Name: an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

Författarna tackar First Affiliated Hospital of Gannan Medical University för att stödja detta arbete. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 82260422).

Mänsklig levercancervävnad samlades in från patienter som diagnostiserats med levermalignitet vid First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Alla patienter undertecknade ett informerat samtyckesformulär och insamlingen av mänskliga vävnadsprover godkändes av etikkommittén vid First Affiliated Hospital of Gannan Medical University. Se materialtabellen för detaljer relaterade till allt material, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
<stro...

<ol>
	<li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism.">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li><li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples.">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li><li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development,+metastasis,+and+immunity.">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Crescitelli, R., L&#228;sser, C., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues.">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation.">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).</li><li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma.">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).</li><li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles.">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li><li>Matejovi&#269;, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver,+heart,+and+skeletal+muscle.">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice.">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method.">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li><li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer.">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma.">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK/ERK+signalling+pathway.">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (5), 513 (2018).</li><li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin.">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li><li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity.">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en repeterbar metod för att extrahera sEV från levercancervävnad. Högkvalitativa sEV erhålls genom skarp vävnadsisolering, behandling med matsmältningsenzymer, differentiell ultracentrifugering och 0,22 μm filtermembranfiltrering och rening. För nedströmsanalys är det extremt viktigt att säkerställa hög renhet hos sEV. Vid processen med differentiell centrifugering kommer ett lager av vita ämnen (okänd komposition) att visas på supernatantens yta. Eftersom detta skikt skulle fö...

Små extracellulära vesiklar (sEV) är ungefär 30 nm till 150 nm i diameter och utsöndras av olika celler1. De kan kommunicera med vävnadsceller och reglera den lokala eller avlägsna mikromiljön genom att transportera viktiga biologiska molekyler som lipider, proteiner, DNA och RNA till olika organ, vävnader, celler och intracellulära delar. Således kan de också ändra beteendet hos mottagarceller 2,3. Isolering och rening av specifika sEV är en viktig förutsättning för att studera deras biologiska beteende under sjukdomsutveckling och sjukdomsförlopp. Differentiell ultracentrifugering - betraktad som guldstandarden - används vanligtvis för att separera sEV från vävnaderna där de normalt bor4. Vävnadsskräp, cellskräp, stora vesiklar och apoptotiska kroppar kan avlägsnas med denna teknik och lämnar endast sEV: erna.
Kollagenas D och DNas I har visat sig inte påverka de molekylära egenskaperna hos celler eller vesiklar, med egenskaperna hos båda enzymerna som bidrar till frisättningen av vesiklar i den extracellulära matrisen 5. Dessa enzymer har använts för att extrahera sEV från human metastaserad melanomvävnad, koloncancervävnad och kolon slemhinnevävnad 5,6,7. Koncentrationen och matsmältningstiden för kollagenas D och DNas I i dessa metoder skiljer sig emellertid åt, vilket leder till inkonsekventa slutsatser. För att undvika samfällning av andra subtyper av sEV har forskare tagit bort större extracellulära vesiklar (0,1 μm eller 0,2 μm i diameter) genom filtrering och / eller differentiell centrifugering8. Beroende på källvävnad kan olika metoder för isolering och rening krävas 9,10.
Användning av den traditionella differentiella ultracentrifugeringsmetoden för att extrahera sEV från levervävnad resulterar i ett lager av vit substans på supernatantens yta, utan något sätt att bestämma dess egenskaper. I en tidigare studie11 visade sig detta lager av vit substans påverka renheten hos sEV: erna. Även om partikelantalet och proteinkoncentrationen i prover som isolerats med den traditionella metoden var högre än i den nuvarande metoden, var variationskoefficienten stor, möjligen för att många föroreningar kan leda till dålig repeterbarhet av resultaten. Det vill säga med hjälp av tvättmedel (dvs detektering av lösligheten hos partiklar i 1% Triton X-100) fann vi att renheten hos sEV erhållna med denna metod var större. Därför använder vi denna metod för att isolera och rena sEVs härrörande från kolorektal cancervävnad för proteomisk forskning.
För närvarande är forskningen om sEV vid levercancer främst inriktad på serum, plasma och cellkulturens supernatant12,13,14. EV som härrör från levercancervävnad kan dock mer exakt återspegla den fysiologiska patologin och den omgivande mikromiljön för levercancer och effektivt undvika nedbrytning och förorening av andra EV15,16. Med användning av differentiell ultracentrifugering kan denna metod berika utbytet och erhålla högkvalitativa sEV, vilket ger en viktig grund för vidare studier av levercancer. Denna metod gör det möjligt att separera levercancervävnaden genom skarp separation och dissocieras av kollagenas D och DNas I. Därefter avlägsnas cellulära skräp, stora vesiklar och apoptotiska kroppar ytterligare genom filtrering och differentiell ultracentrifugering. Slutligen isoleras och renas sEV: erna för senare studier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Membrane Filter Unit</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Sterile syringe</td>
			<td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td>
			<td>YL01329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.7 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>361621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell cuture plate</td>
			<td>LABSELECT</td>
			<td>11110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td>
			<td>CF2100800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell strainer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-70-XBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Cell culture dish</td>
			<td>CELL TER</td>
			<td>CS016-0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 &#181;L Centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT060C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein quantification kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>RJ240544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td>
			<td>Beckman&#160;</td>
			<td>A95761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini trans-blot</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Mini-Protean</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD63 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab263019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5428HQ527333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning Solution</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper net</td>
			<td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td>
			<td>DJZCM-15-N1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Thermostat</td>
			<td>Hangzhou allsheng instruments company</td>
			<td>AS-01030-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti Human CD9 Antibody</td>
			<td>Elabscience</td>
			<td>E-AB-F1086C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>SA00001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle flow cytometer</td>
			<td>NanoFCM INC</td>
			<td>FNAN30E20112368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4906845001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline(PBS)</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidene Difluoride Membrane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>ISEQ00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QC Beads</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>QS2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 basic medium</td>
			<td>Biological Industries&#160;</td>
			<td>C11875500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Guangzhou Kehua Trading Company</td>
			<td>NN-0623-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Nanospheres</td>
			<td>NanoFCM</td>
			<td>S16M-Exo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transference Decoloring Shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Talos L120C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T8060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101 Antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>28283-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Guangzhou Lige Technology Company</td>
			<td>LG01-105-4X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue

