Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة العلوم الأساسية (# 285480) من CONACyT وقسم أبحاث المناعة السريرية في كلية العلوم الكيميائية الحيوية ، جامعة أوتونوما "بينيتو خواريز" دي أواكساكا. A.A.A، S.A.S.L، و W.J.R.R. لديها زمالات الدكتوراه من أرقام CONACyT # 799779 و # 660793 و # 827788 ، على التوالي.

تم الحصول على عينات الدم كتبرعات من المشاركين الأصحاء سريريا بعد الموافقة المستنيرة. تم إجراء جميع التجارب بإذن من لجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة لكلية العلوم الكيميائية الحيوية ، جامعة أوتونوما "بينيتو خواريز" في أواكساكا.
ملاحظة: كانت معايير التضمين في الدراسة غير...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

يجب الحصول على مجموعة عالية النقاء من العدلات القابلة للحياة للحث على إطلاق الشبكات لأن هذه الخلايا لها عمر محدود خارج الجسم الحي يبلغ 8 ساعات في المتوسط ، وهي فترة يجب خلالها إجراء جميع التجارب. تحقيقا لهذه الغاية ، فإن المنهجية المثالية هي التدرج مزدوج الكثافة لتحسين وقت التنقية عن ...

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في مجرى الدم ، وتلعب دورا أساسيا أثناء إزالة العوامل المسببة للأمراض من خلال عدة آليات ، بما في ذلك إطلاق هياكل الكروماتين الكبيرة المكونة من الحمض النووي والعديد من البروتينات المضادة للبكتيريا النووية والسيتوبلازمية والحبيبية 1,2. تم إجراء السابقة المباشرة التي تصف هذا الدور المضاد للميكروبات للعدلات بواسطة Takei et al.3 في عام 1996. أبلغ هؤلاء المؤلفون عن شكل جديد من الموت يختلف عن موت الخلايا المبرمج والتنخر في العدلات ، وأظهروا تغيرات مورفولوجية تظهر تمزقا نوويا ، يليه انسكاب من بلازما النواة إلى السيتوبلازم ، وزيادة في نفاذية الغشاء من 3 ساعات من الحضانة مع أسيتات ميريستات فوربول (PMA) 2,3. ومع ذلك ، لم يتم استخدام مصطلح "مصائد العدلات خارج الخلية (NETs)"حتى عام 2004 4.
لوحظ تكوين NET في ظروف مختلفة ، مثل الالتهابات البكتيرية والفطرية5 والفيروسية6 والطفيلية ، لتحييد وقتل ومنع انتشار الميكروبات7. تظهر دراسات أخرى أنه يمكن أن يحدث أيضا في الحالات غير المسببة للأمراض عن طريق المنبهات المعقمة ، مثل السيتوكينات وحمض اليوريك أحادي الصوديوم أو بلورات الكوليسترول والأجسام المضادة الذاتية والمجمعات المناعية والصفائح الدموية المنشطة7. كانت عديد السكاريد الشحمي (LPS) وإنترلوكين -8 (IL-8) و PMA من بين المحفزات الأولى في المختبر الموصوفة بأنها محرضات NET ، وتم إثبات مشاركة NET في الجسم الحي في العمليات المسببة للأمراض في نموذجين من الالتهاب الحاد: الزحار التجريبي والتهاب الزائدة الدودية البشري التلقائي4. الحمض النووي هو مكون NET أساسي. هيكلها وتكوينها المناسبان ضروريان لعزل الكائنات الحية الدقيقة وقتلها عن طريق توصيل تركيز محلي عال من جزيئات مضادات الميكروبات نحو الميكروبات التي تم اصطيادها ، كما يتضح من علاج ديوكسي ريبونوكلياز (DNase) الموجز الذي يفكك الشبكات وخصائصها القاتلةللميكروبات 4. إلى جانب الحمض النووي ، تشتمل الشبكات على بروتينات متصلة مثل الهستونات ، وإيلاستاز العدلات (NE) ، والكاثيبسين G (CG) ، والبروتيناز 3 ، واللاكتوفيرين ، والجيلاتيناز ، والمايلوبيروكسيديز (MPO) ، والببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) مثل الببتيد الكاتيوني المؤيد للالتهابات cathelicidin LL-37 من بين أمور أخرى 8,9. قد تشكل هذه المجاميع خيوطا أكبر بأقطار تصل إلى 50 نانومتر. هذه العوامل يمكن أن تعطل عوامل الفوعة الميكروبية أو سلامة غشاء الخلية الممرضة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل AMPs تثبيت الحمض النووي المشتق من NET ضد التدهور بواسطة النيوكليازات البكتيرية10.
لم يتم بعد توضيح الآليات المحددة التي تنظم تكوين NET بشكل كامل. أفضل مسار مميز يؤدي إلى إطلاق NET هو من خلال إشارات ERK ، مما يؤدي إلى تنشيط NADPH oxidase وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، بالإضافة إلى زيادة الكالسيوم داخل الخلايا الذي يؤدي إلى تنشيط مسار MPO. وهذا بدوره يحول بيروكسيد الهيدروجين إلى حمض هيبوكلوروس ، وينشط NE عن طريق الأكسدة11,12. NE مسؤول عن تحلل خيوط الأكتين في الهيكل الخلوي لمنع البلعمة ونقلها إلى النواة للمعالجة عن طريق الانقسام المحلل للبروتين وإزالة الأمين بواسطة PAD4 التي تدفع إزالة حساسية ألياف الكروماتين ، والتي ترتبط بالبروتينات الحبيبية والسيتوبلازمية ، ثم يتم إطلاقها خارج الخلية7. تشمل هذه البروتياز تلك المنبعثة من مجمع الأزوروسوم لحبيبات الأزوروفيل والبروتياز الأخرى مثل cathepsin G13.
اعتمادا على التغيرات المورفولوجية في العدلات ، يتم تصنيف الشبكات إلى نوعين: تكوين NET انتحاري أو lytic يؤدي إلى موت الخلية4 ، وتشكيل NET حيوي أو غير lytic ينتج عن خلايا قابلة للحياة بوساطة إطلاق حويصلي من الحمض النووي أو الميتوكوندريا ، مع بقايا من cytoplast anucleated مع القدرة البلعمية14,15. بشكل عام ، تقدم الشبكات المكونة من الحمض النووي للميتوكوندريا مورفولوجيا ممدودة من الألياف14 ، في حين أن تلك المكونة من الحمض النووي النووي لها مظهر يشبه السحابة3. ومع ذلك ، من غير المعروف كيف يختار العدلة أصل الحمض النووي. على عكس الدراسات السابقة التي وصفت المسارات الكنسية للشبكات بأنها تتطلب عدة ساعات ، يتم تنشيط المسار الحيوي بسرعة في 5-60 دقيقة15 دقيقة فقط.
على الرغم من هذه التطورات ، يختلف التكوين الصافي اعتمادا على الحافز. على سبيل المثال ، تحفز سلالات مخاطية وغير مخاطية مختلفة من P. aeruginosa تكوين شبكات تحتوي على 33 بروتينا شائعا وما يصل إلى 50 بروتينا متغيرا7. وبالتالي ، من الضروري تجانس التقنيات التي تسمح بتوليد استنتاجات موضوعية في مجموعات البحث. تصف هذه الورقة بروتوكولا بتقنيات مختلفة تسمح بمقارنة وتقييم تكوين وهيكل ومورفولوجيا الشبكات المستحثة مع الكائنات الحية الدقيقة المختلفة: المكورات العنقودية الذهبية (بكتيريا إيجابية الجرام) ، Pseudomonas aeruginosa (بكتيريا سالبة الجرام) ، والمبيضات البيض (الفطريات) ، وكذلك المحفزات الكيميائية (PMA ، HOCl) في العدلات البشرية من الأفراد الأصحاء. توضح النتائج التمثيلية عدم تجانس الشبكات اعتمادا على محفزاتها المحفزة في ظل ظروف مماثلة في المختبر ، والتي تتميز بتلطيخ DNA-DAPI ، والتلطيخ المناعي ل LL37 ، والقياس الكمي للنشاط الأنزيمي (NE و CG و MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

