Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et grundvidenskabeligt tilskud (#285480) fra CONACyT og af Institut for Klinisk Immunologisk Forskning ved Det Biokemiske Fakultet, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A., S.A.S.L og W.J.R.R. har ph.d.-stipendier af CONACyT-numre # 799779, # 660793 og # 827788, henholdsvis.

Blodprøverne blev taget som donationer fra klinisk raske deltagere efter informeret samtykke. Alle eksperimenter blev udført med tilladelse fra Human Research Ethics Committee ved Det Biokemiske Fakultet, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' i Oaxaca.
BEMÆRK: Inklusionskriterierne i undersøgelsen var utydelig køn og alder og klinisk sunde ifølge deltagernes svar på et spørgeskema forud for indtagelse af en blodprøve. En hæmatologisk analyse blev udført for at bestemme celletallet ...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Der skal opnås en meget ren population af levedygtige neutrofiler for at fremkalde frigivelse af NET, da disse celler har en begrænset ex vivo-levetid på gennemsnitligt 8 timer, en periode, inden for hvilken alle forsøgene skal udføres. Til dette formål er den ideelle metode dobbeltdensitetsgradienten til optimering af rensningstiden ved at isolere ikke-aktiverede celler, der er mere lydhøre over for eksogen stimulering, i modsætning til Ficoll-Histopaque gradient eller Dextran sedimenteringsteknikker<su...

Neutrofiler er de mest rigelige leukocytter i blodbanen og spiller en væsentlig rolle under clearance af patogene midler ved flere mekanismer, herunder frigivelse af store kromatinstrukturer sammensat af DNA og flere nukleare, cytoplasmatiske og granulære antibakterielle proteiner 1,2. Den direkte forudgående beskrivelse af denne antimikrobielle rolle af neutrofiler blev lavet af Takei et al.3 i 1996. Disse forfattere rapporterede en ny form for død, der adskiller sig fra apoptose og nekrotose hos neutrofiler, viste morfologiske ændringer, der udviser nuklear ruptur, efterfulgt af spild ud af nukleoplasmaet ind i cytoplasmaet og en stigning i membranpermeabilitet fra 3 timers inkubation med phorbolmyristatacetat (PMA)2,3. Det var dog først i 2004, at udtrykket "neutrofile ekstracellulære fælder (NETs)" blev brugt4.
NET-dannelse er blevet observeret under forskellige forhold, såsom bakterielle, svampe5, virale6 og parasitære infektioner til neutralisering, drab og forebyggelse af mikrobiel spredning7. Andre undersøgelser viser, at det også kan forekomme i ikke-patogene tilstande ved sterile stimuli, såsom cytokiner, mononatriumurinsyre eller kolesterolkrystaller, autoantistoffer, immunkomplekser og aktiverede blodplader7. Lipopolysaccharid (LPS), interleukin-8 (IL-8) og PMA var blandt de første in vitro-stimuli beskrevet som NET-inducere, og in vivo NET-involvering i patogene processer blev demonstreret i to modeller for akut inflammation: eksperimentel dysenteri og spontan human blindtarmsbetændelse4. DNA er en vigtig NET-komponent. Dens passende struktur og sammensætning er nødvendig for sekvestrering og drab af mikroorganismer ved at levere en høj lokal koncentration af antimikrobielle molekyler mod de fangede mikrober, som det fremgår af en kort deoxyribonuklease (DNase) behandling, der opløser NET'er og deres mikrobicidegenskaber4. Udover DNA omfatter NET'er vedhæftede proteiner såsom histoner, neutrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3, lactoferrin, gelatinase, myeloperoxidase (MPO) og antimikrobielle peptider (AMP'er) såsom det kationiske proinflammatoriske peptid cathelicidin LL-37 blandt andre 8,9. Sådanne aggregater kan danne større tråde med diametre op til 50 nm. Disse faktorer kan forstyrre de mikrobielle virulensfaktorer eller integriteten af patogencellemembranen; Derudover kan AMP'erne stabilisere det NET-afledte DNA mod nedbrydning af bakterienukleaser10.
De specifikke mekanismer, der regulerer NET-dannelse, er endnu ikke helt afklaret. Den bedst karakteriserede vej, der fører til NET-frigivelse, er gennem ERK-signalering, hvilket fører til NADPH-oxidaseaktivering og produktion af reaktive iltarter (ROS) samt øget intracellulært calcium, der udløser aktivering af MPO-vejen. Dette omdanner igen hydrogenperoxid til hypochlorsyre, der aktiverer NE ved oxidation11,12. NE er ansvarlig for at nedbryde cytoskelettets actinfilamenter for at blokere fagocytose og translokere dem til kernen til behandling ved proteolytisk spaltning og deaminering ved PAD4, der driver desensibilisering af kromatinfibre, der associeres med granulat og cytoplasmatiske proteiner, og frigives derefter ekstracellulært7. Disse proteaser omfatter dem, der frigives fra azurosomkomplekset af azurofilgranulerne og andre proteaser såsom cathepsin G13.
