Name: idg-sw3 cell culture in a three-dimensional extracellular matrix
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix at JoVE.com

نشكر الدكتورة ليندا ف. بونوالد على إهداء خط خلايا IDG-SW3. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070902 و 82100935 و 81700778) ومشروع شنغهاي للإبحار "ابتكار العلوم والتكنولوجيا" (21YF1442000).

هذا البروتوكول مناسب لزراعة الخلايا في أربعة آبار من 24 صفيحة. في حالة تحضير عينات أو ألواح متعددة ، يجب زيادة كميات الكواشف وفقا لذلك.
1. تحضير خليط الكولاجين الأول
ملاحظة: الكولاجين I وهلام مصفوفة الغشاء القاعدي بسرعة في درجة حرارة الغرفة. لذلك ، يجب ا?...

<ol>
	<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteocyte:+An+endocrine+cell+...+and+more.">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease.">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin.">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).</li><li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoid-mimicking+dense+collagen/chitosan+hybrid+gels.">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li><li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+in+humans:+making+the+hard+choices+in+life.">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li><li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix.">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li><li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry.">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11/Podoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation.">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin,+a+novel+BMP+antagonist.">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li><li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting.">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li><li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte.">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li><li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis.">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice.">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).</li></ol>

النقطة الحرجة في هذا البروتوكول هي أنه يجب تنفيذ الخطوتين 1 و 2 على الجليد لمنع التخثر التلقائي. في هذه الطريقة ، كان التركيز النهائي للكولاجين I 1.2 مجم / مل. وبالتالي ، يجب حساب حجم ddH2O الأمثل لمطابقة الكولاجين المختلفة من مختلف الشركات المصنعة.
في الجسم الحي ، ينطوي...

الخلايا العظمية هي خلايا متمايزة بشكل نهائي مشتقة من بانيات العظم 1,2. بمجرد دفن بانيات العظم بواسطة العظم العظمي ، فإنه يخضع لتكوين الخلايا العظمية ويعبر عن جين Pdpn لتشكيل الخلايا العظمية ، وجين Dmp1لتمعدن العظم ، وجينات Sost و Fgf23 لتعمل كخلية عظمية ناضجة في أنسجة العظام3. هنا ، يتم تقديم نظام زراعة 3D لتحديد امتداد التغصنات والتعبير الجيني علامة في عملية تكوين الخلايا العظمية.
خلايا IDG-SW3 هي خط خلايا أولي خالد مشتق من الفئران المعدلة وراثيا ويمكنها توسيع أو تكرار بانيات العظم إلى تمايز الخلايا العظمية المتأخرة عند زراعتها في وسائط مختلفة4. بالمقارنة مع MLO-A5 و MLO-Y4 وخطوط الخلايا الأخرى ، من المرجح أن يكون ملف تعريف التعبير للبروتينات الوظيفية ، والقدرة على أداء ترسب ملح الكالسيوم ، والاستجابات للهرمونات المختلفة في خلايا IDG-SW3 هي نفسها تلك الموجودة في الخلايا العظمية الأولية في الأنسجة العظمية4.
بالمقارنة مع أنظمة 2D ، فإن أنظمة الزراعة ثلاثية الأبعاد أكثر قدرة على محاكاة بيئة النمو الخلوي في الجسم الحي ، بما في ذلك تدرج المغذيات ، والصلابة الميكانيكية المنخفضة ، والنطاق الميكانيكي المحيط (الجدول 1). استخدمت معظم الطرق السابقة لزراعة الخلايا العظمية في نظام ثلاثي الأبعاد الكولاجين I كمكون فريد في التركيبات4،5،6 ، لأن ألياف الكولاجين I تعمل كموقع لترسب الكالسيوم والفوسفور. ومع ذلك ، فإن المكون الذي لا غنى عنه في العظم ، المصفوفة خارج الخلية ، يحتوي على مجموعة كبيرة من العوامل الخلوية التي تعزز النمو الخلوي والالتصاق والهجرة 7,8 وهو شفاف ومناسب لمراقبة التصوير. وبالتالي ، يستخدم هذا البروتوكول Matrigel (المشار إليه فيما يلي باسم مصفوفة الغشاء القاعدي) كمكون ثانوي لدراسة تكوين الخلايا العظمية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% (w/v) Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10483-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizer</td>
			<td>BiHeng&#160; Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>SKSI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Carl&#160;Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Imaging kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21430079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo microscope</td>
			<td>Carl&#160;Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Zeiss Axio ZOOM.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray fluorescence</td>
			<td>EDAX, USA</td>
			<td>EAGLE III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