تعمل العدلات كخط أول للدفاع الخلوي في الاستجابة المناعية الفطرية من خلال استخدام آليات متنوعة ، مثل تكوين مصائد العدلات خارج الخلية (NETs). تحلل هذه الدراسة التغيرات المورفولوجية والتركيبية في الشبكات التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية باستخدام منهجيات موحدة في المختبر لتحريض NET وتوصيف الخلايا البشرية. تسمح الإجراءات الموضحة هنا بتحليل مورفولوجيا NET (lytic أو non-lytic) وتكوينها (هياكل بروتين الحمض النووي والنشاط الأنزيمي) ، وتأثير العوامل القابلة للذوبان أو الاتصال الخلوي على هذه الخصائص. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل التقنيات الموضحة هنا لتقييم تأثير العوامل الخارجية القابلة للذوبان أو الاتصال الخلوي على تكوين NET.
تشمل التقنيات المطبقة تنقية الخلايا متعددة الأشكال النووية من الدم المحيطي البشري باستخدام تدرج مزدوج الكثافة (1.079-1.098 جم / مل) ، مما يضمن النقاء الأمثل والجدوى (≥ 95٪) كما يتضح من تلطيخ رايت ، واستبعاد تريبان الأزرق ، وقياس التدفق الخلوي ، بما في ذلك تحليل FSC مقابل SSC وتلطيخ 7AAD. يتم تحفيز تكوين NET مع الميكروبات (Pseudomonas aeruginosa ، المكورات العنقودية الذهبية ، والمبيضات البيض) والمحفزات الكيميائية (أسيتات phorbol myristate ، HOCl) ، وتتميز NETs بتلطيخ DNA-DAPI ، والتلوين المناعي لكاثيليسيدين الببتيد المضاد للميكروبات (LL37) ، وقياس النشاط الأنزيمي (إيلاستاز العدلات ، والكاثيبسين G ، والميلوبيروكسيداز). يتم الحصول على الصور من خلال الفحص المجهري الفلوري وتحليلها باستخدام ImageJ.

نقاء وصلاحية العدلات يتم تصور المراحل الخلوية الديناميكية في الأنبوب من تنقية التدرج مزدوج الكثافة. داخل هذه الطبقات ، تكون الطبقة المقابلة للخلايا المحببة أعلى من طبقة الكثافة 1.079 جم / مل ، والتي تتميز عن مراحل الخلايا وحيدة الدم المحيطية (PBMCs) وكريات الدم الحمراء (ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

يظهر هنا بروتوكول لتحريض وتحليل مصائد العدلات خارج الخلية في المختبر (NETs). أسفر القياس الكمي للحمض النووي والكاثيليسيدين (LL37) ونشاط الإنزيم عن بيانات تظهر التباين في تكوين ومورفولوجيا الشبكات التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية في ظل ظروف مضبوطة مماثلة.

التحليل المورفولوجي والتركيبي لمصائد العدلات خارج الخلية التي تسببها المحفزات الميكروبية والكيميائية

