Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

Авторы благодарят Первую дочернюю больницу Медицинского университета Ганнань за поддержку этой работы. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82260422).

Ткань рака печени человека была собрана у пациентов с диагнозом злокачественное новообразование печени в Первой дочерней больнице Медицинского университета Ганнана. Все пациенты подписали форму информированного согласия, а сбор образцов тканей человека был одобрен комитетом по эти?...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Этот протокол описывает воспроизводимый метод извлечения sEV из ткани рака печени. Высококачественные sEV получают путем резкой изоляции тканей, обработки пищеварительными ферментами, дифференциального ультрацентрифугирования, а также фильтрации и очистки фильтрующей мембраны 0,22 мкм....

Малые внеклеточные везикулы (sEV) имеют диаметр от 30 до 150 нм и секретируются различными клетками1. Они могут общаться с тканевыми клетками и регулировать локальное или отдаленное микроокружение, транспортируя важные биологические молекулы, такие как липиды, белки, ДНК и РНК, к различным органам, тканям, клеткам и внутриклеточным частям. Таким образом, они также могут изменять поведение клеток-реципиентов 2,3. Выделение и очистка специфических электромобилей является важной предпосылкой для изучения их биологического поведения во время развития и течения заболевания. Дифференциальное ультрацентрифугирование, считающееся золотым стандартом, обычно используется для отделения sEV от тканей, в которых они обычно находятся4. С помощью этого метода можно удалить тканевый мусор, клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела, оставив только sEV.
Было показано, что коллагеназа D и ДНКаза I не влияют на молекулярные характеристики клеток или везикул, при этом свойства обоих ферментов способствуют высвобождению везикул во внеклеточном матриксе 5. Эти ферменты использовались для извлечения sEV из ткани метастатической меланомы человека, ткани рака толстой кишки и ткани слизистой оболочки толстой кишки 5,6,7. Однако концентрация и время переваривания коллагеназы D и ДНКазы I в этих методах различаются, что приводит к противоречивым выводам. Чтобы избежать соосаждения других подтипов sEV, исследователи удалили более крупные внеклеточные везикулы (0,1 мкм или 0,2 мкм в диаметре) путем фильтрации и/или дифференциального центрифугирования8. В зависимости от исходной ткани могут потребоваться различные методы выделения и очистки 9,10.
Использование традиционного метода дифференциального ультрацентрифугирования для извлечения sEV из ткани печени приводит к образованию слоя белого вещества на поверхности надосадочной жидкости без какого-либо способа определения его свойств. В предыдущем исследовании11 было обнаружено, что этот слой белого вещества влияет на чистоту электромобилей. Хотя количество частиц и концентрация белка в образцах, выделенных традиционным методом, были выше, чем в современных методах, коэффициент вариации был большим, возможно, потому, что многие загрязняющие вещества могут привести к плохой повторяемости результатов. То есть, используя моющее средство (т.е. детектируя растворимость частиц в 1% Triton X-100), мы обнаружили, что чистота sEV, полученных этим методом, была больше. Следовательно, мы используем этот метод для выделения и очистки sEV, полученных из ткани колоректального рака, для протеомных исследований.
В настоящее время исследования sEVs при раке печени сосредоточены в основном на сыворотке, плазме и надосадочной жидкостиклеточной культуры 12,13,14. Тем не менее, sEV, полученные из ткани рака печени, могут более точно отражать физиологическую патологию и окружающее микроокружение рака печени и эффективно избегать деградации и загрязнения других EV15,16. С использованием дифференциального ультрацентрифугирования этот метод позволяет обогатить выход и получить высококачественные sEV, обеспечивая важную основу для дальнейшего изучения рака печени. Этот метод позволяет разделить ткань рака печени путем резкого разделения и диссоциировать коллагеназой D и ДНКазой I. Затем клеточный мусор, крупные везикулы и апоптотические тела дополнительно удаляются фильтрацией и дифференциальным ультрацентрифугированием. Наконец, sEV выделяют и очищают для последующих исследований.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV), полученные из ткани, могут отражать функциональное состояние исходных клеток и характеристики интерстициального пространства ткани. Эффективное обогащение этих sEV является важной предпосылкой для изучения их биологической функции и ключом к разработке методов клинического обнаружения и технологии терапевтического носительства. Трудно изолировать sEV от тканей, потому что они обычно сильно загрязнены. Это исследование предоставляет метод быстрого обогащения высококачественных sEV из ткани рака печени. Метод включает в себя четырехступенчатый процесс: инкубацию пищеварительных ферментов (коллагеназы D и ДНКазы Ι) с тканью, фильтрацию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм, дифференциальное ультрацентрифугирование и фильтрацию через мембранный фильтр 0,22 мкм. Благодаря оптимизации стадии дифференциального ультрацентрифугирования и добавлению ступени фильтрации чистота электромобилей, полученных этим методом, выше, чем при классическом дифференциальном ультрацентрифугировании. Он предоставляет важную методологию и вспомогательные данные для изучения sEV тканевого происхождения.

