Name: idg-sw3 cell culture in a three-dimensional extracellular matrix
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix at JoVE.com

אנו מודים לד"ר לינדה פ. בונוולד על הענקת קו התאים IDG-SW3 במתנה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070902, 82100935 ו-81700778) ופרויקט השייט "חדשנות מדעית וטכנולוגית" בשנגחאי (21YF1442000).

פרוטוקול זה מתאים לגידול תאים בארבע בארות של לוחות 24 בארות. אם מכינים מספר דגימות או צלחות, יש להגדיל את כמויות הריאגנטים בהתאם.
1. הכנת תערובת קולגן I
הערה: קולגן I וג'ל מטריצת קרום מרתף במהירות בטמפרטורת החדר. לכן, קולגן צריך להיות מטופל על קרח (2 ° C עד 8 °...

<ol>
	<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteocyte:+An+endocrine+cell+...+and+more.">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease.">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin.">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).</li><li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoid-mimicking+dense+collagen/chitosan+hybrid+gels.">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li><li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+in+humans:+making+the+hard+choices+in+life.">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li><li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix.">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li><li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry.">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11/Podoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation.">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin,+a+novel+BMP+antagonist.">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li><li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting.">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li><li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte.">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li><li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis.">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice.">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).</li></ol>

נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא שיש לבצע את שלבים 1 ו-2 על קרח כדי למנוע קרישה ספונטנית. בשיטה זו, הריכוז הסופי של קולגן I היה 1.2 מ"ג/מ"ל. לפיכך, יש לחשב נפח אופטימלי של ddH2O כך שיתאים לקולגן השונים של יצרנים שונים.
In vivo, אוסטאוציטוגנזה כוללת תנועה קוטבית של אוסטאובלסטים מפ...

אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים שמקורם באוסטאובלסטים 1,2. ברגע שהאוסטאובלסט נקבר על ידי האוסטאואיד, הוא עובר אוסטיאוציטוגנזה ומבטא את הגן Pdpn ליצירת פרה-אוסטיאוציטים, את הגן Dmp1כדי להפוך את האוסטיאואיד למינרליזציה, ואת הגנים Sost ו-Fgf23 לתפקד כאוסטיאוציטים בוגרים ברקמת עצם3. כאן, מערכת תרבית תלת ממדית מוצגת כדי לזהות הרחבת דנדריט וביטוי גנים סמן בתהליך אוסטיאוציטוגנזה.
תאי IDG-SW3 הם קו תאים ראשוני אימורטלי שמקורו בעכברים טרנסגניים ויכולים להרחיב או לשכפל אוסטאובלסטים להתמיינות אוסטיאוציטים מאוחרת כאשר הם מתורבתים במדיות שונות4. בהשוואה ל- MLO-A5, MLO-Y4 וקווי תאים אחרים, פרופיל הביטוי של חלבונים פונקציונליים, היכולת לבצע שקיעת מלחי סידן והתגובות להורמונים שונים בתאי IDG-SW3 נוטים יותר להיות זהים לאלה של אוסטיאוציטים ראשוניים ברקמת העצם4.
בהשוואה למערכות דו-ממדיות, מערכות תרבית תלת-ממדיות מסוגלות יותר לחקות את סביבת הגידול התאית in vivo, כולל שיפוע חומרי המזון, קשיחות מכנית נמוכה והטווח המכני שמסביב (טבלה 1). רוב השיטות הקודמות לגידול תאים אוסטאובלסטיים במערכת תלת-ממדית השתמשו בקולגן I כמרכיב ייחודי בפורמולציות 4,5,6, מכיוון שסיבי קולגן I משמשים כאתר של שקיעת סידן וזרחן. עם זאת, מרכיב חיוני באוסטאואיד, המטריצה החוץ תאית, מכיל קבוצה גדולה של גורמים תאיים המקדמים גדילה, הידבקות ונדידה תאית 7,8 והוא שקוף ונוח לתצפית הדמיה. לפיכך, פרוטוקול זה משתמש במטריג'ל (להלן מטריצת קרום מרתף) כמרכיב משני למחקר אוסטאוציטוגנזה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% (w/v) Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10483-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizer</td>
			<td>BiHeng&#160; Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>SKSI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Carl&#160;Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Imaging kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21430079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo microscope</td>
			<td>Carl&#160;Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Zeiss Axio ZOOM.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray fluorescence</td>
			<td>EDAX, USA</td>
			<td>EAGLE III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

