에서 간암 진단을받은 환자로부터 수집되었습니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의서에 서명했으며 인체 조직 샘플 수집은 간난 의과대학 제1부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 준비
...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

이 프로토콜은 간암 조직에서 sEV를 추출하는 반복 가능한 방법을 설명합니다. 고품질 sEV는 날카로운 조직 분리, 소화 효소 처리, 차등 초원심분리, 0.22μm 필터 멤브레인 여과 및 정제를 통해 얻을 수 있습니다. 다운스트림 분석의 경우 sEV의 고순도를 보장하는 것이 매우 중요합니다. 차등 원심 분리 과정에서 상청액 표면에 백색 물질 층 (알려지지 않은 조성)이 나타납니다. 이 층은 sEV를 오염시킬 ?...

작은 세포외 소포체(sEV)는 직경이 약 30nm에서 150nm이며 다양한 세포에서 분비된다1. 그들은 지질, 단백질, DNA 및 RNA와 같은 중요한 생물학적 분자를 다양한 기관, 조직, 세포 및 세포 내 부분으로 운반하여 조직 세포와 통신하고 국소 또는 먼 미세 환경을 조절할 수 있습니다. 따라서, 그들은 또한 수신자 셀(2,3)의 동작을 변경할 수 있다. 특정 sEV의 분리 및 정제는 질병의 발달 및 경과 동안 생물학적 거동을 연구하기 위한 필수 전제 조건입니다. 금본위제로 간주되는 차등 초원심분리는 일반적으로 sEV가 일반적으로 상주하는 조직에서 분리하는 데 사용됩니다4. 조직 파편, 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 이 기술로 제거할 수 있으며 sEV만 남습니다.
콜라게나제 D와 DNase I은 세포나 소포의 분자적 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 두 효소의 특성은 세포외 기질에서 소포의 방출에 기여한다 5. 이 효소는 인간 전이성 흑색종 조직, 결장암 조직 및 결장 점막 조직에서 sEV를 추출하는 데 사용되었습니다 5,6,7. 그러나 이러한 방법에서 콜라게나제 D와 DNase I의 농도와 소화 시간이 다르기 때문에 일관성 없는 결론이 도출됩니다. 다른 유형의 sEV가 공침되는 것을 피하기 위해, 연구자들은 여과 및/또는 차등 원심분리를 통해 더 큰 세포밖 소포(직경 0.1 μm 또는 0.2 μm)를 제거했다8. 근원 조직에 따라, 다른 분리 및 정제 방법이 요구될 수 있다 9,10.
전통적인 차등 초원심분리 방법을 사용하여 간 조직에서 sEV를 추출하면 상등액 표면에 백질층이 생성되지만 그 특성을 결정할 방법이 없습니다. 이전 연구11에서 이 백질층은 sEV의 순도에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 기존 방법으로 분리한 샘플의 입자 수와 단백질 농도는 현재 방법보다 높았지만 변동 계수가 컸는데, 이는 많은 오염 물질이 결과의 반복성을 저하시킬 수 있기 때문일 수 있습니다. 즉, 세제를 사용하여(즉, 1% Triton X-100에서 입자의 용해도를 검출), 이 방법으로 얻은 sEV의 순도가 더 크다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 이 방법을 사용하여 단백체 연구를 위해 대장암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제합니다.
현재 간암에서 sEV에 대한 연구는 주로 혈청, 혈장 및 세포 배양의 상층액12,13,14에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 간암 조직에서 유래한 sEV는 간암의 생리학적 병리 및 주변 미세 환경을 보다 정확하게 반영할 수 있으며 다른 EV의 분해 및 오염을 효과적으로 방지할 수 있습니다15,16. 차등 초원심분리를 사용하여 이 방법은 수율을 높이고 고품질 sEV를 얻을 수 있어 간암에 대한 추가 연구를 위한 중요한 기반을 제공합니다. 이 방법은 간암 조직이 날카로운 분리에 의해 분리되고 콜라게나제 D와 DNase I에 의해 해리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 여과 및 차등 초원심분리에 의해 추가로 제거됩니다. 마지막으로, sEV는 이후 연구를 위해 분리 및 정제됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

