Name: idg-sw3 cell culture in a three-dimensional extracellular matrix
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix at JoVE.com

IDG-SW3 hücre hattını hediye ettiği için Dr. Lynda F. Bonewald'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070902, 82100935 ve 81700778) ve Şangay "Bilim ve Teknoloji İnovasyonu" Yelken Projesi (21YF1442000) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, 24 oyuklu plakadan oluşan dört kuyucukta hücrelerin kültürlenmesi için uygundur. Birden fazla numune veya plaka hazırlıyorsanız, reaktiflerin miktarları buna göre artırılmalıdır.
1. Kollajen I karışımının hazırlanması
NOT: Kollajen I ve bazal membran matrisi oda sıcaklığında hızlı bir şekilde jelleşir. Bu nedenle, kolajen buz üzerinde (2 °C ila 8 °C) işlenmelidir. Kullanılan tüm uçlar ve tüpler, aksi ...

<ol>
	<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amazing+osteocyte.">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li><li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+osteocyte:+An+endocrine+cell+...+and+more.">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease.">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li><li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo.">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li><li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin.">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).</li><li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoid-mimicking+dense+collagen/chitosan+hybrid+gels.">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li><li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomineralization+in+humans:+making+the+hard+choices+in+life.">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li><li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix.">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li><li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry.">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li><li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11/Podoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation.">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li><li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism.">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li><li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin,+a+novel+BMP+antagonist.">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li><li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting.">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li><li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte.">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li><li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis.">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li><li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice.">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).</li></ol>

Bu protokoldeki kritik bir nokta, spontan pıhtılaşmayı önlemek için 1. ve 2. adımların buz üzerinde gerçekleştirilmesi gerektiğidir. Bu yöntemde, nihai kollajen I konsantrasyonu 1.2 mg / mL idi. Bu nedenle, çeşitli üreticilerin farklı kollajenlerine uyacak şekilde optimal bir ddH2O hacmi hesaplanmalıdır.
İn vivo osteositogenez, osteoblastların yüzeyden trabeküler kemiğiniçine polar hareketini içerir 14. Bu protokol, hücrel...

Osteositler, osteoblastlardan(1,2) türetilen terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir. Osteoblast osteoid tarafından gömüldükten sonra, osteositogeneze uğrar ve preosteositler oluşturmak için Pdpn genini, osteoidi mineralize etmek için Dmp1 genini ve kemik dokusunda olgun bir osteosit olarak işlev görmek için Sost ve Fgf23 genlerini eksprese eder3. Burada, osteositogenez sürecinde dendrit uzantısını ve işaretleyici gen ekspresyonunu tanımlamak için bir 3D kültür sistemi tanıtılmıştır.
IDG-SW3 hücreleri, transgenik farelerden türetilen ölümsüzleştirilmiş bir birincil hücre hattıdır ve farklı ortamlarda kültürlendiğinde osteoblastı geç osteosit farklılaşmasına kadar genişletebilir veya çoğaltabilir4. MLO-A5, MLO-Y4 ve diğer hücre dizileri ile karşılaştırıldığında, fonksiyonel proteinlerin ekspresyon profili, kalsiyum tuzu biriktirme yeteneği ve IDG-SW3 hücrelerindeki çeşitli hormonlara verilen yanıtların, kemik dokusundaki primer osteositlerinkilerle aynı olma olasılığı daha yüksektir4.
2D sistemlerle karşılaştırıldığında, 3D kültür sistemleri, besin gradyanı, düşük mekanik sertlik ve çevreleyen mekanik aralık dahil olmak üzere in vivo hücresel büyüme ortamını taklit etme konusunda daha yeteneklidir (Tablo 1). Osteoblastik hücrelerin bir 3D sistemde kültürlenmesi için önceki yöntemlerin çoğu, 4,5,6 formülasyonlarında benzersiz bileşen olarak kollajen I'i kullandı, çünkü kollajen I lifleri kalsiyum ve fosfor birikimi bölgesi olarak hizmet eder. Bununla birlikte, osteoidde vazgeçilmez bir bileşen olan hücre dışı matriks, hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü 7,8 destekleyen geniş bir hücresel faktör grubu içerir ve görüntüleme gözlemi için şeffaf ve uygundur. Bu nedenle, bu protokol, osteositogenez çalışması için ikincil bir bileşen olarak Matrigel'i (bundan sonra bazal membran matrisi olarak anılacaktır) kullanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% (w/v) Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10483-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homogenizer</td>
			<td>BiHeng&#160; Biotechnology, Shanghai, China</td>
			<td>SKSI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser confocal fluorescence microscopy</td>
			<td>Carl&#160;Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Cell Imaging kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning, NY, USA</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (10X), no glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21430079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo microscope</td>
			<td>Carl&#160;Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Zeiss Axio ZOOM.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray fluorescence</td>
			<td>EDAX, USA</td>
			<td>EAGLE III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