idg-sw3 cell culture in a three-dimensional extracellular matrix

تعتبر الخلايا العظمية خلايا غير تكاثرية متمايزة بشكل نهائي عن بانيات العظم. تعبر بانيات العظم المضمنة في المصفوفة العظمية خارج الخلية (العظمية) عن جين Pdpn لتكوين الزوائد الشجيرية الخلوية والتحول إلى خلايا ما قبل العظم. في وقت لاحق ، تعبر الخلايا العظمية السابقة عن جين Dmp1 لتعزيز تمعدن المصفوفة وبالتالي تتحول إلى خلايا عظمية ناضجة. وتسمى هذه العملية تكوين الخلايا العظمية. IDG-SW3 هو خط خلايا معروف للدراسات في المختبر لتكوين الخلايا العظمية. استخدمت العديد من الطرق السابقة الكولاجين I باعتباره المكون الرئيسي أو الوحيد لمصفوفة الاستزراع. ومع ذلك ، بالإضافة إلى الكولاجين الأول ، يحتوي العظم العظمي أيضا على مادة أرضية ، وهي عنصر مهم في تعزيز نمو الخلايا والالتصاق والهجرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مادة المصفوفة شفافة ، مما يزيد من شفافية هلام الكولاجين I ، وبالتالي يساعد في استكشاف تكوين التغصنات من خلال تقنيات التصوير. وبالتالي ، فإن هذه الورقة تفصل بروتوكولا لإنشاء هلام ثلاثي الأبعاد باستخدام مصفوفة خارج الخلية جنبا إلى جنب مع الكولاجين I لبقاء IDG-SW3. في هذا العمل ، تم تحليل تكوين التغصنات والتعبير الجيني أثناء تكوين الخلايا العظمية. بعد 7 أيام من الثقافة العظمية ، لوحظت شبكة تغصنات واسعة النطاق بوضوح تحت مجهر متحد البؤر مضان. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن مستويات mRNA من Pdpn و Dmp1 زادت باستمرار لمدة 3 أسابيع. في الأسبوع 4 ، كشف المجهر المجسم عن هلام معتم مليء بالجزيئات المعدنية ، بما يتفق مع مقايسة مضان الأشعة السينية (XRF). تشير هذه النتائج إلى أن مصفوفة الثقافة هذه تسهل بنجاح الانتقال من بانيات العظم إلى الخلايا العظمية الناضجة.

بعد تلطيخ الخلايا الحية / الميتة ، تم تصور الخلايا باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر. كانت جميع الخلايا إيجابية للكالسيين AM (اللون الأخضر) ، ولم تكن هناك تقريبا خلايا إيجابية EthD-1 (اللون الأحمر) في الحقل ، مما يشير إلى أن نظام الهلام المصنوع بهذه الطريقة مناسب للغاية لتكوين الخلايا العظمية (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix at JoVE.com

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

هنا ، نقدم بروتوكولا لزراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الخلية.

