Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

这项工作得到了CONACyT的基础科学资助（#285480）和瓦哈卡自治大学贝尼托·华雷斯大学生物化学科学学院临床免疫学研究系的支持。A.A.A，S.A.S.L.和W.J.R.R.分别拥有CONACyT编号#799779，#660793和#827788的博士奖学金。

血液样本是在知情同意后从临床健康受试者那里作为捐赠获得的。所有实验均在瓦哈卡自治大学“贝尼托·华雷斯”生物化学科学学院人类研究伦理委员会的许可下进行。
注意：研究中的纳入标准是性别和年龄模糊不清，根据参与者在采集血液样本前对问卷的回答，临床健康。进行血液学分析以确定细胞计数并排除感染或贫血，以及C反应蛋白测试以排除供体中的炎症。
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	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

必须获得高纯度的活中性粒细胞群以诱导NET的释放，因为这些细胞的 离体 寿命有限，平均为8小时，必须在这段时间内进行所有实验。为此，理想的方法是双密度梯度，通过分离对外源性刺激更敏感的非活化细胞来优化纯化时间，与Ficoll-Histopaque梯度或葡聚糖沉降技术相比17。双密度梯度法的另一个优点是，与依赖于细胞表面抗原（例如中性粒细胞中的CD16hi ）的高...

中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，在通过多种机制清除致病剂的过程中起着至关重要的作用，包括释放由DNA和几种核，细胞质和颗粒抗菌蛋白组成的大染色质结构1，2。描述中性粒细胞这种抗菌作用的直接前因是由Takei等人于1996年提出的。这些作者报告了一种不同于中性粒细胞凋亡和坏死性凋亡的新死亡形式，表现出表现出核破裂的形态变化，然后从核质溢出到细胞质中，并且膜通透性从与佛波肉豆蔻酸酯（PMA）孵育3小时后增加2，3。然而，直到2004年才使用术语“中性粒细胞细胞外陷阱（NET）”4。
在细菌、真菌5、病毒6 和寄生虫感染等各种条件下观察到 NET 形成，用于中和、杀死和防止微生物传播7。其他研究表明，它也可以通过无菌刺激在非致病条件下发生，例如细胞因子、尿酸单钠或胆固醇晶体、自身抗体、免疫复合物和活化的血小板7.脂多糖（LPS），白细胞介素-8（IL-8）和PMA是最早被描述为NET诱导剂的 体外 刺激，并且在两种急性炎症模型中 证明了体内 NET参与致病过程：实验性痢疾和自发性人阑尾炎4。DNA是必不可少的NET成分。其适当的结构和组成对于通过向捕获的微生物提供高局部浓度的抗菌分子来隔离和杀死微生物是必要的，正如分解NET及其杀微生物特性的简短脱氧核糖核酸酶（DNase）处理所证明的那样4。除 DNA 外，NET 还包括附着蛋白，例如组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE）、组织蛋白酶 G （CG）、蛋白酶 3、乳铁蛋白、明胶酶、髓过氧化物酶 （MPO） 和抗菌肽 （AMP），例如阳离子促炎肽 cathelicidin LL-37 等8，9。这种聚集体可以形成直径达50nm的较大螺纹。这些因素可以破坏微生物毒力因子或病原体细胞膜的完整性;此外，AMPs可以稳定NET衍生的DNA，防止细菌核酸酶降解10。
调控NET形成的具体机制尚未完全明确。导致NET释放的最佳特征途径是通过ERK信号传导，这导致NADPH氧化酶活化和活性氧（ROS）产生，以及触发MPO途径激活的细胞内钙增加。这反过来将过氧化氢转化为次氯酸，通过氧化激活NE 11，12。NE负责降解细胞骨架的肌动蛋白丝以阻断吞噬作用，并将它们转移到细胞核中，通过蛋白水解切割和PAD4脱氨进行处理，PAD4驱动染色质纤维脱敏，染色质纤维与颗粒和细胞质蛋白结合，然后细胞外释放7。这些蛋白酶包括从藜红细胞颗粒的azurosome复合物释放的蛋白酶和其他蛋白酶（例如组织蛋白酶G13）。
根据中性粒细胞的形态变化，NET分为两种类型：导致细胞死亡的自杀性或溶解性NET形成4，以及由核或线粒体DNA囊泡释放介导的活细胞产生的重要或非溶解NET形成，具有吞噬能力的无核细胞质体的残余14，15。通常，由线粒体DNA组成的NETs呈现细长的纤维14 形态，而由核DNA结构的NET具有云状外观3。然而，目前尚不清楚中性粒细胞如何选择其DNA起源。与先前将NET的规范途径描述为需要几个小时的研究相反，重要途径在5-60分钟内迅速激活15。
尽管取得了这些进展，但NET的组成因刺激措施而异;例如，铜绿假单胞菌的不同粘液和非粘液菌株诱导含有33种常见蛋白质和多达50种可变蛋白质的NETs的形成7。因此，有必要使允许在研究小组中产生客观结论的技术同质化。本文描述了一种具有各种技术的协议，可以比较和评估由不同微生物诱导的NET的组成，结构和形态：金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌），铜绿假单胞菌（革兰氏阴性细菌）和白色念珠菌（真菌），以及来自健康个体的人中性粒细胞中的化学刺激（PMA，HOCl）。代表性结果表明，NETs的异质性取决于其在可比体外条件下的诱导刺激，其特征在于DNA-DAPI染色，LL37免疫染色和酶活性定量（NE，CG和MPO）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

