Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

Forfatterne takker First Affiliated Hospital of Gannan Medical University for å støtte dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (tilskuddsnummer 82260422).

Humant leverkreftvev ble samlet inn fra pasienter diagnostisert med hepatisk malignitet ved First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Alle pasientene signerte et informert samtykkeskjema, og innsamlingen av humane vevsprøver ble godkjent av etikkomiteen ved First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Forberedelse<...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en repeterbar metode for å ekstrahere sEV fra leverkreftvev. Høykvalitets sEV oppnås ved skarp vevsisolering, behandling med fordøyelsesenzymer, differensiell ultrasentrifugering og 0,22 μm filtermembranfiltrering og rensing. For nedstrømsanalyse er det ekstremt viktig å sikre høy renhet av sEV-ene. I prosessen med differensial sentrifugering vil et lag av hvite stoffer (ukjent sammensetning) vises på overflaten av supernatanten. Siden dette laget ville forurense sEV-ene, fjernet vi d...

Små ekstracellulære vesikler (sEVs) er ca. 30 nm til 150 nm i diameter og utskilles av forskjellige celler1. De kan kommunisere med vevsceller og regulere det lokale eller fjerne mikromiljøet ved å transportere viktige biologiske molekyler som lipider, proteiner, DNA og RNA til forskjellige organer, vev, celler og intracellulære deler. Dermed kan de også endre oppførselen til mottakerceller 2,3. Isolering og rensing av spesifikke sEV-er er en viktig forutsetning for å studere deres biologiske oppførsel under utvikling og sykdomsforløp. Differensiell ultrasentrifugering - betraktet som gullstandarden - brukes ofte til å skille sEV fra vevene der de normalt bor4. Vevsrester, cellerester, store vesikler og apoptotiske legemer kan fjernes ved denne teknikken, og etterlater bare sEV-ene.
Kollagenase D og DNase I har vist seg å ikke påvirke molekylære egenskaper av celler eller vesikler, med egenskapene til begge enzymer som bidrar til frigjøring av vesikler i den ekstracellulære matriksen 5. Disse enzymene har blitt brukt til å trekke ut sEVs fra humant metastatisk melanomvev, tykktarmskreftvev og kolonslimhinnevev 5,6,7. Imidlertid varierer konsentrasjonen og fordøyelsestiden for kollagenase D og DNase I i disse metodene, noe som fører til inkonsekvente konklusjoner. For å unngå coprecipitation av andre subtyper av sEVs, har forskere fjernet større ekstracellulære vesikler (0, 1 μm eller 0, 2 μm i diameter) ved filtrering og / eller differensialsentrifugering8. Avhengig av kildevevet kan det være nødvendig med forskjellige metoder for isolering og rensing 9,10.
Ved å bruke den tradisjonelle differensialmetoden for ultrasentrifugering for å trekke ut sEV fra levervev, resulterer det i et lag av hvitt materiale på overflaten av supernatanten, uten noen måte å bestemme egenskapene på. I en tidligere studie11 ble dette laget av hvit substans funnet å påvirke renheten til sEVs. Selv om partikkelantallet og proteinkonsentrasjonen i prøver isolert med den tradisjonelle metoden var høyere enn i dagens metode, var variasjonskoeffisienten stor, muligens fordi mange miljøgifter kan føre til dårlig repeterbarhet av resultatene. Det vil si at ved bruk av vaskemiddel (dvs. påvisning av løseligheten av partikler i 1% Triton X-100), fant vi at renheten til sEV oppnådd ved denne metoden var større. Derfor bruker vi denne metoden til å isolere og rense sEVs avledet fra kolorektalt kreftvev for proteomisk forskning.
For tiden er forskningen på sEVs i leverkreft hovedsakelig fokusert på serum, plasma og cellekulturens supernatant12,13,14. Imidlertid kan sEVs avledet fra leverkreftvev mer nøyaktig gjenspeile den fysiologiske patologien og det omkringliggende mikromiljøet av leverkreft og effektivt unngå nedbrytning og forurensning av andre EVs15,16. Ved bruk av differensial ultrasentrifugering kan denne metoden berike utbyttet og oppnå sEV av høy kvalitet, noe som gir et viktig grunnlag for videre studier av leverkreft. Denne metoden gjør at leverkreftvevet kan separeres ved skarp separasjon og dissosieres av kollagenase D og DNase I. Deretter fjernes det cellulære rusk, store vesikler og apoptotiske legemer ytterligere ved filtrering og differensiell ultrasentrifugering. Til slutt blir sEV-ene isolert og renset for senere studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Små ekstracellulære vesikler (sEVs) avledet fra vev kan gjenspeile den funksjonelle statusen til kildecellene og egenskapene til vevets interstitielle rom. Effektiv anrikning av disse sEV-ene er en viktig forutsetning for studiet av deres biologiske funksjon og en nøkkel til utviklingen av kliniske deteksjonsteknikker og terapeutisk bærerteknologi. Det er vanskelig å isolere sEV fra vev fordi de vanligvis er sterkt forurenset. Denne studien gir en metode for rask anrikning av høykvalitets sEV fra leverkreftvev. Metoden innebærer en fire-trinns prosess: inkubasjon av fordøyelsesenzymer (kollagenase D og DNase Ι) med vev, filtrering gjennom en 70 μm cellesil, differensiell ultrasentrifugering og filtrering gjennom et 0,22 μm membranfilter. På grunn av optimaliseringen av differensialultrasentrifugeringstrinnet og tilsetning av et filtreringstrinn, er renheten til sEVene oppnådd ved denne metoden høyere enn det som oppnås ved klassisk differensial ultrasentrifugering. Det gir en viktig metodikk og støttedata for studiet av vevsavledede sEVs.

