Name: live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder at JoVE.com

NIH'ye aşağıdaki hibe desteği için teşekkür ederiz: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ve 5T32GM008541-24 (KS). Ayrıca Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu ve New England Kornea Nakli Fonu'na da teşekkür ederiz.

Hayvan denekleri içeren prosedürler, Oftalmik Bakım ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Boston Üniversitesi IACUC protokolü (201800302) tarafından onaylanmıştır.
1. 3D baskılı tutucuların ve kapak çubuğunun tasarlanması
<ol><li>Fare kürelerinin ortalama çapını hesaba katan 3B baskılı tutucuları ve kapak çubuğunu tasarlayın ve tasarımı 3B yazdırın (Şekil 1...

<ol>
	<li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization.">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+Ca2++mobilizations:+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing.">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2++waves+in+epithelial+cells.">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+changes+in+Ca(2+)+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing.">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li><li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration.">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li><li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia.">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li><li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours.">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73 (2018).</li><li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pannexin1:+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium.">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).</li><li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling.">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).</li><li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity.">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).</li><li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca(2+)+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury.">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li><li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology.">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li></ol>

Bu protokol, bozulmamış hayvan gözlerini stabilize etmek ve hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı bir tutucu kullanan canlı bir hücre görüntüleme tekniğini tanımlar. Ex vivo kornea dokusunun önceki canlı hücre görüntüleme protokolleri ile tanınan birkaç önemli dezavantajı atlatmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, bozulmamış kürelerin canlı hücre görüntülemesi için birçok avantaj sunar. Deneysel olarak indüklenen çizik yaralarına yara iyileşmesi tepkisine müdahale ede...