中性粒细胞通过采用多种机制（例如中性粒细胞细胞外陷阱（NET）的形成）作为先天免疫反应的第一道细胞防御线。本研究使用标准化的 体外 方法分析了微生物和化学刺激诱导的NETs的形态和组成变化，用于人体细胞的NET诱导和表征。这里描述的程序允许分析NET形态（裂解或非裂解）和组成（DNA-蛋白质结构和酶活性），以及可溶性因子或细胞接触对这些特征的影响。此外，可以修改此处描述的技术以评估外源性可溶性因子或细胞接触对NET组成的影响。
应用的技术包括使用双密度梯度（1.079-1.098 g/mL）从人外周血纯化多形核细胞，保证最佳纯度和活力（≥95%），如Wright染色，台盼蓝排除和流式细胞术（包括FSC与SSC分析和7AAD染色）所示。通过微生物（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和 白色念珠菌）和化学（醋酸佛波肉豆蔻酸酯，HOCl）刺激诱导NET形成，NET的特征是DNA-DAPI染色，抗菌肽cathelicidin（LL37）的免疫染色以及酶活性（中性粒细胞弹性蛋白酶，组织蛋白酶G和髓过氧化物酶）的定量。通过荧光显微镜获取图像并使用ImageJ进行分析。

中性粒细胞的纯度和活力 动态细胞相在试管中通过双密度梯度纯化可视化。在这些层中，对应于粒细胞的层高于1.079 g/mL密度层，与外周血单核细胞（PBMC）和红细胞的阶段不同（图1A）。通过观察与成熟中性粒细胞对应的线状细丝连接的分段细胞核的细胞，通过Wright染色验证纯化细胞的形态（图2A）。由于中性粒细胞的半衰期缩短，活力?...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

这里介绍的是用于体外中性粒细胞细胞 外 陷阱（NET）的诱导和分析方案。对DNA，cathelicidin（LL37）和酶活性的定量产生了数据，这些数据显示了在类似受控条件下由微生物和化学刺激诱导的NET的组成和形态的变化。

微生物和化学刺激诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形态学和组成分析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