sEVs fra humant leverkreftvev har spilt en avgjørende rolle i diagnosen, behandlingen og prognosen til pasienter med leverkreft. Denne metoden brukte vanlige laboratorieinstrumenter for å isolere og rense sEVs avledet fra leverkreftvev; Dette kan gi metodisk støtte til studiet av sEV. Figur 2 illustrerer den generelle prosessen med å berike sEV fra leverkreftvev. sEV i de intercellulære rommene i vev frigjøres fullt ut gjennom vevskjæring og enzymatisk hydrolyse. Videre filtreres ford...

Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Her beskriver vi anrikningen av små ekstracellulære vesikler avledet fra leverkreftvev gjennom en optimalisert differensial ultrasentrifugeringsmetode.

En anrikningsmetode for små ekstracellulære vesikler avledet fra leverkreftvev

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Denne metoden tillater isolering av leverkreftvevsavledede små ekstracellulære vesikler med en renhet høyere enn det som oppnås ved klassisk, differensiell ultrasentrifugering. Denne teknologien er enkel, praktisk og enkel å betjene, noe som kan gi metodologisk støtte for studiet av små ekstracellulære vesikler. For å begynne, fjern vevsprøven fra fryseren på 80 grader Celsius.Plasser omtrent 400 milligram av vevet i en 10-centimeter cellekulturskål på isboksen, og finhakk vevet med en skalpell. Overfør vevet til en seks-brønnplate med 1,5 ml av fordøyelsessystemet. Deretter plasserer du platen på overføringsavfargingsristeren, og inkuberer ved 37 grader Celsius i 20 minutter for fullstendig dissosiasjon av leverkreftvevet og frigjøring av de små ekstracellulære vesiklene eller sEVs.Etter inkubering, plasser seksbrønnplaten på isboksen. Tilsett 80 mikroliter fosfataseinhibitor og 200 mikroliter komplett proteaseinhibitorløsning for å stoppe fordøyelsen. Deretter overfører du fordøyelsessystemet til en 70-mikrometer cellesil plassert på et to-milliliter sentrifugerør, og filtrer det sakte for å fjerne store vevsrester.Sentrifuge filtratet ved 500 g i 10 minutter for å fjerne små vevsrester, og samle supernatanten i et nytt to-milliliter sentrifugerør. Sentrifuge supernatanten ved 3.000 g i 20 minutter for å fjerne celleavfallet. Overfør supernatanten forsiktig til et nytt sentrifugerør til pipettespissen er i ferd med å berøre det hvite avfallet nederst.Etter gjentatt sentrifugering av gjenværende væske, samle supernatanten inn i røret uten å forstyrre rusk. Sentrifuge den oppsamlede supernatanten ved 12.000 g i 20 minutter, og overfør 900 mikroliter av supernatanten til et 4, 7 millimeter ultracentrifugerør. Gjenta sentrifugeringen av den gjenværende væsken, og samle og bland deretter begge supernatantene i samme ultrasentrifugerør.Fyll røret helt med PBS. Sentrifuge supernatanten ved 100.000 g i 60 minutter. Etter å ha kastet supernatanten, resuspender pelleten ved å fylle ultrasentrifugerøret med PBS.Etter å ha gjentatt sentrifugeringen ved 100 000 g i 60 minutter, resuspender pelleten med 50 mikroliter PBS. Aspirer sEV-suspensjonen ved hjelp av en en-milliliter steril sprøyte, og filtrer den gjennom et 0,22-mikrometer membranfilter i et 600-mikroliters sentrifugerør. Oppbevar filtratet ved 80 grader Celsius for videre analyse.Bruk et cytometer for nanopartikkelflyt for å bestemme størrelsen, fordelingen og renheten til sEVene. Kontroller volumet på rengjøringsløsningen. Legg deretter merke til forskjellen mellom nivåene i kappen og avfallsvæsken.Etter 20 sekunder å slå på instrumentets hovedstrømforsyning, slå på datamaskinen. Vent til pipene indikerer at instrumentet er riktig tilkoblet for å kjøre programvaren. Klikk på Start opp for å slå på kameraet, laseren og luftpumpen.Klikk deretter på Sheath Flow, og velg Start Up.Place ultrarent vann på lasteplattformen. Etter fire minutter klikker du på Prøve og boosting, og velger deretter Last ut i