Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
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Los autores agradecen al Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan por apoyar este trabajo. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 82260422).

Se recolectó tejido de cáncer de hígado humano de pacientes diagnosticados con neoplasia maligna hepática en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan. Todos los pacientes firmaron un formulario de consentimiento informado, y la recolección de muestras de tejido humano fue aprobada por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos y softw...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Este protocolo describe un método repetible para extraer sEV del tejido del cáncer de hígado. Los sEV de alta calidad se obtienen mediante aislamiento tisular nítido, tratamiento con enzimas digestivas, ultracentrifugación diferencial y filtración y purificación de membrana filtrante de 0,22 μm. Para el análisis posterior, es extremadamente importante garantizar la alta pureza de los sEV. En el proceso de centrifugación diferencial, aparecerá una capa de sustancias blancas (composición desconocida) en la supe...

Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) tienen aproximadamente 30 nm a 150 nm de diámetro y son secretadas por varias células1. Pueden comunicarse con las células de los tejidos y regular el microambiente local o distante mediante el transporte de moléculas biológicas importantes como lípidos, proteínas, ADN y ARN a varios órganos, tejidos, células y partes intracelulares. Por lo tanto, también pueden cambiar el comportamiento de las células receptoras 2,3. El aislamiento y la purificación de sEV específicos es un requisito previo esencial para estudiar su comportamiento biológico durante el desarrollo y el curso de la enfermedad. La ultracentrifugación diferencial, considerada como el estándar de oro, se usa comúnmente para separar los sEV de los tejidos en los que normalmente residen4. Los restos de tejido, los restos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se pueden eliminar mediante esta técnica, dejando solo los sEV.
Se ha demostrado que la colagenasa D y la DNasa I no afectan las características moleculares de las células o vesículas, y las propiedades de ambas enzimas contribuyen a la liberación de vesículas en la matriz extracelular 5. Estas enzimas se han utilizado para extraer sEVs del tejido del melanoma metastásico humano, tejido de cáncer de colon y tejido de la mucosa colónica 5,6,7. Sin embargo, la concentración y el tiempo de digestión de la colagenasa D y la DNasa I en estos métodos difieren, lo que lleva a conclusiones inconsistentes. Para evitar la coprecipitación de otros subtipos de sEVs, los investigadores han eliminado vesículas extracelulares más grandes (0,1 μm o 0,2 μm de diámetro) por filtración y/o centrifugación diferencial8. Dependiendo del tejido fuente, pueden ser necesarios diferentes métodos de aislamiento y purificación 9,10.
El uso del método tradicional de ultracentrifugación diferencial para extraer sEV del tejido hepático da como resultado una capa de materia blanca en la superficie del sobrenadante, sin ninguna forma de determinar sus propiedades. En un estudio previo11, se encontró que esta capa de materia blanca afecta la pureza de los sEV. Aunque el número de partículas y la concentración de proteínas de las muestras aisladas por el método tradicional fueron más altos que los del método actual, el coeficiente de variación fue grande, posiblemente porque muchos contaminantes pueden conducir a una repetibilidad deficiente de los resultados. Es decir, utilizando detergente (es decir, detectando la solubilidad de partículas en Triton X-100 al 1%), encontramos que la pureza de los sEVs obtenidos por este método era mayor. Por lo tanto, utilizamos este método para aislar y purificar sEV derivados del tejido de cáncer colorrectal para la investigación proteómica.
En la actualidad, la investigación sobre sEVs en cáncer de hígado se centra principalmente en suero, plasma y sobrenadante del cultivo celular12,13,14. Sin embargo, los sEV derivados del tejido del cáncer de hígado pueden reflejar con mayor precisión la patología fisiológica y el microambiente circundante del cáncer de hígado y evitar eficazmente la degradación y contaminación de otros EV15,16. Con el uso de la ultracentrifugación diferencial, este método puede enriquecer el rendimiento y obtener sEV de alta calidad, proporcionando una base importante para el estudio posterior del cáncer de hígado. Este método permite que el tejido del cáncer de hígado se separe por separación aguda y se disocie por la colagenasa D y la DNasa I. Luego, los desechos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se eliminan aún más mediante filtración y ultracentrifugación diferencial. Finalmente, los sEV se aíslan y purifican para estudios posteriores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas del tejido pueden reflejar el estado funcional de las células fuente y las características del espacio intersticial del tejido. El enriquecimiento eficiente de estos sEV es un requisito previo importante para el estudio de su función biológica y una clave para el desarrollo de técnicas de detección clínica y tecnología de portadores terapéuticos. Es difícil aislar los sEV del tejido porque generalmente están muy contaminados. Este estudio proporciona un método para el enriquecimiento rápido de sEV de alta calidad a partir de tejido de cáncer de hígado. El método implica un proceso de cuatro pasos: la incubación de enzimas digestivas (colagenasa D y DNasa Ι) con tejido, filtración a través de un filtro celular de 70 μm, ultracentrifugación diferencial y filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Debido a la optimización de la etapa de ultracentrifugación diferencial y la adición de una etapa de filtración, la pureza de los sEV obtenidos por este método es mayor que la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Proporciona una metodología importante y datos de apoyo para el estudio de sEV derivados de tejidos.