该协议证明了中性粒细胞细胞外陷阱的组成，结构和形态的异质性，这取决于它们在健康个体的人中性粒细胞的可比体外条件下的诱导刺激。获得高中性粒细胞纯度和活力。这允许比较中性粒细胞细胞外陷阱释放的DNA，LL-37和髓过氧化物酶，弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的酶活性的浓度。该协议允许分析可溶性因子或细胞接触或可能的疗法或关闭自身免疫性疾病中NETs产生机制的影响。这些方法可以帮助检查自身免疫性疾病。由于NET的不受控制的细胞繁殖和对齐其成分的持续时间，这被认为是疾病的生物标志物。荧光显微镜允许捕获NET的图像，显示与蛋白质（如LL37）相关的DNA分散，LL37与微生物共定位，有助于了解它们的外观。首先，进行静脉穿刺以在含有EDTA二钾作为抗凝剂的管中收集10毫升外周血。然后进行标准的血液生物测定和C反应蛋白测试，以排除感染或炎症，以确保样本的质量。离心外周血样品以去除富含血小板的血浆，然后进行第二次离心并丢弃剩余的血浆。用一个 1X DPBS 以一比一的体积比稀释所得的红细胞和白细胞包。然后，在无菌的10毫升玻璃管中，首先沉积一毫升1.08克/毫升密度溶液，然后一毫升1.079克/毫升密度溶液。然后，倒在壁上，加入四毫升稀释的红细胞和白细胞包装。离心机不加减速，以免干扰梯度。吸出对应于粒细胞的相，并转移到另一个无菌的10毫升玻璃管中。用4毫升1X DPBS在300G下在4摄氏度下洗涤10分钟，弃去上清液。为了去除剩余的红细胞，通过加入四毫升0.2%盐水溶液来用渗透休克处理细胞。在四摄氏度下孵育两分钟并离心。弃去上清液，加入四毫升0.65%盐水溶液。在 4 摄氏度下孵育五分钟以恢复膜完整性并重复离心。除去上清液并将细胞重新悬浮在四毫升1X DPBS中以除去细胞碎片。再次，离心并将细胞沉淀重新悬浮在两毫升冷HBSS缓冲液中。要进行台盼蓝排除试验，请将5微升细胞悬液稀释在20微升0.4%台盼蓝中。在新的鲍尔室中计数细胞，并使用排除测试确定细胞活力。然后，将5微升细胞悬液安装在载玻片上，并用Wright的染色剂染色15秒。立即固定样品，用蒸馏水洗涤，并在光学显微镜下观察形貌。接下来，向第五个细胞中加入1乘以10倍到流式细胞术管中，并在黑暗中用1微升7AAD在100微升FACS缓冲液中染色15分钟。用 500 微升 FACS 缓冲液以 300 G 洗涤 10 分钟。用500微升2%多聚甲醛固定细胞，并储存在4摄氏度直至流式细胞术分析。对于死细胞对照，用200微升4%多聚甲醛固定细胞30分钟，并在4摄氏度下用500微升1XPBS在300G下洗涤10分钟。弃去上清液，加入200微升0.1%Triton X-100。在四摄氏度下孵育一小时。用 500 微升 1X PBS 洗涤，并用 7AAD 染色。在流式细胞仪软件中分析捕获的数据。加载文件并双击未染色的中性粒细胞文件。在 X 轴上选择前向散射或 FSC，在 Y 轴上选择侧向散射或 SSC 以显示与中性粒细胞对应的细胞群。然后在X轴上选择通道B3-A：PerCP vio 700-A以取消细胞的自发荧光的限制，并在Y轴上选择直方图。然后，打开染色的中性粒细胞文件。在 X 轴上选择 FSC，在 Y 轴上选择 SSC 以显示与中性粒细胞对应的细胞群。再次选择通道B3-A：PerCP vio 700-A以限定染料7AAD阳性的中性粒细胞群体。通过右键单击窗口并选择复制到布局编辑器来生成最终直方图。在1.5毫升微管中加入细菌或真菌假菌丝。加入 200 微升，即在 1X PBS 中加入 5 微摩尔 CFSC。混合并在 37 摄氏度下在黑暗中孵育 10 分钟。通过加入500微升去补体血浆和离心机来停止反应。弃去上清液，用一毫升1XPBS离心洗涤沉淀。然后将微生物重新悬浮在250微升1X PBS中。在 1.5 毫升微管中制备 50 微升等分试样，用两倍 10 至第七个细菌或两倍 10 至第五个假菌丝进行 NET 诱导。将 10 x 10 毫米无菌玻璃盖玻片放入 24 孔板中。在室温下用 10 微升 0.001% 聚 l-赖氨酸覆盖一小时，并用 100 微升 1X PBS 洗涤两次。风干并用紫外线照射15分钟。接下来，用补充有10%热去补体自体血浆的RPMI 1640培养基替换先前制备的中性粒细胞悬浮液的HBSS溶液。将350微升该细胞悬液加入24孔板中，使终浓度为每孔第5个中性粒细胞的10倍的两倍。