زراعة خلايا IDG-SW3 في مصفوفة ثلاثية الأبعاد خارج الخلية

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

قمنا بتفصيل بروتوكول لإنشاء نظام 3D باستخدام مقاييس خارج الخلية جنبا إلى جنب مع الكولاجين واحد لتحليل التكوين والتعبير الجيني من خلال تكوين العظام. يمكن أن تزيد المقاييس خارج الخلية من شفافية هلام الكولاجين أحادي الشكل وهي مناسبة لاستكشاف تكوين التغصنات لتقنيات التصوير. لبدء ماصة ببطء 0.9 ملليلتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في أنبوب طرد مركزي جديد 15 ملليلتر على الجليد والاحتفاظ به جانبا.بعد ذلك ، قم بإزالة خيط T25 من الخلايا المستزرعة IDG SW3 في أربعة ملليلتر من الوسط الكامل المكمل بجاما الإنترفيرون من الحاضنة. بعد إزالة وسط الثقافة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS pH 7.4 باستخدام ماصة. ثم التربسانة الخلايا مع 0.5 ملليلتر من 0.25 ٪ التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.تعطيل التربسين بإضافة 3.5 ملليلتر من الوسط الكامل. نقل أربعة ملليلتر من المعاش المئوي إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر. أدر معلق الخلية عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات سلزية.بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق لوحة الخلايا في ملليلتر واحد من الوسط الكامل على الجليد. عد الخلايا باستخدام مقياس خلوي دموي واضبط كثافة الخلية النهائية مع الوسط الكامل إلى أربعة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر. أضف 0.1 ملليلتر من معلق الخلية المحضر إلى 0.9 ملليلتر من المصفوفة خارج الخلية المحفوظة على الجليد.تخلط جيدا عن طريق سحب بلطف لأعلى ولأسفل. امزج برفق ملليلتر واحد من خليط مصفوفة الخلية ومليلتر واحد من الكولاجين المحضر مسبقا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل على الجليد. ماصة 0.5 ملليلتر من الخليط النهائي في كل بئر من صفيحة بئر 24 واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتشكيل خليط هلام الخلية.بعد الحضانة ، أضف 0.5 مل من الوسط العظمي إلى خليط هلام الخلية في كل بئر. لبدء التمايز العظمي عند 37 درجة سلزية، اعتبر هذا اليوم صفرا. كل يومين ، استبدل نصف الوسط بوسط عظمي جديد واستمر في الزراعة لمدة 35 يوما.قم بإزالة محاليل الكالسيوم AM و ethidium one Stock من الفريزر واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة. أضف أربعة ميكرولترات من محلول مخزون واحد من الإيثيديوم المليمولي وخمسة ميكرولترات من محلول مخزون الكالسيوم AM بأربعة مليمولار إلى مليلتر من DPBS واخلطه جيدا للحصول على اثنين من ميكرومولار الكالسيوم AM وأربعة ميكرومولار إيثيديوم واحد كحل عملي. لأداء تلطيخ الخلايا في اليوم الأول واليوم السابع من الزراعة ، ماصة 0.5 ملليلتر من محلول العمل في آبار صفيحة البئر 24 واحتضانها لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ مصفوفة هلام الخلية.أضف ما يقرب من 0.5 ملليلتر من DPBS الطازج إلى طبق استزراع زجاجي جديد بطول 35 مم وقم بتغطية الطبق لمنع تلوث العينات أو تجفيفها. باستخدام ملقط الكوع المائل ، انقل بعناية مصفوفة هلام الخلايا الملطخة إلى طبق الاستزراع المحتوي على DPBS دون إتلاف أو قص مصفوفة هلام الخلية. عرض الخلايا المسمى تحت المجهر الفلوري متحد البؤر بالليزر.ضع طبق الاستزراع الذي يحتوي على مصفوفة هلام الخلايا الملطخة على مرحلة المجهر. حدد مناطق مصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال العدسة باستخدام هدف 10x. لضبط المسح المجهري ، حدد المرشحات البصرية.عرض الكالسيوم باللون الأخضر مع مرشح تمرير شريط الفلورسنت القياسي والإيثيديوم باللون الأحمر مع مرشحات ليوديد البروبيديوم أو صبغة تكساس الحمراء. حدد وضع الخط للمسح الضوئي ، ثم انقر فوق وضع الاستحواذ لضبط الوحدات جيدة التهوية على وحدة واحدة au. حدد عمق بيانات 8 بت ودقة صورة 1024 × 1024 بكسل.ثم حدد خطوة الخط واضبط سرعة المسح على خمسة. لجمع مجموعة Z من الصور ، حدد المواضع العلوية والسفلية لمصفوفة هلام الخلية المراد مسحها ضوئيا من خلال التركيز خلال العينة أثناء المسح المستمر وفقا لإشارة القناة الخضراء. بمجرد تحديد الجزء العلوي والسفلي من العينة ، حدد إطار المسح المطلوب وابدأ المسح.