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

يوضح هذا البروتوكول عدم التجانس في تكوين وهيكل ومورفولوجيا مصائد العدلات خارج الخلية ، اعتمادا على محفزها المحفز في ظل ظروف مماثلة في المختبر في العدلات البشرية من الأفراد الأصحاء. يتم الحصول على نقاء العدلات العالية والجدوى. يسمح ذلك بمقارنة تركيز الحمض النووي ، LL-37 ، ونشاط الإنزيم ل myeloperoxidase و elastase و cathepsin G ، التي تطلقها مصائد العدلات خارج الخلية.سمح هذا البروتوكول بتحليل تأثير العوامل القابلة للذوبان أو الاتصال الخلوي أو العلاجات أو الآليات الممكنة لإغلاق إنتاج الشبكات في أمراض المناعة الذاتية. هذه الطرق يمكن أن تساعد في التحقيق في أمراض المناعة الذاتية. بسبب تكاثر الخلايا غير المنضبط للشبكات ومدة محاذاة مكوناتها ، والتي تعتبر مؤشرات حيوية للمرض.يسمح الفحص المجهري الفلوري بالتقاط صورة لشبكات تظهر تشتت الحمض النووي بالاشتراك مع بروتين مثل LL37 ، والذي يتزامن مع الكائنات الحية الدقيقة مما يساعد على فهم كيفية ظهورها. للبدء ، قم بإجراء ثقب الوريد لجمع 10 ملليلتر من الدم المحيطي في أنابيب تحتوي على ثنائي البوتاسيوم EDTA كمضاد للتخثر. ثم قم بإجراء القياس الحيوي القياسي للدم واختبار البروتين التفاعلي C لاستبعاد العدوى أو الالتهاب لضمان جودة العينة.قم بالطرد المركزي لعينة الدم المحيطية لإزالة البلازما الغنية بالصفائح الدموية ، متبوعة بطرد مركزي ثان وتخلص من البلازما المتبقية. تمييع حزمة كريات الدم الحمراء والكريات البيض الناتجة في نسبة حجم واحد إلى واحد مع واحد DPBS واحد 1X. بعد ذلك، في أنبوب زجاجي معقم حجمه 10 ملليلتر، أودع أولا ملليلترا واحدا من 1.08 جرام لكل محلول كثافة ملليلتر متبوعا بملليلتر واحد يساوي 1.079 جرام لكل محلول كثافة ملليلتر.ثم ، أضف أربعة ملليلتر من حزمة كرات الدم الحمراء المخففة والكريات البيض عن طريق سكب الجدران. جهاز طرد مركزي بدون تسارع أو تباطؤ لتجنب إزعاج التدرج. نضح المرحلة المقابلة للخلايا المحببة ونقلها إلى أنبوب زجاجي معقم آخر سعة 10 ملليلتر.اغسل بأربعة ملليلتر من 1X DPBS عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية. لإزالة كريات الدم الحمراء المتبقية ، عالج الخلايا بالصدمة التناضحية بإضافة أربعة ملليلتر من محلول ملحي 0.2٪. احتضان لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي.تخلص من المادة الطافية وأضف أربعة ملليلتر من محلول ملحي 0.65٪. احتضان لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لاستعادة سلامة الغشاء وتكرار الطرد المركزي. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في أربعة ملليلتر من 1X DPBS لإزالة الحطام الخلوي.مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر من المخزن المؤقت HBSS البارد. لإجراء اختبار استبعاد تريبان الأزرق ، قم بتخفيف خمسة ميكرولتر من معلق الخلية في 20 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق. عد الخلايا في غرفة باور جديدة وحدد صلاحية الخلية باستخدام اختبار الاستبعاد.بعد ذلك ، قم بتركيب 5 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة وصمة عار مع صبغة رايت لمدة 15 ثانية. قم بإصلاح العينة على الفور ، واغسلها بالماء المقطر ، وراقب التشكل تحت المجهر الضوئي. بعد ذلك ، أضف واحدا في 10 إلى الخلايا الخامسة لتدفق أنابيب القياس الخلوي وتلطيخها بميكرولتر واحد من 7AAD في 100 ميكرولتر من مخزن FACS المؤقت لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.تغسل مع 500 ميكرولتر من العازلة FACS في 300 غرام لمدة 10 دقائق. ثبت الخلايا ب 500 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد وخزنها عند أربع درجات مئوية حتى تحليل التدفق الخلوي. للتحكم في الخلايا الميتة ، قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة واغسلها ب 500 ميكرولتر من 1XPBS عند 300 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.تخلص من المادة الطافية وأضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100. احتضان لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. يغسل مع 500 ميكرولتر من 1X PBS وصمة عار مع 7AAD.تحليل البيانات التي تم التقاطها في برنامج مقياس التدفق الخلوي. قم بتحميل الملفات وانقر نقرا مزدوجا فوق ملف العدلات غير الملوث. اختر التشتت الأمامي أو FSC على المحور X والتشتت الجانبي أو SSC على المحور Y لعرض عدد الخلايا المقابل للعدلات.ثم حدد القناة B3-A: PerCP vio 700-A على المحور X لإلغاء تحديد التألق الذاتي للخلايا واختيار الرسم البياني على المحور Y. ثم افتح ملف العدلات الملون. اختر FSC على المحور X و SSC على المحور Y لعرض عدد الخلايا المقابل للعدلات.مرة أخرى ، حدد القناة B3-A: PerCP vio 700-A لتحديد عدد العدلات الإيجابية للصبغة 7AAD. قم بإنشاء الرسم البياني النهائي بالنقر بزر الماوس الأيمن على النافذة وتحديد نسخ إلى محرر التخطيط. أضف الخيوط الكاذبة البكتيرية أو الفطرية في أنابيب صغيرة سعة 1.5 ملليلتر.