Afhængigt af de morfologiske ændringer i neutrofiler klassificeres NET'er i to typer: selvmords- eller lytisk NET-dannelse, der fører til celledød4, og vital eller ikke-lytisk NET-dannelse produceret af levedygtige celler medieret af en vesikulær frigivelse af nukleært eller mitokondrie-DNA med en rest af en anukleeret cytoplast med fagocytisk kapacitet14,15. Generelt præsenterer NET'er sammensat af mitokondrie-DNA en langstrakt fiber14-morfologi, mens de, der er struktureret af nukleært DNA, har et skylignende udseende3. Det vides imidlertid ikke, hvordan neutrofilen vælger sin DNA-oprindelse. I modsætning til tidligere undersøgelser, der beskrev NETs kanoniske veje som kræver flere timer, aktiveres den vitale vej hurtigt på kun 5-60 min15.
På trods af disse fremskridt varierer NET-sammensætningen afhængigt af stimulus; for eksempel inducerer forskellige mucoide og ikke-mucoide stammer af P. aeruginosa dannelsen af NET'er indeholdende 33 almindelige proteiner og op til 50 variable proteiner7. Det er således nødvendigt at homogenisere teknikker, der muliggør generering af objektive konklusioner i forskergrupper. Dette papir beskriver en protokol med forskellige teknikker, der muliggør sammenligning og evaluering af sammensætningen, strukturen og morfologien af NET'er induceret med forskellige mikroorganismer: Staphylococcus aureus (gram-positiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativ bakterie) og Candida albicans (svamp) samt kemiske stimuli (PMA, HOCl) hos humane neutrofiler fra raske individer. De repræsentative resultater viser heterogeniteten af NET'er afhængigt af deres inducerende stimulus under sammenlignelige in vitro-forhold, karakteriseret ved DNA-DAPI-farvning, immunostaining for LL37 og kvantificering af enzymatisk aktivitet (NE, CG og MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Neutrofiler fungerer som den første linje af cellulært forsvar i et medfødt immunrespons ved at anvende forskellige mekanismer, såsom dannelsen af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Denne undersøgelse analyserer de morfologiske og sammensætningsmæssige ændringer i NET'er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli ved hjælp af standardiserede in vitro-metoder til NET-induktion og karakterisering med humane celler. De her beskrevne procedurer tillader analyse af NET-morfologi (lytisk eller ikke-lytisk) og sammensætning (DNA-proteinstrukturer og enzymatisk aktivitet) og virkningen af opløselige faktorer eller cellulær kontakt på sådanne egenskaber. Derudover kan de teknikker, der er beskrevet her, ændres for at evaluere effekten af eksogene opløselige faktorer eller cellulær kontakt på NET-sammensætningen.
De anvendte teknikker inkluderer oprensning af polymorfonukleære celler fra humant perifert blod ved hjælp af en dobbeltdensitetsgradient (1,079-1,098 g / ml), hvilket garanterer optimal renhed og levedygtighed (≥ 95%) som demonstreret ved Wrights farvning, trypanblå udelukkelse og flowcytometri, herunder FSC versus SSC-analyse og 7AAD-farvning. NET-dannelse induceres med mikrobielle (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans) og kemiske (phorbol myristate acetat, HOCl) stimuli, og NET'erne er karakteriseret ved DNA-DAPI-farvning, immunostaining for det antimikrobielle peptid cathelicidin (LL37) og kvantificering af enzymatisk aktivitet (neutrofil elastase, cathepsin G og myeloperoxidase). Billederne erhverves gennem fluorescensmikroskopi og analyseres med ImageJ.

Renhed og levedygtighed af neutrofiler De dynamiske cellulære faser visualiseres i røret fra dobbeltdensitetsgradientrensningen. Inden for disse lag er laget svarende til granulocytter over densitetslaget på 1,079 g / ml, adskilt fra faserne af perifere blodmononukleocytter (PBMC'er) og erytrocytter (figur 1A). Morfologien af de oprensede celler blev verificeret med Wrights farvning ved at observere celler med segmenterede kerner forbundet med trådlignende filamenter ...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Her præsenteres en protokol til induktion og analyse af in vitro neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Kvantificering af DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet gav data, der viser variabiliteten i sammensætningen og morfologien af NET'er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli under lignende kontrollerede forhold.