idg-sw3 cell culture in a three-dimensional extracellular matrix

Osteositler, osteoblastlardan terminal olarak farklılaşan proliferatif olmayan hücreler olarak kabul edilir. Kemik hücre dışı matrikste (osteoid) gömülü osteoblastlar, hücresel dendritler oluşturmak ve preosteositlere dönüşmek için Pdpn genini eksprese eder. Daha sonra, preosteositler, matriks mineralizasyonunu teşvik etmek ve böylece olgun osteositlere dönüşmek için Dmp1 genini eksprese eder. Bu sürece osteositogenez denir. IDG-SW3, osteositogenezin in vitro çalışmaları için iyi bilinen bir hücre hattıdır. Önceki birçok yöntem, kollajen I'i kültür matrisinin ana veya tek bileşeni olarak kullanmıştır. Bununla birlikte, kollajen I'e ek olarak, osteoid ayrıca hücresel büyümeyi, yapışmayı ve göçü teşvik etmede önemli bir bileşen olan bir öğütülmüş madde içerir. Ek olarak, matris maddesi şeffaftır, bu da kollajen I-oluşturulan jelin şeffaflığını arttırır ve böylece görüntüleme teknikleri yoluyla dendrit oluşumunun araştırılmasına yardımcı olur. Bu nedenle, bu makale, IDG-SW3'ün hayatta kalması için kollajen I ile birlikte hücre dışı bir matris kullanarak bir 3D jel oluşturmak için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu çalışmada, osteositogenez sırasında dendrit oluşumu ve gen ekspresyonu analiz edilmiştir. 7 günlük osteojenik kültürden sonra, floresan konfokal mikroskop altında geniş bir dendrit ağı açıkça gözlendi. Gerçek zamanlı PCR, Pdpn ve Dmp1'in mRNA seviyelerinin 3 hafta boyunca sürekli arttığını gösterdi. 4. haftada, stereomikroskop, X-ışını floresan (XRF) testi ile tutarlı olarak mineral parçacıklarla dolu opak bir jel ortaya çıkardı. Bu sonuçlar, bu kültür matrisinin osteoblastlardan olgun osteositlere geçişi başarılı bir şekilde kolaylaştırdığını göstermektedir.

Canlı/ölü hücre boyamadan sonra, hücreler konfokal lazer mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Tüm hücreler kalsein-pozitifti (yeşil renk) ve sahada neredeyse hiç EthD-1-pozitif hücre (kırmızı renk) yoktu, bu da bu yöntemle yapılan jel sisteminin osteositogenez için oldukça uygun olduğunu gösteriyor (Şekil 1A, sol). Hücrelerin uzamsal dağılımını daha iyi belirlemek için, hücre dendritlerini jelin farklı derinliklerinde görüntülemek için sahte renkli bir g...

Watch this Scientific Journal Video about IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix at JoVE.com

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Burada, IDG-SW3 hücrelerini üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