يتم مسح العينة ضوئيا من أعلى إلى أسفل مع الإعدادات المحددة لإنشاء معرض للصور. لتحديد الخلايا القابلة للحياة، حدد شريحة صورة واحدة. تشير القنوات الخضراء والحمراء إلى الخلايا الحية والميتة على التوالي.لتحديد تغصنات الخلية ، حدد القناة الخضراء المفردة لإنشاء عمليات إعادة بناء 3D باستخدام برنامج الحصول على الصور ، وتشير سلسلة من الصور الملونة الزائفة لقوس قزح إلى معلومات العمق. يتم عرض الزوائد الشجيرية في الجزء السفلي باللون الأحمر ، بينما يتم عرض تلك الموجودة في الجزء العلوي باللون الأزرق. في أيام مختلفة من الزراعة ، قم بإزالة وسط الثقافة وغسل المواد الهلامية في الطبق مرتين باستخدام DPBS.أضف 0.5 ملليلتر أو 4٪ بارافورمالدهيد في DPBS إلى البئر لإصلاح مصفوفة هلام الخلية في اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة paraformaldehyde في البئر وغسل مصفوفة هلام الخلية مرتين أخريين مع DPBS في اللوحة كما هو موضح سابقا ، واترك 0.5 ملليلتر من DPBS في كل بئر للتصوير. ضع اللوحة على مرحلة مجهر الاستريو وحدد الموضع الأمثل من خلال العدسة باستخدام هدف 0.5x.الصورة ، عرض الحقل الكامل لمصفوفة هلام الخلية في اللوحة بشكل فردي باستخدام التعرض التلقائي تحت الحقل الساطع. في اليوم 35 من الزراعة ، تحقق من مستويات النيتروجين السائل وابدأ نظام XRF. افتح غرفة العينة وانقل المواد الهلامية باستخدام ملقط مائل بالكوع من اللوحة إلى منتصف مرحلة العينة للأداة.أغلق غرفة العينة وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للأداة بالتبريد قبل الاستخدام. اضبط وقت التعرض على 35 مللي ثانية. يتراوح الطيف من صفر إلى 40 كيلو إلكترون فولت والتيار الكهربائي إلى 770 ميكروأمبير للاستحواذ.نقل مرحلة العينة ، اختر ثلاثة إلى خمسة مواقع مسح للتحليل. حدد عناصر الكالسيوم والفوسفور. ابدأ الكشف وتصدير النتائج.في أيام مختلفة من الثقافة. اغسل مصفوفة هلام الخلية التي تمت إزالتها من وسط الاستزراع مرتين باستخدام DPBS البارد المثلج كما هو موضح سابقا. استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من مصفوفة هلام الخلية باستخدام طريقة كحول أيزو أميل كلوروفورم الفينول.ثم قم بنسخ 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي إلى CDNA باستخدام بادئات سداسية عشوائية. ضع الأنبوب على جهاز تدوير حراري وقم بإجراء تضخيم PCR. بعد تحليل PCR التغييرات طية مع اثنين من طريقة دلتا CT.أظهر تلطيخ الخلايا الميتة الحية الذي تم تصوره تحت مجهر ليزر متحد البؤر أن جميع الخلايا كانت إيجابية الكالسيوم AM ولا توجد خلايا إيجابية تقريبا من الإيثيديوم يشير إلى أن نظام الهلام مناسب للغاية لتكوين الخلايا العظمية. امتدت الزوائد الشجيرية الخلوية تدريجيا إلى شبكة في الوسط العظمي بحلول اليوم السابع. صورة ملونة زائفة لثقافة اليوم السابع تعرض androids الخلية على أعماق مختلفة في الجزء السفلي والعلوي من الهلام.يتم تصوير صور ميدانية كاملة للهلام مع الخلايا والهلام بدون خلايا في صفيحة بئر 24 في الأوقات المحددة. استمرت شفافية مصفوفة الهلام في الانخفاض حتى أصبحت معتمة في اليوم 35 على عكس مصفوفة الهلام الخالية من الخلايا. أشار طيف XRF للهلام غير الشفاف في اليوم 35 إلى أن الجل كان مملوءا بالكامل برواسب الكالسيوم والفوسفور.أظهر التعبير عن العديد من جينات العلامات التي تم تحليلها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن مستويات mRNA من بودوبلانين وبروتين مصفوفة العاج واحد زادت باستمرار من اليوم الأول حتى اليوم 21 وانخفض مستوى mRNA بعد اليوم 21. زادت مستويات mRNA لعامل نمو الخلايا الليفية 23 والصلبة باستمرار خلال جميع المراحل. الكولاجين واحد ومقاييس الغشاء القاعدي هلام بسرعة ودرجة حرارة الغرفة.لذلك ، يجب تبريد جميع الأطراف والأنابيب المستخدمة مسبقا ما لم يذكر خلاف ذلك. يمكن للمرء أن يلاحظ أي أحداث مثيرة للاهتمام أثناء تكوين العظم عن طريق تقنيات التصوير. من الأسهل توطين عمل الجزيء أثناء تكوين الزوائد الشجيرية والاستطالة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

اختﻻق الكلي لحاء خارج الخلية المستمدة من مصفوفة المائية

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...