Kornea Kornea gözün ön yüzeyini kaplayan, görmeyi sağlamak için ışığı kıran ve gözün içini hasardan koruyan berrak, avasküler bir yapıdır. Kornea çevreye maruz kaldığından, hem mekanik nedenlerden (çizilme) hem de enfeksiyondan kaynaklanan hasarlara karşı hassastır. Aksi takdirde sağlıklı bir hastada kornea yaralanması tipik olarak 1-3 gün içinde iyileşir. Bununla birlikte, limbal kök hücre eksikliği ve tip II diyabet gibi altta yatan koşulları olan hastalarda, kornea yarası iyileşme süreci büyük ölçüde uzayabilir1. Kornea oldukça innervatlı olduğundan, bu iyileşmeyen kornea ülserleri ve tekrarlayan kornea erozyonları çok ağrılıdır ve bunları yaşayan hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde azaltır1.
Hücre sinyalizasyonu Aksi takdirde sağlıklı bir kornea yaralandığında, yaraya bitişik hücrelerdeki kalsiyum sinyal olayları, yara yatağına hücresel göçten önce gelir ve hızlı bir şekilde göç eder, buradayara izi 2,3 riski olmadan yaralanmayı kapatırlar. Bu sinyal olayları, canlı hücre görüntüleme2 kullanılarak kornea epitel hücre kültürü modellerinde iyi karakterize edilmiştir. Ön deneyler, diyabetik olmayan hücrelerde yaralanma sonrası diyabetik hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla kalsiyum sinyallemesi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ex vivo kürelerdeki hücre sinyal olaylarının karakterizasyonunun teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır.
Canlı hücre görüntüleme Önceki çalışmalar, kornea yara iyileşmesinin in vitro hücre kültürü modellerinden kalsiyum sinyal olaylarını başarıyla kaydetmiştir 4,5,6. Bu sinyal olaylarının ex vivo dokuda yüksek kaliteli görüntülerini üretmek için bir metodoloji geliştirmek büyük ilgi çekicidir, çünkü bu olayların daha karmaşık ve gerçekçi bir sistemde incelenmesine izin verecektir. Önceki yaklaşımlar korneanın diseksiyonunu ve ardından UV kaynaklı PEG jeli 7,8,9'da immobilizasyonu içeriyordu. İmmobilizasyon, canlı doku ile çalışırken önemli ama zorlu bir adımdır, çünkü deney boyunca canlı ve hidratlı kalması gerekir. Ayrıca, immobilizasyon dokuya zarar vermemelidir. PEG çözeltisi dokuyu hareketsiz hale getirirken, üretilen görüntülerin çözünürlüğü ve kalitesi tutarlı değildi. Bu nedenle, daha az doku hasarı riski taşıyan daha yüksek kaliteli görüntüler üretmek için bozulmamış küreleri hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı tutucular geliştirilmiştir.
Yaklaşım Canlı hücre görüntüleme için bozulmamış ex vivo küreleri hareketsiz hale getirmek için benzersiz bir 3D baskılı tutucu geliştirilmiştir. Bu tutucu iki ana kaynaktan gelen hasarı önler: korneayı diseke etmeye gerek kalmadan enüklee edilmiş bir kürenin görüntülenmesini sağlar ve UV ışığına maruz kalmayı ortadan kaldırır. Bu hasar kaynakları olmadan, elde edilen görüntüler deneysel olarak yapılan çizik yaralanmalarına verilen cevabı daha doğru bir şekilde temsil ediyordu. Ayrıca, 3D baskılı tutucu, murin gözünün hassas boyutlarına göre kalibre edildi. Bu, PEG çözeltisinde immobilizasyondan çok daha iyi bir uyum sağladı ve doku hareketinin azalması nedeniyle daha düşük güçlü hedeflerde daha yüksek kaliteli bir görüntüye yol açtı. Tutucunun üst kısmına tutturulmuş bir kapak çubuğu, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını ve hidrasyon ve canlılığı korumak için büyüme ortamı uygulandığında dünyanın yer değiştirmemesini sağlar. Tutucuyu hassas boyutlara basma yeteneği, yaş veya hastalık durumu nedeniyle farklı boyutlardaki murin gözleri için en uygun uyumu sağlamamızı sağlar. Bu teknoloji, boyutlarına göre farklı türlerin gözleri için tutucular geliştirmek için daha geniş çapta uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Material for holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated</td>
			<td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td>Well for imaging.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360 software</td>
			<td>Autodesk (San Rafael, CA).</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software used for printing the holders.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>305124</td>
			<td>For experimentally-induced wounds to the globes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask DeepRed</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>C10046</td>
			<td>Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Home Super Glue</td>
			<td>Walgreens (Deerfield, IL)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For attaching the holder to the imaging well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ender 3 Pro 3D printer&#160;</td>
			<td>Creality (Shenzen, China)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For printing the holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI/ImageJ</td>
			<td>ImageJ (Bethesda, MD)</td>
			<td>License Number: GPL2</td>
			<td>Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum-Free Medium</td>
			<td>Gibco (Waltham, MA)</td>
			<td>17005042</td>
			<td>25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 &#181;g/mL, respectively) added to medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Used to wash excess stain off of corneas before imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x magnification objective was used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of intact ex vivo globes using a novel 3d printed holder