Morfologisk og sammensætningsanalyse af neutrofile ekstracellulære fælder induceret af mikrobielle og kemiske stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Denne protokol demonstrerer heterogeniteten i sammensætning, struktur og morfologi af neutrofile ekstracellulære fælder, afhængigt af deres inducerende stimulus under sammenlignelige in vitro-betingelser i humane neutrofiler fra raske individer. Høj neutrofil renhed og levedygtighed opnås. Det gør det muligt at sammenligne koncentrationen af DNA, LL-37 og enzymaktivitet af myeloperoxidase, elastase og katepsin G, frigivet af neutrofile ekstracellulære fælder.Denne protokol tillod at analysere effekten af opløselige faktorer eller cellulær kontakt eller mulige terapier eller mekanismer til lukning af produktionen af NET'er i autoimmun sygdom. Disse metoder kan hjælpe med undersøgelsen af autoimmun sygdom. På grund af den ukontrollerede cellegengivelse af NET'er og varigheden af justeringen af deres komponenter, der betragtes som biomarkører for sygdommen.Fluorescensmikroskopi gør det muligt at fange billede af NET'er, der viser spredning af DNA i forbindelse med protein som LL37, som co-lokaliseret med mikroorganismer, der hjælper med at forstå, hvordan de ser ud. Til at begynde med skal du udføre vena punktering for at samle 10 ml perifert blod i rør indeholdende dikalium EDTA som antikoagulant. Udfør derefter standard blodbiometri og C-reaktiv proteintest for at udelukke infektion eller betændelse for at sikre prøvens kvalitet.Centrifuger den perifere blodprøve for at fjerne det blodpladerige plasma, efterfulgt af en anden centrifugering og kassér det resterende plasma. Fortynd den resulterende erytrocyt- og leukocytpakke i en-til-en-volumenforhold med en 1X DPBS. Derefter deponeres først en milliliter 1,08 gram pr. milliliter densitetsopløsning i et sterilt 10 ml glasrør en milliliter 1,079 gram pr. milliliter densitetsopløsning.Derefter tilsættes fire ml af den fortyndede erytrocyt- og leukocytpakke ved at hælde over væggene. Der centrifugeres uden acceleration eller deceleration for at undgå forstyrrelse af gradienten. Opsug fasen svarende til granulocytter og overfør til et andet sterilt 10 ml glasrør.Der vaskes med fire ml 1X DPBS ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og supernatanten kasseres. For at fjerne de resterende erytrocytter skal du behandle cellerne med osmotisk shock ved at tilsætte fire ml 0,2% saltopløsning. Inkuber i to minutter ved fire grader Celsius og centrifuger.Supernatanten kasseres, og der tilsættes fire ml 0,65% saltopløsning. Inkuber i fem minutter ved fire grader Celsius for at genoprette membranintegriteten og gentag centrifugeringen. Supernatanten fjernes og cellerne opslæmmes igen i fire ml 1X DPBS for at fjerne celleaffald.Centrifuger igen og ophvirvl cellepelleten igen i to ml kold HBSS-buffer. For at udføre en trypanblå udelukkelsestest fortyndes fem mikroliter cellesuspension i 20 mikroliter 0,4% trypanblåt. Tæl cellerne i et nyt buekammer og bestem cellelevedygtighed ved hjælp af en udelukkelsestest.Monter derefter 5 mikroliter af celleophænget på et dias og pletter med Wrights plet i 15 sekunder. Fastgør straks prøven, vask med destilleret vand og observer morfologien under et optisk mikroskop. Derefter tilsættes en gange 10 til de femte celler for at strømme cytometrirør og pletter med en mikroliter 7AAD i 100 mikroliter FACS-buffer i 15 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Vask med 500 mikroliter FACS-buffer ved 300 G i 10 minutter. Fastgør cellerne med 500 mikroliter 2% paraformaldehyd og opbevar ved fire grader Celsius indtil flowcytometrianalyse. For en død cellekontrol fastgøres cellerne med 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minutter og vaskes med 500 mikroliter 1XPBS ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Supernatanten kasseres, og der tilsættes 200 mikroliter 0,1 % Triton X-100. Inkuber i en time ved fire grader Celsius. Vask med 500 mikroliter 1X PBS og plet med 7AAD.Analyser de indfangede data i flowcytometersoftwaren. Indlæs filerne, og dobbeltklik på den ubejdsede neutrofilfilfil. Vælg fremadrettet spredning eller FSC på X-aksen og sidespredning eller SSC på Y-aksen for at få vist cellepopulationen svarende til