Los sEV de los tejidos de cáncer de hígado humano han desempeñado un papel crucial en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de pacientes con cáncer de hígado. Este método utilizó instrumentos de laboratorio comunes para aislar y purificar sEV derivados de tejidos de cáncer de hígado; esto puede proporcionar apoyo metodológico para el estudio de los sEV. La figura 2 ilustra el proceso general de enriquecimiento de los sEV de los tejidos del cáncer de hígado. Los sEV en los es...

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An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Aquí describimos el enriquecimiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado a través de un método optimizado de ultracentrifugación diferencial.

Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Este método permite el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado con una pureza superior a la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Esta tecnología es simple, conveniente y fácil de operar, lo que puede proporcionar soporte metodológico para el estudio de pequeñas vesículas extracelulares. Para comenzar, retire la muestra de tejido del congelador a 80 grados centígrados.Coloque aproximadamente 400 miligramos del tejido en un plato de cultivo celular de 10 centímetros en la caja de hielo y pique finamente el tejido con un bisturí. Transfiera el tejido a una placa de seis pocillos con 1,5 mililitros de la solución digestiva. Luego, coloque la placa en el agitador de decoloración de transferencia e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos para la disociación completa del tejido del cáncer de hígado y la liberación de las pequeñas vesículas extracelulares, o sEV.Después de la incubación, coloque la placa de seis pocillos en la caja de hielo. Agregue 80 microlitros de inhibidor de fosfatasa y 200 microlitros de solución completa de inhibidor de proteasa para detener la digestión. Luego, transfiera la solución digestiva a un colador de células de 70 micrómetros colocado en un tubo de centrífuga de dos mililitros y fílelo lentamente para eliminar cualquier residuo de tejido grande.Centrifugar el filtrado a 500 g durante 10 minutos para eliminar los restos de tejido pequeño y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga de dos mililitros. Centrifugar el sobrenadante a 3, 000 g durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga hasta que la punta de la pipeta esté a punto de tocar los residuos blancos en la parte inferior.Después de repetir la centrifugación del líquido restante, agrupe el sobrenadante en el tubo sin perturbar los desechos. Centrifugar el sobrenadante recogido a 12.000 g durante 20 minutos y transferir 900 microlitros del sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga de 4,7 milímetros. Repita la centrifugación del líquido restante, y luego recoja y mezcle ambos sobrenadantes en el mismo tubo de ultracentrífuga.Llene el tubo completamente con PBS. Centrifugar el sobrenadante a 100, 000 g durante 60 minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet llenando el tubo de ultracentrífuga con PBS.Después de repetir la centrifugación a 100, 000 g durante 60 minutos, vuelva a suspender el pellet con 50 microlitros de PBS. Aspire la suspensión sEV con una jeringa estéril de un mililitro y fíjela a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros en un tubo de centrífuga de 600 microlitros. Almacene el filtrado a 80 grados centígrados para su posterior análisis.Utilice un citómetro de flujo de nanopartículas para determinar la distribución del tamaño y la pureza de los sEV. Compruebe el volumen de la solución de limpieza. Luego, observe la diferencia entre los niveles de la vaina y el líquido residual.Después de 20 segundos de encender la fuente de alimentación principal del instrumento, encienda la computadora. Espere a que aparezcan los pitidos que indican que el instrumento está conectado correctamente para ejecutar el software. Haga clic en Iniciar para encender la cámara, el láser y la bomba de aire.A continuación, haga clic en Sheath Flow y seleccione Start Up.Coloque agua ultrapura en la plataforma de carga. Después de