sEV из тканей рака печени человека сыграли решающую роль в диагностике, лечении и прогнозе пациентов с раком печени. В этом методе использовались обычные лабораторные инструменты для выделения и очистки sEV, полученных из тканей рака печени; это может обеспечить методологическую поддерж?...

Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Здесь мы описываем обогащение небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени, с помощью оптимизированного метода дифференциального ультрацентрифугирования.

Метод обогащения небольших внеклеточных везикул, полученных из ткани рака печени

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Этот метод позволяет выделять небольшие внеклеточные везикулы, полученные из тканей рака печени, с чистотой, превышающей чистоту, достигаемую классическим дифференциальным ультрацентрифугированием. Эта технология проста, удобна и проста в эксплуатации, что может обеспечить методическую поддержку для исследования небольших внеклеточных везикул. Для начала извлеките образец ткани из морозильной камеры при температуре 80 градусов по Цельсию.Поместите примерно 400 миллиграммов ткани в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток на ящике для льда и мелко измельчите ткань скальпелем. Переложите ткань в шестилуночную пластину с 1,5 миллилитрами пищеварительного раствора. Затем поместите пластину на шейкер для обесцвечивания переноса и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут для полной диссоциации ткани рака печени и высвобождения мелких внеклеточных везикул или sEV.После инкубации поместите шестилуночную тарелку на ящик со льдом. Добавьте 80 микролитров ингибитора фосфатазы и 200 микролитров полного раствора ингибитора протеазы, чтобы остановить пищеварение. Затем перенесите пищеварительный раствор в 70-микрометровый клеточный фильтр, помещенный в двухмиллилитровую центрифужную пробирку, и медленно отфильтруйте его, чтобы удалить крупный тканевый мусор.Центрифугируйте фильтрат по 500 г в течение 10 минут, чтобы удалить мелкий тканевый мусор, и соберите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируют надосадочную жидкость в дозе 3 000 г в течение 20 мин для удаления клеточного мусора. Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку до тех пор, пока кончик пипетки не коснется белого мусора на дне.После повторного центрифугирования оставшейся жидкости сверните надосадочную жидкость в трубку, не нарушая мусора. Центрифугируйте собранную надосадочную жидкость при 12 000 г в течение 20 минут и перенесите 900 микролитров надосадочной жидкости в 4,7-миллиметровую ультрацентрифужную пробирку. Повторите центрифугирование оставшейся жидкости, а затем соберите и смешайте оба надосадочных продукта в одну и ту же ультрацентрифужную пробирку.Полностью заполните тюбик PBS. Центрифугируют надосадочную жидкость в дозе 100 000 г в течение 60 минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу, заполнив ультрацентрифужную пробирку PBS.После повторения центрифугирования при 100 000 г в течение 60 минут ресуспендируют гранулу 50 микролитрами PBS. Аспирируйте суспензию sEV с помощью стерильного шприца объемом один миллилитр и отфильтруйте ее через мембранный фильтр размером 0,22 микрометра в центрифужную пробирку объемом 600 микролитров. Храните фильтрат при температуре 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа.Используйте проточный цитометр наночастиц для определения распределения по размерам и чистоты sEV. Проверьте объем чистящего раствора. Затем обратите внимание на разницу между уровнями оболочки и отработанной жидкости.Через 20 секунд после включения основного питания прибора включите компьютер. Дождитесь звуковых сигналов, указывающих на то, что прибор правильно подключен, чтобы запустить программное обеспечение. Нажмите «Пуск», чтобы включить камеру, лазер и воздушный насос.Затем нажмите «Поток оболочки» и выберите «Пуск».Поместите сверхчистую воду на погрузочную платформу. Через четыре минуты нажмите «Образец и ускорение», а затем выберите «Выгрузить в образце». Через 30 секунд поместите заготовку на грузовую платформу.Нажмите «Образец», выберите «Ускорение», а затем выберите «Выгрузить в образце». Затем поместите трубку со сверхчистой водой на погрузочную платформу. Одновременно нажмите «Сэмпл» и «Ускорение», а затем «Поток оболочки» и «Продувка».