将板在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育20分钟，以使细胞粘附在孔底。为了诱导网形成，在MOI1处添加细菌刺激MOI100和假菌丝。同时加入生化刺激物，并通过加入50微升HBSS来制备没有刺激的对照。获得每孔400微升的最终体积，并在140RPM的摇板器上混合30秒。然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 4 小时。净诱导后，小心移液从孔中除去上清液，并用300微升4%多聚甲醛固定细胞30分钟。用200微升1X PBS洗涤细胞而不离心，并加入200微升封闭缓冲液30分钟。对于LL37染色，用200微升0.2%Triton X-100在1X PBS中透化细胞10分钟，并用1X PBS洗涤两次。将盖玻片安装在载玻片上。DNA用两微升DAPI染色细胞，并储存在零下20摄氏度，直到通过共聚焦荧光显微镜进行分析。双密度梯度纯化后可视化动态细胞相。通过右染色证实典型的中性粒细胞形态。这些细胞还显示出通过台盼蓝排除观察到的最佳活力，而不会破坏膜。通过流式细胞术对SSC与FSC的分析证实了对应于具有高细胞纯度的PMN的群体。未染色细胞与7AAD染色细胞的PMN点图及其各自的直方图表明，与透化对照细胞相比，新鲜分离的中性粒细胞具有高细胞活力。用化学和微生物兴奋剂刺激中性粒细胞后，使用DNA DPI和抗LL37通过荧光显微镜观察NET。微生物用CFSE预染色。PMA诱导的自杀网形成，由与LL37共定位指示。而用HOCI形成的NET在细胞外空间中显示出轻微的DNA分散，对应于重要的NET形成。由真菌假菌导的NET显示出低浓度的DNA释放到细胞外空间，具有重要NET形成的丝状结构特征。金黄色葡萄球菌显示出重要的NET形成，而铜绿假单胞菌诱导释放具有浑浊形态的大浓度DNA，与LL37共同定位，表明自杀NET形成。执行双密度梯度方法使我们能够获得中性粒细胞的高纯度和活力。我们提升洗涤剂，避免损坏它们的结构。按照这种方法，我们可以分析物质或细胞在NET产生中的作用，以及它们是否参与某种机制或用作自身免疫性疾病的治疗方法。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

嗜中性粒细胞胞外的陷阱：如何生成和可视化

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

科研

免疫与感染

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

简化人力中性粒细胞胞外陷阱（英语教师）分离和处理

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

方法来研究中性粒细胞脂质的改变和中性粒细胞胞外陷阱随后形成

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

利用共焦显微镜可视化巨噬细胞胞外陷阱

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

体外犬中性粒细胞胞外陷阱的形成: 荧光显微镜动态定量分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

使用 NETQUANT 对中性粒细胞外陷阱的自动基于图像的定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

使用免疫荧光显微镜鉴定帕芬-嵌入式猫动脉血栓中中性粒细胞外陷阱

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

使用改良的夹心 ELISA 定量来自中性粒细胞胞外陷阱的髓过氧化物酶 DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶 DNA 复合物

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

人和小鼠组织中性粒细胞胞外陷阱的免疫荧光成像

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...