Kornea epitelyal yara iyileşmesi, epitel hücrelerinde eksprese edilen pürinerjik reseptörlerin aktivasyonu ile başlayan bir göç sürecidir. Bu aktivasyon, hücreden hücreye yayılan, yara yatağına hücresel hareketliliği başlatmak için gerekli olan ve etkili yara iyileşmesini teşvik eden kalsiyum mobilizasyon olaylarıyla sonuçlanır. Trinkaus-Randall laboratuvarı, ex vivo murin kürelerinde kornea yarasının iyileşme yanıtını gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir metodoloji geliştirdi. Bu yaklaşım, sağlam bir küreyi, belirlenmiş protokollere göre ötenazi yapılmış bir fareden çekirdeksizleştirmeyi ve dünyayı derhal bir kalsiyum gösterge boyası ile inkübe etmeyi içerir. Hücrenin diğer özelliklerini lekeleyen bir karşı boya, görüntülemeye yardımcı olmak ve hücresel yer işaretlerini göstermek için bu aşamada uygulanabilir. Protokol, aktini boyamak için SiR aktinini ve hücre zarını boyamak için koyu kırmızı plazma zarı boyası da dahil olmak üzere karşı boyama için kullanılan birkaç farklı canlı hücre boyasıyla iyi çalıştı. Bir yaraya verilen cevabı incelemek için, kornea epiteli 25 G'lik bir iğne kullanılarak yaralanır ve küreler 3D baskılı bir tutucuya yerleştirilir. 3D baskılı tutucunun boyutları, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını sağlamak için kalibre edilir ve farklı boyutlardaki gözlere uyacak şekilde değiştirilebilir. Yara yanıtının canlı hücre görüntülemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak zaman içinde doku boyunca çeşitli derinliklerde sürekli olarak gerçekleştirilir. Bu protokol, konfokal mikroskopta 20x hava hedefi kullanarak yüksek çözünürlüklü, yayın kalitesinde görüntüler üretmemizi sağlar. Bu protokol için başka hedefler de kullanılabilir. Ex vivo murin kürelerde canlı hücre görüntüleme kalitesinde önemli bir iyileşmeyi temsil eder ve sinirlerin ve epitelin tanımlanmasına izin verir.

Bu protokol sürekli olarak yayın kalitesinde veri ve görüntü üretmek için kullanılmıştır10. Elde edilen görüntüler önceki yaklaşımlara kıyasla önemli bir iyileşmeyi temsil etmektedir (Şekil 2). 3D baskılı tutucu kullanılarak, kornea katmanları boyunca görüntüler yakalanabilir ve farklı z-düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonu gözlemlenebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım, genç ve yaşlı farelerde bir yarada apik...

Watch this Scientific Journal Video about Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder at JoVE.com

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

Bu çalışma, enüklee edilmiş kürelerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini sağlamak için 3D baskılı bir tutucu kullanan yeni bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Bu protokol sayesinde, ex vivo kürelerden yaralı kornea epitelindeki hücresel kalsiyum sinyal aktivitesi gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