조직에서 유래한 작은 세포외 소포(sEV)는 소스 세포의 기능 상태와 조직의 간질 공간의 특성을 반영할 수 있습니다. 이러한 sEV의 효율적인 농축은 생물학적 기능 연구의 중요한 전제 조건이며 임상 검출 기술 및 치료용 운반체 기술 개발의 핵심입니다. sEV는 일반적으로 심하게 오염되어 있기 때문에 조직에서 분리하기가 어렵습니다. 이 연구는 간암 조직에서 고품질 sEV를 빠르게 농축하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 소화 효소(콜라게나제 D 및 DNase Ι)를 조직과 배양하고, 70μm 세포 여과기를 통한 여과, 차등 초원심분리, 0.22μm 멤브레인 필터를 통한 여과의 4단계 공정을 포함합니다. 차동 초원심분리 단계의 최적화와 여과 단계의 추가로 인해, 이 방법에 의해 얻어진 sEV의 순도는 고전적인 차동 초원심분리에 의해 달성된 것보다 더 높다. 조직 유래 sEV 연구를 위한 중요한 방법론과 지원 데이터를 제공합니다.

인간 간암 조직의 sEV는 간암 환자의 진단, 치료 및 예후에 중요한 역할을 했습니다. 이 방법은 일반적인 실험실 장비를 사용하여 간암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제했습니다. 이것은 sEV 연구에 대한 방법론적 지원을 제공할 수 있습니다. 그림 2는 간암 조직에서 sEV를 농축하는 일반적인 과정을 보여줍니다. 조직의 세포간 공간에 있는 sEV는 조직 절단과 효소 가수분해?...

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An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