idg-sw3 cell culture in a three-dimensional extracellular matrix

אוסטיאוציטים נחשבים לתאים לא מתרבים המתמיינים באופן סופני מאוסטאובלסטים. אוסטאובלסטים המשובצים במטריצה החוץ תאית של העצם (אוסטיאואיד) מבטאים את הגן Pdpn ליצירת דנדריטים תאיים והופכים לפראוסטיאוציטים. מאוחר יותר, פראוסטיאוציטים מבטאים את הגן Dmp1 כדי לקדם מינרליזציה של מטריצה ובכך להפוך לאוסטיאוציטים בוגרים. תהליך זה נקרא אוסטיאוציטוגנזה. IDG-SW3 הוא קו תאים ידוע למחקרי מבחנה של אוסטיאוציטוגנזה. שיטות קודמות רבות השתמשו בקולגן I כמרכיב העיקרי או היחיד של מטריצת התרבית. עם זאת, בנוסף לקולגן I, האוסטאואיד מכיל גם חומר טחון, שהוא מרכיב חשוב בקידום גדילה, היצמדות ונדידה של תאים. בנוסף, חומר המטריצה שקוף, מה שמגביר את השקיפות של הג'ל שנוצר על ידי קולגן, ובכך מסייע לחקר היווצרות הדנדריטים באמצעות טכניקות הדמיה. לפיכך, מאמר זה מפרט פרוטוקול ליצירת ג'ל תלת-ממדי באמצעות מטריצה חוץ-תאית יחד עם קולגן I להישרדות IDG-SW3. בעבודה זו, היווצרות דנדריטים וביטוי גנים נותחו במהלך אוסטאוציטוגנזה. לאחר 7 ימים של תרבית אוסטאוגנית, נצפתה בבירור רשת דנדריטים נרחבת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. PCR בזמן אמת הראה כי רמות mRNA של Pdpn ו - Dmp1 עלו ללא הרף במשך 3 שבועות. בשבוע 4, המיקרוסקופ הסטריאוסקופ גילה ג'ל אטום מלא בחלקיקים מינרליים, התואם את בדיקת קרני רנטגן פלואורסצנטיות (XRF). תוצאות אלה מצביעות על כך שמטריצת תרבית זו מקלה בהצלחה על המעבר מאוסטאובלסטים לאוסטיאוציטים בוגרים.

לאחר צביעת תאים חיים/מתים, התאים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. כל התאים היו קלצין AM-חיובי (צבע ירוק), וכמעט ולא היו תאים חיוביים ל-EthD-1 (צבע אדום) בשדה, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל המיוצרת בשיטה זו מתאימה מאוד לאוסטאוציטוגנזה (איור 1A, משמאל). כדי לקבוע טוב יותר את ההתפ...

Watch this Scientific Journal Video about IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix at JoVE.com

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (תלת-ממדית).