Små extracellulära vesiklar (sEV) som härrör från vävnad kan återspegla källcellernas funktionella status och egenskaperna hos vävnadens interstitiella utrymme. Effektiv anrikning av dessa sEV är en viktig förutsättning för studier av deras biologiska funktion och en nyckel till utvecklingen av kliniska detektionstekniker och terapeutisk bärarteknik. Det är svårt att isolera sEV från vävnad eftersom de vanligtvis är kraftigt förorenade. Denna studie ger en metod för snabb anrikning av högkvalitativa sEVs från levercancervävnad. Metoden innefattar en fyrstegsprocess: inkubation av matsmältningsenzymer (kollagenas D och DNas Ι) med vävnad, filtrering genom en 70 μm cellsil, differentiell ultracentrifugering och filtrering genom ett 0,22 μm membranfilter. På grund av optimeringen av differentialultracentrifugeringssteget och tillsatsen av ett filtreringssteg är renheten hos de sEV som erhålls med denna metod högre än den som uppnås genom klassisk differentiell ultracentrifugering. Det ger en viktig metod och stödjande data för studier av vävnadshärledda sEV.

EV från mänskliga levercancervävnader har spelat en avgörande roll vid diagnos, behandling och prognos av patienter med levercancer. Denna metod använde vanliga laboratorieinstrument för att isolera och rena sEV härrörande från levercancervävnader; Detta kan ge metodologiskt stöd för studier av sEV. Figur 2 illustrerar den allmänna processen för att berika sEV från levercancervävnader. sEV i vävnadens intercellulära utrymmen frigörs fullständigt genom vävnadsskärning oc...

Watch this Scientific Journal Video about An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue at JoVE.com

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Här beskriver vi anrikningen av små extracellulära vesiklar härrörande från levercancervävnad genom en optimerad differentiell ultracentrifugeringsmetod.

En anrikningsmetod för små extracellulära vesiklar härrörande från levercancervävnad