cuatro minutos, haga clic en Muestra y potenciación, y luego seleccione Descargar en muestra. Después de 30 segundos, coloque el tubo en blanco en la plataforma de carga.Haga clic en Muestra, seleccione Aumentar y, a continuación, seleccione Descargar en muestra. Luego, coloque el tubo que contiene el agua ultrapura en la plataforma de carga. Simultáneamente, haga clic en Muestra y Potenciador, seguido de Flujo de vaina y Purga.Haga clic en Operación manual y coloque el tubo de concentración de partículas en la plataforma de carga. Luego, haga clic en Muestra, seleccione Boosting durante un minuto y seleccione simultáneamente el control de calidad de 250 nanómetros Standard Fluorescent Silica Nanospheres en Información de muestra. Seleccione Muestreo de muestra y encienda el detector haciendo clic en SPCM.Luego, haga clic en Muestreo automático e ingrese 1.0 en Conjunto de muestreo para fijar la presión a un kilopascale. Haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal grande. Ajuste la posición horizontal del láser y ajuste el láser a dos micrómetros.Luego, haga clic continuamente en L y R para asegurarse de que la señal sea fuerte y uniforme. Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltan automáticamente a Buffer cuando terminan. Luego, guarde los datos en Archivo Nfa y haga clic en Muestra para seleccionar Descargar.Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga. Haga clic en Muestra, seleccione Boosting y, después de un minuto, haga clic en Sample and Unload. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.Coloque el tubo estándar de tamaño de partícula en la plataforma de carga y haga clic en Sample Boosting durante un minuto. Seleccione 68 a 155 Control de calidad S16M-Exo en Información de muestra, haga clic en Muestra y, a continuación, en Muestreo. A continuación, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltan automáticamente a Buffer cuando terminan. Luego, guarde los datos en un archivo Nfa y haga clic en Muestra para seleccionar Descargar. Después de eliminar los residuos con la solución de limpieza, coloque el tubo PBS en la plataforma de carga y realice los pasos demostrados para el tubo estándar de tamaño de partícula.A continuación, limpie la punta capilar como se demostró anteriormente y cargue la muestra de sEV para analizar los datos descritos anteriormente para el tubo estándar de tamaño de partícula. Los sEV purificados se examinaron bajo un microscopio electrónico de transmisión, que reveló la presencia de sEV con una morfología en forma de copa. Se realizó citometría de flujo para los sEVs.Y el tamaño de partícula varió de 40 a 200 nanómetros, y el tamaño promedio de partícula fue de 89 nanómetros. Se encontró que la pureza de los sEV enriquecidos era del 68,32%Los marcadores proteicos de sEV como CD63, CD9 y TSG101 fueron detectados por Western blot. GM130 se utilizó como marcador de control negativo de sEV, que se encontró en las células de tejido pero no en los sEV.Es crucial realizar los pasos de digestión enzimática, ultracentrifugación diferencial y filtración de membrana con el máximo cuidado para garantizar la pureza de pequeñas vesículas extracelulares.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelado de Osteosarcoma usando las células de vástago de Pluripotent inducido derivados del paciente el síndrome de Li-Fraumeni

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Estudio de los efectos de radiación de tejido normal con hidrogeles de matriz extracelular

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Aislamiento de vesículas extracelulares enriquecidas con exosomas que transportan factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos a partir de células madre embrionarias

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansión y enriquecimiento de células T gamma-delta (γδ) a partir de productos humanos aféridos

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In vivo Detección de inmunogenicidad de vesículas extracelulares derivadas de tumores mediante citometría de flujo de células T esplénicas

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

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