Name: live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00
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Nous tenons à remercier les NIH pour le soutien de subvention suivant: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) et 5T32GM008541-24 (KS). Nous tenons également à remercier le Massachusetts Lions Eye Research Fund et le New England Corneal Transplant Fund.

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research et le protocole IACUC de l’Université de Boston (201800302).
1. Conception des supports imprimés en 3D et de la barre de couverture
<ol><li>Concevoir les supports imprimés en 3D et la barre de couverture en tenant compte du diamètre moyen des globes de souris et imprimer la concept...

<ol>
	<li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization.">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Ca2++mobilizations:+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing.">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2++waves+in+epithelial+cells.">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+changes+in+Ca(2+)+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing.">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li><li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration.">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li><li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia.">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin1:+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium.">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).</li><li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling.">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).</li><li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity.">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).</li><li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca(2+)+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury.">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li><li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology.">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li></ol>

Ce protocole décrit une technique d’imagerie de cellules vivantes qui utilise un support imprimé en 3D pour stabiliser et immobiliser les yeux intacts des animaux. Il est conçu pour contourner plusieurs inconvénients importants reconnus avec les protocoles précédents d’imagerie de cellules vivantes du tissu cornéen ex vivo . Ce protocole offre de nombreux avantages pour l’imagerie de cellules vivantes de globes intacts. Il réduit considérablement les dommages tissulaires inutiles qui pourraient in...

Cornée La cornée est une structure avasculaire claire recouvrant la surface antérieure de l’œil qui réfracte la lumière pour permettre la vision et protéger l’intérieur de l’œil contre les dommages. Comme la cornée est exposée à l’environnement, elle est sensible aux dommages causés à la fois par des causes mécaniques (rayures) et par une infection. Une lésion cornéenne chez un patient par ailleurs en bonne santé guérit généralement en 1 à 3 jours. Cependant, chez les patients atteints de maladies sous-jacentes, notamment un déficit en cellules souches limbiques et un diabète de type II, le processus de cicatrisation des plaies cornéennes peut être considérablement prolongé1. La cornée étant fortement innervée, ces ulcères cornéens non cicatrisants et ces érosions cornéennes récurrentes sont très douloureux et diminuent grandement la qualité de vie des patients qui en souffrent1.
Signalisation cellulaire Lorsqu’une cornée par ailleurs saine est blessée, les événements de signalisation calcique dans les cellules adjacentes à la plaie précèdent et provoquent la migration cellulaire dans le lit de la plaie, où ils ferment la blessure sans risque de cicatrisation 2,3. Ces événements de signalisation ont été bien caractérisés dans des modèles de culture de cellules épithéliales cornéennes utilisant l’imagerie de cellules vivantes2. Des expériences préliminaires démontrent significativement plus de signalisation calcique après une lésion dans les cellules non diabétiques par rapport aux cellules diabétiques. Cependant, la caractérisation des événements de signalisation cellulaire dans les globes ex vivo s’est avérée être un défi technique.
Imagerie de cellules vivantes Des études antérieures ont enregistré avec succès des événements de signalisation du calcium à partir de modèles de culture cellulaire in vitro de cicatrisation des plaies cornéennes 4,5,6. Le développement d’une méthodologie pour produire des images de haute qualité de ces événements de signalisation dans des tissus ex vivo est d’un grand intérêt car cela permettrait l’étude de ces événements dans un système plus complexe et réaliste. Les approches précédentes ont impliqué la dissection de la cornée suivie d’une immobilisation dans un gel PEG induit par UV 7,8,9. L’immobilisation est une étape essentielle mais difficile lorsque l’on travaille avec des tissus vivants, car ils doivent rester viables et hydratés tout au long de l’expérience. De plus, l’immobilisation ne doit pas endommager le tissu. Bien que la solution de PEG ait immobilisé le tissu, la résolution et la qualité des images produites n’étaient pas cohérentes. Par conséquent, les supports imprimés en 3D ont été développés pour immobiliser les globes intacts afin de produire des images de meilleure qualité avec moins de risque de lésions tissulaires.
L’approche Un support unique imprimé en 3D a été développé pour immobiliser des globes ex vivo intacts pour l’imagerie de cellules vivantes. Ce support prévient les dommages provenant de deux sources principales: il permet l’imagerie d’un globe énucléé sans avoir besoin de disséquer la cornée, et il élimine l’exposition à la lumière UV. Sans ces sources de dommages, les images obtenues représentaient plus précisément la réponse aux blessures par égratignures faites expérimentalement. De plus, le support imprimé en 3D a été calibré aux dimensions précises de l’œil murin. Cela a fourni un bien meilleur ajustement que l’immobilisation dans la solution PEG, conduisant à une image de meilleure qualité à des objectifs de puissance inférieure en raison de la diminution du mouvement des tissus. Une barre de couverture fixée au sommet du support garantit que le globe reste immobile pendant toute la durée de l’expérience et qu’il n’y a pas de déplacement du globe lorsque le milieu de croissance est appliqué pour maintenir l’hydratation et la viabilité. La possibilité d’imprimer le support à des dimensions précises nous permet également de générer un ajustement optimal pour les yeux murins de différentes tailles en raison de l’âge ou de l’état de la maladie. Cette technologie peut être appliquée plus largement pour développer des supports pour les yeux de différentes espèces en fonction de leurs dimensions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Material for holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td>Well for imaging.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360 software</td>
			<td>Autodesk (San Rafael, CA).</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software used for printing the holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>305124</td>
			<td>For experimentally-induced wounds to the globes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask DeepRed</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>C10046</td>
			<td>Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Home Super Glue</td>
			<td>Walgreens (Deerfield, IL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For attaching the holder to the imaging well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender 3 Pro 3D printer&#160;</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For printing the holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI/ImageJ</td>
			<td>ImageJ (Bethesda, MD)</td>
			<td>License Number: GPL2</td>
			<td>Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum-Free Medium</td>
			<td>Gibco (Waltham, MA)</td>
			<td>17005042</td>
			<td>25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 &#181;g/mL, respectively) added to medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used to wash excess stain off of corneas before imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x magnification objective was used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder

La cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes est un processus migratoire initié par l’activation des récepteurs purinergiques exprimés sur les cellules épithéliales. Cette activation entraîne des événements de mobilisation du calcium qui se propagent de cellule en cellule, ce qui est essentiel pour initier la motilité cellulaire dans le lit de la plaie, favorisant une cicatrisation efficace de la plaie. Le laboratoire Trinkaus-Randall a développé une méthodologie pour imager la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes dans des globes murins ex vivo en temps réel. Cette approche consiste à énucléer un globe intact d’une souris qui a été euthanasiée selon les protocoles établis et à incuber immédiatement le globe avec un colorant indicateur de calcium. Une contre-coloration qui colore d’autres caractéristiques de la cellule peut être appliquée à ce stade pour aider à l’imagerie et montrer les points de repère cellulaires. Le protocole a bien fonctionné avec plusieurs colorants de cellules vivantes utilisés pour la contre-coloration, y compris l’actine SiR pour colorer l’actine et la coloration de membrane plasmique rouge foncé pour colorer la membrane cellulaire. Pour examiner la réponse à une plaie, l’épithélium cornéen est blessé à l’aide d’une aiguille de 25 G et les globes sont placés dans un support imprimé en 3D. Les dimensions du support imprimé en 3D sont calibrées pour assurer l’immobilisation du globe pendant toute la durée de l’expérience et peuvent être modifiées pour accueillir des yeux de différentes tailles. L’imagerie cellulaire vivante de la réponse de la plaie est réalisée en continu à différentes profondeurs dans tout le tissu au fil du temps à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole nous permet de générer des images haute résolution et de qualité publication à l’aide d’un objectif d’air 20x sur un microscope confocal. D’autres objectifs peuvent également être utilisés pour ce protocole. Il représente une amélioration significative de la qualité de l’imagerie des cellules vivantes dans les globes murins ex vivo et permet l’identification des nerfs et de l’épithélium.

Ce protocole a été utilisé pour produire systématiquement des données et des images de qualité publication10. Les images obtenues représentent une amélioration significative par rapport aux approches précédentes (Figure 2). À l’aide du support imprimé en 3D, des images peuvent être capturées à travers les couches de la cornée, et la mobilisation du calcium dans différents plans z peut être observée (Figure 3). Cette a...

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Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

Le présent travail décrit un nouveau protocole expérimental qui utilise un support imprimé en 3D pour permettre l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution de globes énucléés. Grâce à ce protocole, l’activité de signalisation cellulaire du calcium dans l’épithélium cornéen blessé des globes ex vivo peut être observée en temps réel.