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Denna metod möjliggör isolering av vävnadshärledda små extracellulära vesiklar från levercancer med en renhet högre än den som uppnås genom klassisk, differentiell ultracentrifugering. Denna teknik är enkel, bekväm och lätt att använda, vilket kan ge metodologiskt stöd för studier av små extracellulära vesiklar. Börja med att ta bort vävnadsprovet från frysen på 80 grader Celsius.Placera cirka 400 milligram av vävnaden i en 10-centimeter cellodlingsskål på isboxen och finhacka vävnaden med en skalpell. Överför vävnaden till en sexbrunnsplatta med 1,5 ml matsmältningslösning. Placera sedan plattan på överföringsavfärgningsskakaren och inkubera vid 37 grader Celsius i 20 minuter för fullständig dissociation av levercancervävnaden och frisättning av de små extracellulära vesiklarna eller sEV.Efter inkubation, placera sexbrunnsplattan på isboxen. Tillsätt 80 mikroliter fosfatashämmare och 200 mikroliter komplett proteashämmarelösning för att stoppa matsmältningen. Överför sedan matsmältningslösningen till en 70 mikrometer cellsil placerad på ett två milliliter centrifugrör och filtrera det långsamt för att avlägsna eventuella stora vävnadsskräp.Centrifugera filtratet vid 500 g i 10 minuter för att avlägsna det lilla vävnadsskräpet och samla supernatanten i ett nytt centrifugrör på två milliliter. Centrifugera supernatanten vid 3 000 g i 20 minuter för att avlägsna cellskräpet. Överför försiktigt supernatanten till ett nytt centrifugrör tills pipettens spets håller på att vidröra det vita skräpet i botten.Efter upprepad centrifugering av den återstående vätskan, slå samman supernatanten i röret utan att störa skräpet. Centrifugera den uppsamlade supernatanten vid 12 000 g i 20 minuter och överför 900 mikroliter av supernatanten till ett 4, 7 millimeter ultracentrifugrör. Upprepa centrifugeringen av den återstående vätskan och samla sedan upp och blanda båda supernatanterna i samma ultracentrifugrör.Fyll röret helt med PBS. Centrifugera supernatanten vid 100 000 g i 60 minuter. Efter kassering av supernatanten, suspendera pelleten igen genom att fylla ultracentrifugröret med PBS.Efter att ha upprepat centrifugeringen vid 100 000 g i 60 minuter, resuspendera pelleten med 50 mikroliter PBS. Aspirera sEV-suspensionen med en milliliter steril spruta och filtrera den genom ett 0,22 mikrometer membranfilter i ett 600 mikroliter centrifugrör. Förvara filtratet vid 80 grader Celsius för vidare analys.Använd en nanopartikelflödescytometer för att bestämma storleksfördelningen och renheten hos sEV: erna. Kontrollera rengöringslösningens volym. Observera sedan skillnaden mellan mantelns nivåer och avfallsvätskan.Efter 20 sekunder av att slå på instrumentets huvudströmförsörjning, slå på datorn. Vänta tills pipen indikerar att instrumentet är korrekt anslutet för att köra programvaran. Klicka på Starta upp för att slå på kameran, lasern och luftpumpen.Klicka sedan på Sheath Flow och välj Starta.Placera ultrarent vatten på lastplattformen. Efter fyra minuter klickar du på Exempel och marknadsföring och väljer sedan Ta bort i prov. Efter 30 sekunder placerar du det tomma röret på laddningsplattformen.Klicka på Exempel, välj Boost och välj sedan Ta bort i prov. Placera sedan röret som innehåller det ultrarena vattnet på lastplattformen. Klicka samtidigt på Sample and Boosting, följt av Sheath Flow och Purge.Klicka på Manuell drift och placera partikelkoncentrationsröret på laddningsplattformen. Klicka sedan på Prov, välj Öka i en minut och välj samtidigt 250 nanometer Standard Fluorescent Silica Nanospheres kvalitetskontroll i provinformation. Välj Sampling from Sample och slå på detektorn genom att klicka på SPCM.Klicka sedan på Automatisk provtagning och ange 1.0 i Sampling Set för att fixa trycket till en kilopascal. Klicka på verktygsfältet och välj Stor signal. Justera laserns horisontella position och ställ in lasern på två mikrometer.Klicka sedan kontinuerligt på L och R för att säkerställa att signalen är stark och enhetlig. Klicka på Time to Record för att samla in data, som automatiskt hoppar till Buffer när du är klar. Spara sedan data i Nfa-fil och klicka på Exempel för att välja Ta bort.Placera rengöringslösningsröret på lastplattformen. Klicka på Exempel, välj Boost och efter en minut klickar du på Sample and Unload. Använd ultrarent vatten för att avlägsna den kvarvarande rengöringslösningen från kapillärspetsen.Placera standardröret för partikelstorlek på laddningsplattformen och klicka på Sample Boosting i en minut. Välj 68 till 155 S16M-Exo-kvalitetskontroll i Provinformation och klicka på Exempel och sedan Provtagning. Klicka sedan på verktygsfältet och välj Liten signal.Klicka på Time to Record för att samla in data, som automatiskt hoppar till Buffer när du är klar. Spara sedan data i en Nfa-fil och klicka på Exempel för att välja Ta bort. När resterna har avlägsnats med rengöringslösningen, placera PBS-röret på lastplattformen och utför stegen som visas för standardröret för partikelstorlek.Rengör sedan kapillärspetsen som visats tidigare och ladda sEV-provet för att analysera de data som beskrivits tidigare för standardröret för partikelstorlek. De renade sEV: erna undersöktes under ett transmissionselektronmikroskop, vilket avslöjade närvaron av sEV med en koppformad morfologi. Flödescytometri för sEV utfördes.Och partikelstorleken varierade från 40 till 200 nanometer, och den genomsnittliga partikelstorleken var 89 nanometer. Renheten hos de anrikade sEV: erna visade sig vara 68,32%Proteinmarkörerna för sEV som CD63, CD9 och TSG101 detekterades av western blot. GM130 användes som negativ kontrollmarkör för sEV, som hittades i vävnadsceller men inte i sEV.Det är viktigt att utföra stegen för enzymatisk matsmältning, differentiell ultracentrifugering och membranfiltrering med största försiktighet för att säkerställa renheten hos små extracellulära vesiklar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Studera normal vävnad strålningseffekter med hjälp av extracellulära matrix hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumslig och temporal kontroll av murina melanom initiering från Mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Isolering av exosomberikade extracellulära vesiklar som bär granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor från embryonala stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Sekvensering av små icke-kodande RNA från formalin-fasta vävnader och serum-härledda exosomer från Kastrationsresistenta prostata cancer patienter

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansion och anrikning av Gamma-Delta (γδ) T-celler från Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

In Vivo Immunogenicitet Screening av tumör-härledda extracellulära vesicles av flöde cytometri av splenic T-celler

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

En tredimensionell sfäroidmodell för att undersöka tumör-stromal interaktion i hepatocellulärt karcinom

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...