이 방법을 사용하면 기존의 차등 초원심분리로 달성한 것보다 더 높은 순도를 가진 간암 조직 유래 작은 세포외 소포를 분리할 수 있습니다. 이 기술은 간단하고 편리하며 작동하기 쉬워 작은 세포외 소포체 연구를 위한 방법론적 지원을 제공할 수 있습니다. 시작하려면 섭씨 80도 냉동고에서 조직 샘플을 꺼냅니다.약 400 밀리그램의 조직을 아이스 박스의 10 센티미터 세포 배양 접시에 넣고 메스로 조직을 잘게 다진다. 조직을 1.5 밀리리터의 소화 용액으로 6 웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 전이 탈색 셰이커에 놓고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 간암 조직의 완전한 해리와 작은 세포외 소포 또는 sEV의 방출을 위해 배양합니다.배양 후 6 웰 플레이트를 아이스 박스에 놓습니다. 80 마이크로 리터의 포스파타제 억제제와 200 마이크로 리터의 완전한 프로테아제 억제제 용액을 첨가하여 소화를 중지시킵니다. 그런 다음 소화액을 2 밀리리터 원심 분리기 튜브에 놓인 70 마이크로 미터 세포 여과기로 옮기고 천천히 여과하여 큰 조직 파편을 제거합니다.여과액을 500g에서 10분 동안 원심분리하여 작은 조직 파편을 제거하고 새로운 2밀리리터 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다. 상층액을 3, 000 g에서 20분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한다. 피펫 끝이 바닥의 흰색 파편에 닿을 때까지 상층액을 새 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.남은 액체의 원심분리를 반복한 후 파편을 방해하지 않고 상층액을 튜브에 모읍니다. 수집 된 상청액을 12, 000 g에서 20 분 동안 원심 분리하고, 상청액 900 마이크로 리터를 4.7 밀리미터 초 원심 분리 튜브로 옮긴다. 나머지 액체의 원심분리를 반복한 다음 두 상층액을 수집하여 동일한 초원심분리기 튜브에 혼합합니다.튜브를 PBS로 완전히 채웁니다. 상층액을 100, 000 g에서 60 분 동안 원심 분리한다. 상층액을 버린 후 초원심분리기 튜브에 PBS를 채워 펠릿을 재현탁합니다.100, 000 g에서 60 분 동안 원심 분리를 반복 한 후, 50 마이크로 리터의 PBS로 펠렛을 재현탁한다. 1밀리리터 멸균 주사기를 사용하여 sEV 현탁액을 흡인하고 0.22마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 600마이크로리터 원심분리기 튜브로 여과합니다. 추가 분석을 위해 여과액을 섭씨 80도에 보관하십시오.나노입자 유세포분석기를 사용하여 sEV의 크기 분포와 순도를 결정합니다. 세척액의 양을 확인하십시오. 그런 다음 외피와 폐액의 수위 차이를 확인하십시오.계측기의 주 전원 공급 장치를 켠 후 20초 후에 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어를 실행하기 위해 기기가 제대로 연결되었음을 나타내는 신호음이 울릴 때까지 기다리십시오. 시작을 클릭하여 카메라, 레이저 및 공기 펌프를 켭니다.그런 다음 Sheath Flow를 클릭하고 Start Up을 선택합니다.로딩 플랫폼에 초순수를 놓습니다. 4분 후 Sample and Boosting(샘플 및 부스팅)을 클릭한 다음 Unload in Sample(샘플에서 언로드)을 선택합니다. 30초 후 블랭크 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다.Sample(샘플)을 클릭하고 Boosting(부스팅)을 선택한 다음 Unload in Sample(샘플에서 언로드)을 선택합니다. 그런 다음 초순수가 들어 있는 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. 동시에 Sample and Boosting(샘플 및 부스팅)을 클릭한 다음 Sheath Flow 및 Purge를 클릭합니다.Manual Operation(수동 작동)을 클릭하고 입자 농축 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. 그런 다음 샘플을 클릭하고 1분 동안 부스팅을 선택한 다음 샘플 정보에서 250 나노미터 표준 형광 실리카 나노 스피어 품질 관리를 동시에 선택합니다. S를 선택합니다.ampS에서 샘플링, SPCM을 클릭하여 감지기를 켭니다.그런 다음 자동 샘플링을 클릭하고 샘플링 세트에 1.0을 입력하여 압력을 1킬로파스칼로 고정합니다. 도구 모음에서 를 클릭하고 Large Signal을 선택합니다. 레이저의 수평 위치를 조정하고 레이저를 2마이크로미터로 설정합니다.그런 다음 L과 R을 계속 클릭하여 신호가 강하고 균일한지 확인합니다. Time to Record(기록 시간)를 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 Buffer(버퍼)로 이동합니다. 그런 다음 데이터를 Nfa 파일에 저장하고 샘플을 클릭하여 언로드를 선택합니다.세척 용액 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. Sample(샘플)을 클릭하고 Boosting(부스팅)을 선택한 다음 1분 후에 Sample and Unload(샘플 및 언로드)를 클릭합니다. 초순수를 사용하여 모세관 팁에 남아 있는 세척액을 제거합니다.로딩 플랫폼에 입자 크기 표준 튜브를 놓고 1분 동안 Sample Boosting을 클릭합니다. 샘플 정보에서 68 to 155 S16M-Exo 품질 관리를 선택하고 샘플을 클릭한 다음 샘플링을 클릭합니다. 그런 다음 도구 모음을 클릭하고 Small Signal을 선택합니다.Time to Record(기록 시간)를 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 Buffer(버퍼)로 이동합니다. 그런 다음 데이터를 Nfa 파일에 저장하고 샘플을 클릭하여 언로드를 선택합니다. 세척액으로 잔류물을 제거한 후 PBS 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 입자 크기 표준 튜브에 대해 시연된 단계를 수행합니다.다음으로, 앞서 설명한 대로 모세관 팁을 세척하고, sEV 샘플을 로딩하여 입자 크기 표준 튜브에 대해 앞서 설명한 데이터를 분석한다. 정제된 sEV를 투과전자현미경으로 조사한 결과, 컵 모양의 형태를 가진 sEV의 존재가 밝혀졌다. sEVs에 대한 유세포 분석을 수행하였다.그리고 입자 크기는 40 내지 200 나노미터이고, 평균 입자 크기는 89 나노미터였다. 농축된 sEV의 순도는 68.32%로 나타났으며, CD63, CD9, TSG101과 같은 sEV의 단백질 마커가 웨스턴 블롯으로 검출되었습니다. GM130은 조직 세포에서는 발견되었지만 sEV에서는 발견되지 않은 sEV의 음성 대조군 마커로 사용되었습니다.효소 분해, 차등 초원심분리 및 막 여과 단계를 최대한 주의하여 수행하여 작은 세포외 소포의 순도를 보장하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li Fraumeni 증후군 환자에서 파생 된 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 다리를 모델링

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

연구

암 연구학

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

감마 델타(γδ) T 세포의 확장 및 농축

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

생체 내 비장 T 세포의 유세포 분석기에 의한 종양 유래 세포밖 소포의 면역원성 스크리닝

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...