Bu protokolde kullanılan 3D baskılı tutucu, yaralı kornealarda kısa süreli hücre sinyallemesini ve uzun süreli hücresel göç olaylarını gerçek zamanlı olarak izlememizi sağlar. Dünyayı sağlam, canlı ve hareketsiz tutarak, bu protokol epitel ve sinirler de dahil olmak üzere kornea hücrelerinin yüksek kaliteli canlı görüntülerini üretir. 3D baskılı tutucu, çeşitli boyut ve türlerdeki küreler için kolayca değiştirilebilir.Ayrıca gözleri diğer bölgeleri görüntülemek veya nano girinti deneyleri yapmak için farklı şekilde yönlendirebiliriz. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin kafasını çıkardıktan sonra, dokunun canlılığını korumak için hemen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra cımbız kullanarak küreleri pervane dozerleyerek enüklee edin.Ve optik siniri, cımbız tarafından tutulduğu yerin hemen altındaki diseksiyon makası kullanarak kırpın. Küreleri, bir P-35 hücre kültürü kabında, 37 santigrat derecede bir inkübatörde bir saat boyunca bir kalsiyum göstergesi ve / veya hücre zarı boyası ve düşük ışık koşullarında% 5 karbondioksit de dahil olmak üzere ortamın iki mililitresinde inkübe ederek kürelerin düzgün boyama için leke ortamına batırılmasını sağlayın. Tutucuları temiz bir cam alt kapak kaymasına yapıştırmak için, tutucuyu% 70 etanol içinde yıkayın ve tutucunun üzerine yapıştırıcı yerleştirin.Ardından, tutucuyu cam alt kapak kaymasına yapıştırın, tutkalın tutucunun iç alanında olmadığından emin olun, çünkü yapıştırıcı floresan yapabilir ve görüntülemeyi zorlaştırabilir. Tutkal katılaştıktan sonra, tutucunun kapak kaymasına karşı sağlam olduğunu onaylayın. Steril damlalıkları kullanarak küreleri boyama çözeltisinden çıkarın, ilgilenilen bölgeye doku hasarını önlemeye özen gösterin.Fazla lekeyi çıkarmak için steril fosfat tamponlu salin kullanarak küreleri oda sıcaklığında beş dakika yıkayın ve küreleri mikroskopa taşımak için ortama yerleştirin. İlgilenilen bölgede steril bir 25 gauge iğne kullanarak küreleri sarmak için, dünyayı sabit tutmak ve yuvarlanmasını önlemek için steril bir damlalık kullanarak dünyayı gözün arkasından alın ve tutun. Çizik yarası için, steril bir 25 gauge iğneyi açıkta kalan kornea boyunca yavaşça hareket ettirin veya delinme yarası için iğneyi doğrudan merkezi korneaya hafifçe bastırarak yaranın kornea bazal membranını delmemesini sağlayın.Kornea veya limbal bölgesi, tutucunun iç bölgesindeki kapak kayması üzerine yerleştirin, aynı zamanda kürenin doğru konumlandırıldığını ve ilgilenilen bölgenin cam kapak kaymasıyla temas halinde olduğunu onaylayın. Tutucuya yapıştırılmış 3D baskılı kapağı yapıştırıcı kullanarak stabilize edin. Ve dünyayı çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu doku hasarına neden olabilir.Mikroskobu açın ve çevre odasını 35 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite ayarlayın ve nemlendirilmiş odayı doğrulayın. Kapak kayma tutucusunu ve stabilize edilmiş küreyi, canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak çevre odası ve görüntüsü içindeki mikroskop aşamasına yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek ve doku canlılığını korumak için kapak kaymasına ek büyüme ortamını inceleyerek, kuyuda tutucudaki dünyayı örtmek için yeterli ortam olmasını sağlayın.Dokuyu korumak ve doku hasarını önlemek için düşük güçlü lazer ayarları ve uzun süreli deneyler için uygun hedefleri kullanırken canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak deneylere başlayın. Veri kaydı için CZI dosyalarının tercih edilen dosya biçiminde verileri kaydedin ve kaydedin. X vivo kornea için, korneanın apikal, bazal ve stromal tabakalarında kalsiyum sinyal olaylarını gösteren, 3D baskılı tutucu ile stabilize edilmiş çok katmanlı yapıda yüksek kaliteli görüntüleme verileri elde edildi.3D baskılı tutucuda hareketsiz hale getirilmiş bir korneanın Z-yığını görüntüleri, kornea katmanları boyunca hücre zarlarını ve kalsiyum sinyalini ve farklı Z düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonunu görselleştirmek için bir çizik yarası elde edildi. İyileşme yanıtı sırasında yara yatağına hücresel göçü incelemek için bir korneanın zaman serisi deneyi yapıldı ve dünyanın X, Y veya Z yönlerinde çok az hareketini ortaya çıkardı. Kürenin tutucuya yerleştirilmesiyle korneanın hem merkezi hem de kornea limbal bölgesinde farklı bölgelerinin görselleştirilebileceği gözlenmiştir.Bu protokol, yara iyileşmesinde farklılıklar gösteren hastalık modellerinden gözleri görüntülememizi sağlar. Hücre sinyalizasyonundaki anormallikleri ve canlı dokudaki hareketliliği karakterize edebiliriz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Biyokimya

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrasyon-Alerjik Vitro miktar Protein Homo-Oligomerizasyonda ticari araçları ve ücretsiz, açık kaynak parlaklık analiz yazılımı kullanarak

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Minimal arka plan saçılma ile Macromoleküler X-ışını Kristalografi için bir hepsi bir arada örnek tutucu

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...