תרבית תאים IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

פירטנו פרוטוקול להקמת מערכת תלת-ממדית באמצעות מערכת חוץ-תאית יחד עם קולגן לניתוח היווצרות וביטוי גנים באמצעות אוסטאוגנזה. מדדים חוץ-תאיים יכולים להגביר את השקיפות של הג'ל בצורת קולגן אחד והוא מתאים לחקר היווצרות הדנדריטים לטכניקות הדמיה. כדי להתחיל לאט פיפטה 0.9 מיליליטר של מטריצת קרום מרתף לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מיליליטר על קרח ולשמור אותו בצד.לאחר מכן, הסר חוט דנטלי T25 של תאים בתרבית IDG SW3 בארבעה מיליליטרים של מדיום שלם בתוספת אינטרפרון גמא מהאינקובטור. לאחר הסרת מדיום התרבית, לשטוף את התאים עם PBS pH 7.4 עם פיפטה. לאחר מכן טריפסניזציה של התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.השבתת טריפסין על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום מלא. מעבירים ארבעה מיליליטר של פנסיון צלזיוס לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. סובבו את מתלה התא ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את לוח התא במיליליטר אחד של המדיום המלא על קרח. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו והתאימו את צפיפות התאים הסופית עם המדיום המלא עד ארבע פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר. הוסף 0.1 מיליליטר של תרחיף התא המוכן ל -0.9 מיליליטר של המטריצה החוץ תאית הנשמרת על קרח.מערבבים היטב על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. ערבבו בעדינות מיליליטר אחד של תערובת מטריצת התא ומיליליטר אחד של הקולגן שהוכן קודם לכן על ידי פיטינג מעלה ומטה על הקרח. פיפטה 0.5 מיליליטר של התערובת הסופית לתוך כל באר של צלחת 24 באר לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור תערובת ג'ל התא.לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום אוסטאוגני לתערובת ג'ל התא בכל באר. כדי להתחיל את התמיינות אוסטאוגנית ב 37 מעלות צלזיוס, לשקול את זה כמו יום אפס. כל יומיים, החליפו חצי מהמדיום בתווך אוסטאוגני טרי והמשיכו בגידול במשך 35 יום.הוציאו מהמקפיא את תמיסות הסידן AM והאתידיום וואן סטוק ואפשרו להן להתחמם לטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של שני מילימולרים אתידיום תמיסת מלאי אחת וחמישה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי סידן AM של ארבעה מילימולרים לשני מיליליטר של DPBS וערבב היטב כדי לקבל שני סידן AM מיקרומולרי וארבעה אתידיום מיקרומולרי אחד כפתרון עבודה. כדי לבצע צביעת תאים ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, פיפטה 0.5 מיליליטר של פתרון העבודה לתוך הבארות של צלחת 24 באר לדגור במשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את מטריצת ג'ל התא.הוסיפו כ-0.5 מיליליטר של DPBS טרי לצלחת חדשה של תרבית תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ וכסו את התבשיל כדי למנוע זיהום או התייבשות של הדגימות. בעזרת מלקחיים עם קצה המרפק, העבירו בזהירות את מטריצת ג'ל התא המוכתמת לתוך צלחת התרבית DPBS מבלי לפגוע או לגזור את מטריצת ג'ל התא. הצג את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי לייזר.מניחים את צלחת התרבית המכילה את מטריצת ג'ל התא המוכתם על במת המיקרוסקופ. בחר את האזורים של מטריצת ג'ל התא לסריקה דרך העינית באמצעות מטרה של 10x. כדי להגדיר את סריקת המיקרוסקופ, בחר את המסננים האופטיים.ראו את הסידן כירוק עם מסנן פס פלואורסצנטי סטנדרטי ואת אתידיום אחד כאדום עם פילטרים לפרופידיום יודיד או צבע אדום טקסס. בחר את מצב הקו לסריקה, ולאחר מכן לחץ על מצב הרכישה כדי להגדיר את היחידות האווריריות ל- au אחד. בחר עומק נתונים של 8 סיביות ורזולוציית תמונה של 1024 על 1024 פיקסלים.