أضف 200 ميكرولتر ، لذلك خمسة ميكرومولار CFSC في 1X PBS. تخلط وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام. أوقف التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر من البلازما وأجهزة الطرد المركزي غير المكملة.تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بملليلتر واحد من 1XPBS مع الطرد المركزي. ثم أعد تعليق الكائنات الحية الدقيقة في 250 ميكرولتر من 1X PBS. تحضير 50 ميكرولتر من الأليتيوب في أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر مع اثنين في 10 أس البكتيريا السابعة أو مرتين في 10 أس الخيوط الكاذبة الخامسة للتحريض الصافي.ضع زلات الغطاء الزجاجي المعقم 10 × 10 ملليمترات في لوحة من 24 بئرا. غطيها ب 10 ميكرولتر من 0.001٪ بولي ل-ليسين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واغسلها مرتين ب 100 ميكرولتر من 1X PBS. يجف في الهواء ويشع بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.بعد ذلك ، استبدل محلول HBSS لتعليق العدلات الذي تم إعداده مسبقا بوسط RPMI 1640 المكمل ببلازما ذاتية غير مكتملة بالحرارة بنسبة 10٪. أضف 350 ميكرولترا من هذا المعلق الخلوي إلى الصفيحة المكونة من 24 بئرا للحصول على تركيز نهائي قدره اثنان في 10 أس العدلات الخامسة لكل بئر. احتضان اللوحة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح للخلايا بالالتصاق بقاع الآبار.للحث على تكوين الشبكة ، أضف محفزات البكتيريا MOI100 و pseudohyphae في MOI1. أضف أيضا المنبهات الكيميائية الحيوية وقم بإعداد عنصر تحكم بدون حافز بإضافة 50 ميكرولتر من HBSS. احصل على حجم نهائي يبلغ 400 ميكرولتر لكل بئر واخلطه على شاكر لوحة عند 140 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.ثم احتضان لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحث الصافي ، قم بإزالة المادة الطافية من الآبار عن طريق السحب بعناية وإصلاح الخلايا ب 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 1X PBS بدون طرد مركزي وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة 30 دقيقة.بالنسبة للبقع LL37 ، قم بتخلل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X-100 في 1X PBS لمدة 10 دقائق واغسلها باستخدام 1X PBS مرتين. قم بتركيب الغطاء على الشرائح الزجاجية. يقوم الحمض النووي بتلطيخ الخلايا بميكرولترين من DAPI وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تحليلها بواسطة الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر.تم تصور المراحل الخلوية الديناميكية بعد تنقية التدرج مزدوج الكثافة. تم تأكيد مورفولوجيا العدلات النموذجية عن طريق تلطيخ الحق. أظهرت الخلايا أيضا قابلية مثالية لوحظت من خلال استبعاد تريبان الأزرق دون تعطيل الغشاء.أكد تحليل SSC مقابل FSC عن طريق قياس التدفق الخلوي وجود مجموعة سكانية تتوافق مع PMN بنقاوة خلايا عالية. أشارت مخططات PMN النقطية للخلايا غير الملوثة مقابل خلايا البقع 7AAD والرسوم البيانية الخاصة بها إلى وجود قابلية عالية للخلايا في العدلات المعزولة حديثا مقارنة بخلايا التحكم المخترقة. بعد تحفيز العدلات بالمنشطات الكيميائية والميكروبية ، تم تصور الشبكات بواسطة الفحص المجهري الفلوري باستخدام DNA DPI ومضاد LL37.كانت الكائنات الحية الدقيقة ملطخة مسبقا ب CFSE. يشار إلى تكوين الشبكة الانتحارية التي يسببها PMA عن طريق التوطين المشترك مع LL37. في حين أن الشبكات التي تشكلت مع HOCI أظهرت تشتتا طفيفا للحمض النووي في الفضاء خارج الخلية الذي يتوافق مع تكوين NET الحيوي.أظهرت NET التي يسببها الخيوط الكاذبة الفطرية تركيزات منخفضة من الحمض النووي الذي تم إطلاقه في الفضاء خارج الخلية مع هياكل خيطية مميزة لتشكيل NET الحيوي. أظهرت S.aureus تكوينا حيويا لصافي الشبكة بينما حفزت P.aeruginosa إطلاق تركيزات كبيرة من الحمض النووي مع مورفولوجيا غائمة تركزت بشكل مشترك مع LL37 مما يشير إلى تكوين NET الانتحاري. يتيح لنا أداء منهجية التدرج مزدوج الكثافة الحصول على نقاء عالي وصلاحية للعدلات.ونحن نرفع الغسالات ، ونتجنب إتلاف هيكلها. باتباع هذه الطريقة ، يمكننا تحليل تأثير المواد أو الخلايا في الإنتاج الصافي وكذلك ما إذا كانت متورطة في بعض الآليات أو استخدامها كعلاجات في أمراض المناعة الذاتية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

تحديد الفخاخ نيوتروفيل خارج الخلية في البارافين جزءا لا يتجزأ من الخيط الشرياني Thrombi باستخدام المجهر Immunofluorescence

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

التصوير المناعي لمصائد العدلات خارج الخلية في الأنسجة البشرية والفأر

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...