prøve. Etter 30 sekunder plasserer du det tomme røret på lasteplattformen.Klikk på Eksempel, velg Boosting, og velg deretter Unload in Sample. Deretter plasserer du røret som inneholder det ultrarene vannet på lasteplattformen. Klikk samtidig på Sample og Boosting, etterfulgt av Sheath Flow og Purge.Klikk på Manuell betjening, og plasser partikkelkonsentrasjonsrøret på lasteplattformen. Klikk deretter på Prøve, velg Boosting i ett minutt, og velg samtidig 250 nanometer Standard Fluorescent Silica Nanospheres kvalitetskontroll i prøveinformasjon. Velg Prøvetaking fra prøve, og slå på detektoren ved å klikke på SPCM.Klikk deretter på Auto Sampling, og skriv inn 1.0 i Sampling Set for å fikse trykket på en kilopascal. Klikk på verktøylinjen, og velg Stort signal. Juster laserens horisontale posisjon, og sett laseren på to mikrometer.Klikk deretter kontinuerlig på L og R for å sikre at signalet er sterkt og jevnt. Klikk på Time to Record for å samle inn dataene, som automatisk hopper til Buffer når du er ferdig. Lagre deretter dataene i Nfa-fil, og klikk på Eksempel for å velge Last ut.Plasser rengjøringssrøret på lasteplattformen. Klikk på Prøve, velg Boosting, og etter ett minutt klikker du på Sample and Unload. Bruk ultrarent vann for å fjerne restrengjøringsløsningen fra kapillærspissen.Plasser standardrøret for partikkelstørrelse på lasteplattformen, og klikk på Prøveøkning i ett minutt. Velg 68 til 155 S16M-Exo kvalitetskontroll i Prøveinformasjon, og klikk på Prøve, deretter Prøvetaking. Deretter klikker du på verktøylinjen, og velger Lite signal.Klikk på Time to Record for å samle inn dataene, som automatisk hopper til Buffer når du er ferdig. Lagre deretter dataene i en Nfa-fil, og klikk på Eksempel for å velge Last ut. Etter å ha fjernet restene med rengjøringsløsningen, plasser PBS-røret på lasteplattformen og utfør trinnene som er demonstrert for standardrøret for partikkelstørrelse.Rengjør deretter kapillærspissen som vist tidligere, og last inn sEV-prøven for å analysere dataene beskrevet tidligere for standardrøret for partikkelstørrelse. De rensede sEV-ene ble undersøkt under et transmisjonselektronmikroskop, som avslørte tilstedeværelsen av sEV med en koppformet morfologi. Væskestrømscytometri for sEV-ene ble utført.Og partikkelstørrelsen varierte fra 40 til 200 nanometer, og gjennomsnittlig partikkelstørrelse var 89 nanometer. Renheten til de berikede sEV-ene ble funnet å være 68,32 %Proteinmarkørene til sEV-er som CD63, CD9 og TSG101 ble detektert av western blot. GM130 ble brukt som negativ kontrollmarkør for sEV, som ble funnet i vevsceller, men ikke i sEVs.Det er avgjørende å utføre trinnene med enzymatisk fordøyelse, differensial ultrasentrifugering og membranfiltrering med største forsiktighet for å sikre renheten av små ekstracellulære vesikler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studere normal tissue stråling virkninger benytter ekstracellulære matrise Hydrogeler

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Romlig og Temporal kontroll av murine melanom innvielse fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering av exosome-beriket ekstracellulære vesikler som bærer granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Sekvensering liten non-Coding RNA fra formalin-fast vev og serum-avledet Exosomes fra kastrering-resistente prostata kreftpasienter

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Utvidelse og berikelse av Gamma-Delta (γδ) T-celler fra det afærerte menneskelige produktet

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenisitet Screening av tumor-avledede ekstracellulære vesicles av Flow Cytometry av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensjonal sfæroidmodell for å undersøke tumor-stromal interaksjon i hepatocellulært karsinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...