IDG-SW3 Üç Boyutlu Hücre Dışı Matriste Hücre Kültürü

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Osteogenez yoluyla oluşum ve gen ekspresyonunu analiz etmek için kollajen ile birlikte hücre dışı ölçümler kullanarak bir 3D sistem kurmak için bir protokolü detaylandırdık. Hücre dışı metrikler, kollajen tek formlu jelin şeffaflığını artırabilir ve görüntüleme teknikleri için dendrit oluşumunu keşfetmek için uygundur. Yavaşça başlamak için, 0,9 mililitre bazal membran matrisini buz üzerinde 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve bir kenarda tutun.Daha sonra, inkübatörden interferon gama ile takviye edilmiş dört mililitre tam ortamda IDG SW3 kültürlenmiş hücrelerin bir T25 ipini çıkarın. Kültür ortamını çıkardıktan sonra, hücreleri PBS pH 7.4 ile bir pipetle yıkayın. Daha sonra hücreleri 30 saniye boyunca 37 santigrat derecede 0.5 mililitre% 0.25 tripsin EDTA ile tripsanize edin.3.5 mililitre tam ortam ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin. Santigrat emekli maaşının dört mililitresini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de döndürün.Süpernatanı attıktan sonra, hücre paletini buz üzerinde tam ortamın bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın ve son hücre yoğunluğunu tam ortamla dört kez 10 ila mililitre başına beşinci hücreye ayarlayın. Buz üzerinde tutulan hücre dışı matrisin 0.9 mililitresine hazırlanan hücre süspansiyonunun 0.1 mililitresini ekleyin.Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Bir mililitre hücre matris karışımını ve bir mililitre önceden hazırlanmış kolajeni buzun üzerine yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Son karışımın 0.5 mililitresini 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin ve bir hücre jeli karışımı oluşturmak için bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.İnkübasyondan sonra, her bir oyuktaki hücre jel karışımına 0.5 mililitre osteojenik ortam ekleyin. Osteojenik farklılaşmayı 37 santigrat derecede başlatmak için bunu sıfır gün olarak düşünün. Her iki günde bir, ortamın yarısını taze osteojenik ortamla değiştirin ve 35 gün boyunca kültüre devam edin.Kalsiyum ve etidyum bir stok çözeltisini dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin. İki mililitre DPBS'ye dört mikrolitre iki milimolar etidiyum, bir stok çözeltisi ve beş mikrolitre dört milimolar kalsiyum stok çözeltisi ekleyin ve iki mikromolar kalsiyum ve dört mikromolar etidyum elde etmek için iyice karıştırın. Kültürün birinci ve yedinci gününde hücre boyama yapmak için, 0.5 mililitre çalışma solüsyonunu 24 oyuklu plakanın kuyucuklarına pipetleyin ve hücre jel matrisini boyamak için oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika inkübe edin.Yeni bir 35 milimetrelik cam tabanlı kültür kabına yaklaşık 0,5 mililitre taze DPBS ekleyin ve numunelerin kontaminasyonunu veya kurumasını önlemek için kabı kapatın. Dirsek uçlu forseps kullanarak, lekeli hücre jel matrisini, hücre jel matrisine zarar vermeden veya kesmeden dikkatlice DPBS içeren kültür kabına aktarın. Etiketli hücreleri bir lazer konfokal floresan mikroskobu altında görüntüleyin.Lekeli hücre jeli matrisini içeren kültür kabını mikroskop tablasına yerleştirin. 10x objektif kullanarak göz merceğinden taranacak hücre jeli matrisinin bölgelerini seçin. Mikroskop taramasını ayarlamak için optik filtreleri seçin.Kalsiyumu standart bir floresan bant geçiren filtreyle yeşil olarak ve etidiyumu propidyum iyodür veya Texas kırmızı boyası filtreleriyle kırmızı olarak görüntüleyin. Tarama için çizgi modunu seçin, ardından havadar birimleri bir au'ya ayarlamak için çekim moduna tıklayın. 8 bit veri derinliği ve 1024 x 1024 piksel görüntü çözünürlüğü seçin.Ardından satır adımını seçin ve tarama hızını beş olarak ayarlayın. Z görüntü yığınını toplamak için, yeşil kanal sinyaline göre sürekli tarama yaparken örneğe odaklanarak taranacak hücre jel matrisinin üst ve alt konumlarını tanımlayın. Örneğin üst ve alt kısımları belirlendikten sonra, istediğiniz tarama çerçevesini seçin ve taramaya başlayın.