לאחר מכן בחר את שלב הקו והגדר את מהירות הסריקה לחמש. כדי לאסוף את ערימת התמונות Z, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים של מטריצת ג'ל התא לסריקה על ידי מיקוד דרך הדגימה תוך סריקה רציפה בהתאם לאות הערוץ הירוק. לאחר ציון החלק העליון והתחתון של הדגימה, בחר במסגרת הסריקה הרצויה והתחל בסריקה.הדגימה נסרקת מלמעלה למטה, כאשר ההגדרות שנבחרו יוצרות גלריית תמונות. לזיהוי התאים הקיימים, בחרו פרוסת תמונה אחת. התעלות הירוקות והאדומות מציינות תאים חיים ומתים בהתאמה.כדי לזהות את דנדריט התא, בחר את הערוץ הירוק היחיד כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים באמצעות תוכנת רכישת התמונות, סדרה של תמונות צבע מדומה בצבעי הקשת מציינות את נתוני העומק. הדנדריטים בתחתית מוצגים באדום, ואילו אלה שלמעלה מוצגים בכחול. בימים שונים של תרבית, להסיר את המדיום תרבית ולשטוף את הג'לים בצלחת פעמיים עם DPBS.הוסף 0.5 מיליליטר או 4% paraformaldehyde ב DPBS לבאר כדי לתקן את מטריצת ג'ל התא בצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפרפורמלדהיד בבאר ושטוף את מטריצת ג'ל התא פעמיים נוספות עם DPBS בצלחת כפי שהודגם קודם לכן, והשאר 0.5 מיליליטר של DPBS בכל באר להדמיה. הניחו את הצלחת על במת מיקרוסקופ הסטריאו ובחרו את המיקום האופטימלי דרך העינית באמצעות מטרה של 0.5x.תמונה, תצוגת השדה המלאה של מטריצת ג'ל התא בצלחת בנפרד באמצעות חשיפה אוטומטית מתחת לשדה הבהיר. ביום ה-35 של התרבית, בדקו את רמות החנקן הנוזלי והפעילו את מערכת XRF. פתחו את חדר הדגימה והעבירו את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לאמצע שלב הדגימה של המכשיר.סגור את חדר הדגימה והמתן 30 דקות כדי לאפשר למכשיר להתקרר לפני השימוש. הגדר את זמן החשיפה ל- 35 אלפיות השנייה. הספקטרום נע בין אפס ל-40 קילו-אלקטרון וולט והזרם החשמלי ל-770 מיקרו-אמפר לרכישה.הזזת שלב הדגימה, בחר שלושה עד חמישה אתרי סריקה לניתוח. בחר את האלמנטים סידן וזרחן. התחל את הזיהוי וייצא את התוצאות.בימים שונים של טיפוח. יש לשטוף את מטריצת ג'ל התא שהוסרה פעמיים ב-DPBS קר כקרח כפי שהודגם קודם לכן. חלץ את סך הרנ"א ממטריצת ג'ל התא באמצעות שיטת אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם.לאחר מכן תעתיק הפוך שני מיקרוגרם של RNA כולל ל- CDNA עם פריימרים הקסמרים אקראיים. מניחים את הצינור על thermocycler ולבצע הגברה PCR. לאחר PCR לנתח את השינויים קיפול עם שתי שיטות CT דלתא.צביעת התאים המתים החיים שהודגמה במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי הראתה שכל התאים היו חיוביים לסידן AM וכמעט ללא תאי אתידיום חיוביים אחד, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל מתאימה מאוד לאוסטיאוציטוגנזה. הדנדריטים התאיים התרחבו בהדרגה לרשת בתווך האוסטאוגני עד היום השביעי. תמונת צבע מדומה של תרבות היום השביעי מציגה את האנדרואידים התאיים בעומקים שונים בתחתית ובחלק העליון של הג'ל.תמונות שדה מלא של הג'ל עם תאים וג'ל ללא תאים בצלחת 24 באר בזמנים שצוינו מצולמים. שקיפותה של מטריצת הג'ל המשיכה לרדת עד שהפכה אטומה ביום ה-35, בניגוד למטריצת הג'ל נטולת התאים. ספקטרום XRF של הג'ל האטום ביום ה-35 הצביע על כך שהג'ל היה מלא לחלוטין במרבצי סידן וזרחן.הביטוי של מספר גני סמנים שנותחו על ידי PCR בזמן אמת הראה כי רמות ה- mRNA של פודופלנין וחלבון מטריצת דנטין אחד עלו ללא הרף מהיום הראשון עד היום ה -21 ורמת ה- mRNA ירדה לאחר היום ה -21. רמות ה-mRNA של גורם גדילה פיברובלסטי 23 וסקלרוסטין עלו ללא הרף במהלך כל השלבים. קולגן אחד וקרום המרתף ממטרי ג'ל במהירות ובטמפרטורת החדר.לכן, כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים מראש, אלא אם כן צוין אחרת. ניתן לצפות בכל אירוע מעניין במהלך אוסטאוגנזה על ידי טכניקות הדמיה. קל יותר למקם את פעולת המולקולה במהלך היווצרות הדנדריטים והתארכותם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...