Нажмите «Ручное управление» и поместите пробирку с концентрацией частиц на грузовую платформу. Затем нажмите «Образец», выберите «Ускорение» в течение одной минуты и одновременно выберите 250-нанометровый контроль качества стандартных флуоресцентных наносфер кремнезема в разделе «Информация об образце». Выберите «Отбор проб из образца» и включите детектор, нажав на SPCM.Затем нажмите «Автоматическая выборка» и введите 1.0 в набор для отбора проб, чтобы зафиксировать давление на уровне одного килопаскаля. Нажмите на панель инструментов и выберите «Большой сигнал». Отрегулируйте горизонтальное положение лазера и установите лазер на два микрометра.Затем непрерывно нажимайте на L и R, чтобы убедиться, что сигнал сильный и равномерный. Нажмите «Время записи», чтобы собрать данные, которые автоматически перейдут в буфер по завершении. Затем сохраните данные в файле Nfa и нажмите «Образец», чтобы выбрать «Выгрузить».Поместите трубку с чистящим раствором на грузовую платформу. Нажмите «Образец», выберите «Ускорение» и через одну минуту нажмите «Образец и выгрузка». Используйте сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с наконечника капилляра.Поместите пробирку стандартного размера частиц на загрузочную платформу и нажмите «Повышение пробы» в течение одной минуты. Выберите контроль качества от 68 до 155 S16M-Exo в разделе «Информация об образце» и нажмите «Образец», затем «Выборка». Затем нажмите на панель инструментов и выберите «Маленький сигнал».Нажмите «Время записи», чтобы собрать данные, которые автоматически перейдут в буфер по завершении. Затем сохраните данные в файле Nfa и нажмите «Образец», чтобы выбрать «Выгрузить». После удаления остатков с помощью чистящего раствора поместите трубку PBS на загрузочную платформу и выполните действия, показанные для стандартной пробирки с размером частиц.Затем очистите наконечник капилляра, как показано ранее, и загрузите образец sEV для анализа данных, описанных ранее для стандартной пробирки с размером частиц. Очищенные sEV исследовали под просвечивающим электронным микроскопом, который выявил наличие sEV с чашеобразной морфологией. Проведена проточная цитометрия для sEV.Причем размер частиц варьировался от 40 до 200 нанометров, а средний размер частиц составлял 89 нанометров. Было обнаружено, что чистота обогащенных sEV составляет 68,32%Белковые маркеры sEV, такие как CD63, CD9 и TSG101, были обнаружены с помощью вестерн-блоттинга. GM130 использовался в качестве отрицательного контрольного маркера sEV, который был обнаружен в тканевых клетках, но не в sEV.Крайне важно выполнять этапы ферментативного сбраживания, дифференциального ультрацентрифугирования и мембранной фильтрации с особой тщательностью, чтобы обеспечить чистоту небольших внеклеточных везикул.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Моделирование остеосаркома, используя синдром ли Фраумени, которую пациент производные индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Извлечение внеклеточного Vesicles из цельной ткани

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Изучение нормальных эффектов радиации тканей с помощью внеклеточных гидрогелей матрицы

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Пространственный и временный контроль Мурин Меланомы Инициация от мутантных меланоцитов стволовых клеток

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Выделение экзосомных внеклеточных везикул, несущих гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, из эмбриональных стволовых клеток

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Изучение Тройной отрицательный рак молочной железы Использование ортотопической модели рака молочной железы

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Секвенирование малых некодирующих РНК от формина-фиксированных тканей и сыворотки полученных экзосом от кастрации устойчивых больных раком предстательной железы

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Расширение и обогащение гамма-дельта (γδ) Т-клеток из аферезированного продукта человека

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

В городе Виво Скрининг иммуногенности внеклеточных везикул опухолевого происхождения методом проточной цитометрии селезеночных Т-клеток

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Трехмерная сфероидная модель для исследования опухоле-стромального взаимодействия при гепатоцеллюлярной карциноме

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...