Örnek, seçilen ayarlarla yukarıdan aşağıya doğru taranır ve bir görüntü galerisi oluşturulur. Uygun hücreleri belirlemek için, bir görüntü dilimi seçin. Yeşil ve kırmızı kanallar sırasıyla canlı ve ölü hücreleri gösterir.Hücre dendritini tanımlamak için, görüntü alma yazılımı ile 3D rekonstrüksiyonlar oluşturmak için tek yeşil kanalı seçin, bir dizi gökkuşağı sözde renkli görüntü derinlik bilgisini gösterir. Alttaki dendritler kırmızı renkte, üsttekiler ise mavi renkte gösterilir. Farklı kültür günlerinde, kültür ortamını çıkarın ve jelleri plakada DPBS ile iki kez yıkayın.Hücre jeli matrisini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plakaya sabitlemek için kuyucuğa DPBS'de 0.5 mililitre veya% 4 paraformaldehit ekleyin. Kuyucuktaki paraformaldehiti çıkarın ve hücre jeli matrisini daha önce gösterildiği gibi plakada DPBS ile iki kez daha yıkayın ve görüntüleme için her kuyucukta 0,5 mililitre DPBS bırakın. Plakayı stereo mikroskop tablasına yerleştirin ve 0.5x objektif kullanarak göz merceği boyunca en uygun konumu seçin.Görüntü, parlak alan altında otomatik pozlama kullanılarak plakadaki hücre jeli matrisinin tam alan görünümü. Kültürün 35. gününde, sıvı nitrojen seviyelerini kontrol edin ve XRF sistemini başlatın. Numune odasını açın ve dirsek uçlu forseps ile jelleri plakadan cihazın numune aşamasının ortasına aktarın.Numune odasını kapatın ve kullanmadan önce cihazın soğuması için 30 dakika bekleyin. Pozlama süresini 35 milisaniyeye ayarlayın. Spektrum aralığı sıfır ila 40 kilo elektron volt ve elektrik akımı 770 mikroamper edinim kurulumu için.Örnek aşamayı hareket ettirerek, analiz için üç ila beş tarama alanı seçin. Kalsiyum ve fosfor elementlerini seçin. Algılamayı başlatın ve sonuçları dışa aktarın.Farklı kültür günlerinde. Kültür ortamından çıkarılan hücre jeli matrisini daha önce gösterildiği gibi buz gibi soğuk DPBS ile iki kez yıkayın. Fenol kloroform izoamil alkol yöntemini kullanarak hücre jeli matrisinden toplam RNA'yı çıkarın.Daha sonra iki mikrogram toplam RNA'yı rastgele heksamer primerleri ile CDNA'ya ters çevirin. Tüpü bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. PCR sonrası iki delta CT yöntemi ile kıvrım değişikliklerini analiz edin.Konfokal lazer mikroskobu altında görüntülenen canlı ölü hücre boyama, tüm hücrelerin kalsiyum pozitif olduğunu ve jel sisteminin osteositogenez için oldukça uygun olduğunu gösteren neredeyse hiç etidyum bir pozitif hücre olmadığını gösterdi. Hücresel dendritler, yedinci günde osteojenik ortamda yavaş yavaş bir ağa yayıldı. Yedinci gün kültürünün sahte renkli bir görüntüsü, hücre androidlerini jelin altında ve üstünde farklı derinliklerde görüntüler.Belirtilen zamanlarda 24 oyuklu bir plakada hücreli ve hücresiz jelin tam alan görüntüleri görüntülenir. Jel matrisinin şeffaflığı, hücresiz jel matrisinin aksine 35. günde opak hale gelene kadar azalmaya devam etti. Opak jelin 35. gündeki XRF spektrumu, jelin tamamen kalsiyum ve fosfor birikintileri ile dolu olduğunu gösterdi.Gerçek zamanlı PCR ile analiz edilen birkaç belirteç geninin ekspresyonu, podoplanin ve dentin matriks proteini birinin mRNA seviyelerinin birinci günden 21. güne kadar sürekli arttığını ve mRNA seviyesinin 21. günden sonra azaldığını gösterdi. Fibroblast büyüme faktörü 23 ve sklerostin mRNA seviyeleri tüm aşamalarda sürekli olarak artmıştır. Kollajen bir ve bazal membran metrikleri hızlı bir şekilde jelleşir ve oda sıcaklığı.Bu nedenle, aksi belirtilmedikçe kullanılan tüm uçlar ve tüpler önceden soğutulmalıdır. Osteogenez sırasında herhangi bir ilginç olay görüntüleme teknikleri ile gözlemlenebilir. Dendrit oluşumu ve uzaması sırasında molekül etkisini lokalize etmek daha kolaydır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Doku spesifik Hücre Kültürü ve Delivery Platform olarak Ekstrasellüler Matriks kaynaklı Köpükler ve mikro Fabrikasyon

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Bir böbrek korteks ekstraselüler matrisi elde edilen hidrojel imalatı

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...