Imagerie de cellules vivantes de globes ex vivo intacts à l’aide d’un nouveau support imprimé en 3D

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

Le support imprimé en 3D utilisé dans ce protocole nous permet de surveiller en temps réel la signalisation cellulaire à court terme et les événements de migration cellulaire à long terme dans les cornées blessées. En gardant le globe intact, viable et immobile, ce protocole produit des images en direct de haute qualité des cellules cornéennes, y compris l’épithélium et les nerfs. Le support imprimé en 3D pourrait facilement être modifié pour des globes de différentes tailles et espèces.Nous pouvons également orienter les yeux différemment pour imager d’autres régions ou effectuer des expériences de nano-indention. Pour commencer, après avoir retiré la tête d’une souris euthanasiée, placez-la immédiatement sur de la glace pour préserver la viabilité du tissu. Ensuite, énucléez les globes en les assoupissant à l’aide d’une pince à épiler.Et coupez le nerf optique à l’aide de ciseaux à dissection juste en dessous de l’endroit où il est maintenu par la pince à épiler. Incuber les globes dans deux millilitres du milieu dans une boîte de culture cellulaire P-35, y compris un indicateur de calcium et / ou une coloration de membrane cellulaire pendant une heure dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans des conditions de faible luminosité, en veillant à ce que les globes soient immergés dans le milieu de coloration pour une coloration uniforme. Pour coller les supports à un couvercle inférieur en verre propre, lavez le support avec de l’éthanol à 70% et placez de la colle sur le support.Ensuite, collez le support au couvercle inférieur en verre, en veillant à ce qu’aucune colle ne se trouve dans la zone interne du support, car la colle peut devenir fluorescente, ce qui complique l’imagerie. Une fois la colle solidifiée, vérifiez que le support est bien fixé contre le couvercle. Retirez les globes de la solution de coloration à l’aide des pipettes oculaires stériles, en prenant soin d’éviter d’endommager les tissus de la région d’intérêt.Lavez les globes pendant cinq minutes à température ambiante, en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile pour enlever l’excès de tache et placez les globes dans le milieu pour le transport au microscope. Pour enrouler les globes à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 25 dans la région d’intérêt, ramassez et tenez le globe à l’arrière de l’œil, en utilisant un compte-gouttes stérile pour maintenir le globe stable et l’empêcher de rouler. Pour une plaie d’égratignure, déplacez doucement une aiguille stérile de calibre 25 sur la cornée exposée ou appuyez doucement sur l’aiguille directement dans la cornée centrale pour une plaie perforante, en veillant à ce que la plaie ne perce pas la membrane basale cornéenne.Placez la cornée ou la région limbique sur le couvercle dans la zone interne du support, tout en confirmant que le globe est correctement positionné et que le site d’intérêt est en contact avec le couvercle en verre. Stabiliser à l’aide du couvercle imprimé en 3D collé au support, à l’aide de colle. Et n’essayez pas d’enlever le globe, car cela pourrait causer des dommages aux tissus.Allumez le microscope et réglez la chambre environnementale à 35 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone et vérifiez la chambre humidifiée. Placez le support de glissière et le globe stabilisé sur la platine du microscope dans la chambre environnementale et l’image, en utilisant des techniques d’imagerie de cellules vivantes. En examinant le milieu de croissance supplémentaire sur la lamelle de couverture pour prévenir la déshydratation et maintenir la viabilité des tissus, en veillant à ce qu’il y ait suffisamment de milieu dans le puits pour couvrir le globe dans le support.Commencez des expériences en utilisant des techniques d’imagerie de cellules vivantes, tout en utilisant des réglages laser de faible puissance pour préserver le tissu et prévenir les dommages tissulaires et des objectifs appropriés pour les expériences de longue durée. Enregistrez et sauvegardez les données dans le format de fichier préféré des fichiers CZI pour l’enregistrement des données. Des données d’imagerie de haute qualité de la structure multicouche ont été obtenues pour la cornée X vivo, stabilisée avec un support imprimé en 3D, démontrant des événements de signalisation du calcium dans les couches apicale, basale et stromale de la cornée.Des images Z-stack d’une cornée, immobilisée dans le support imprimé en 3D, sur une plaie scratch ont été obtenues pour visualiser les membranes cellulaires et la signalisation du calcium à travers les couches de la cornée et la mobilisation du calcium dans différents plans Z. Une expérience de série chronologique d’une cornée a été réalisée pour étudier la migration cellulaire dans le lit de la plaie pendant la réponse de guérison, révélant peu de mouvement du globe dans les directions X, Y ou Z. Il a été observé qu’en plaçant le globe dans le support, différentes régions de la cornée, à la fois au centre et dans la région limbique cornéenne peuvent être visualisées.Ce protocole nous permet d’imager les yeux à partir de modèles de maladies qui présentent des différences dans la cicatrisation des plaies. Nous pouvons caractériser les aberrations dans la signalisation cellulaire et la motilité dans les tissus vivants.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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