neutrofiler.Vælg derefter kanalen B3-A:PerCP vio 700-A på X-aksen for at afgrænse cellernes autofluorescens og vælge histogram på Y-aksen. Åbn derefter filen Stained Neutrophil. Vælg FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen for at få vist den cellepopulation, der svarer til neutrofiler.Vælg igen kanalen B3-A:PerCP vio 700-A for at afgrænse populationen af neutrofiler, der er positive for farvestoffet 7AAD. Generer det endelige histogram ved at højreklikke på vinduet og vælge kopier til layouteditor. Tilsæt bakterielle eller svampepseudohyfer i 1,5 ml mikrorør.Tilsæt 200 mikroliter, så fem mikromolær CFSC i 1X PBS. Bland og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter i mørket. Stop reaktionen ved at tilsætte 500 mikroliter dekomplementeret plasma og centrifuge.Supernatanten kasseres, og pelletsen vaskes med en milliliter 1XPBS med centrifugering. Derefter suspenderes mikroorganismerne igen i 250 mikroliter 1X PBS. Forbered 50 mikroliter alikvoter i 1,5 ml mikrorør med to gange 10 til den syvende bakterie eller to gange 10 til den femte pseudohyfer til NET-induktion.Placer 10 x 10 millimeter sterilt glasdæksel glider i en 24-brøndplade. Dæk med 10 mikroliter 0,001% poly l-lysin i en time ved stuetemperatur og vask to gange med 100 mikroliter 1X PBS. Lufttør og bestråle med UV-lys i 15 minutter.Udskift derefter HBSS-opløsningen af den tidligere fremstillede neutrofile suspension med RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmedekomplementeret autologt plasma. Tilsæt 350 mikroliter af denne cellesuspension til 24-brøndpladen for en endelig koncentration på to gange 10 til den femte neutrofiler pr. Brønd. Pladen inkuberes i 20 minutter ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid for at tillade cellerne at klæbe til bunden af brøndene.For at fremkalde nettodannelse tilsættes bakteriestimuli MOI100 og pseudohyfer ved MOI1. Tilsæt også de biokemiske stimuli og forbered en kontrol uden stimulus ved at tilsætte 50 mikroliter HBSS. Få et slutvolumen på 400 mikroliter pr. Brønd og bland på en pladeryster ved 140 RPM i 30 sekunder.Derefter inkuberes i fire timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter netinduktion fjernes supernatanten fra hullerne ved omhyggelig pipettering, og cellerne fikseres med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Vask cellerne med 200 mikroliter 1X PBS uden centrifugering og tilsæt 200 mikroliter blokerende buffer i 30 minutter.For LL37-plet permeabiliseres cellerne med 200 mikroliter 0,2% Triton X-100 i 1X PBS i 10 minutter og vaskes med 1X PBS to gange. Monter dækslet glider på glasskinner. DNA pletter cellerne med to mikroliter DAPI og opbevares ved minus 20 grader Celsius indtil analyse ved konfokal fluorescensmikroskopi.De dynamiske cellulære faser blev visualiseret efter rensning af dobbeltdensitetsgradient. Den typiske neutrofile morfologi blev bekræftet ved højre farvning. Cellerne viste også optimal levedygtighed observeret ved trypanblå udelukkelse uden membranforstyrrelser.Analyse af SSC versus FSC ved flowcytometri bekræftede en population svarende til PMN med høj cellerenhed. PMN-punktplots for ufarvede celler versus 7AAD-pletceller og deres respektive histogrammer indikerede en høj cellelevedygtighed i de nyligt isolerede neutrofiler sammenlignet med de permeabiliserede kontrolceller. Efter stimulering af neutrofilerne med kemiske og mikrobielle stimulanser blev NET'er visualiseret ved fluorescensmikroskopi ved hjælp af DNA DPI og anti-LL37.Mikroorganismerne var forfarvet med CFSE. PMA-induceret selvmordsnetdannelse indikeret ved co-lokalisering med LL37. Mens NET'er dannet med HOCI viste mindre DNA-spredning i det ekstracellulære rum, der svarede til vital NET-dannelse.NET induceret af svampepseudohyfer viste lave koncentrationer af DNA frigivet i det ekstracellulære rum med filamentøse strukturer, der er karakteristiske for den vitale NET-dannelse. S.aureus viste vital NET-dannelse, mens P.aeruginosa inducerede frigivelse af store koncentrationer af DNA med en uklar morfologi, der var lokaliseret sammen med LL37, hvilket indikerer selvmords-NET-dannelse. Udførelse af dobbeltdensitetsgradientmetode giver os mulighed for at opnå en høj renhed og levedygtighed af neutrofiler.Og vi hæver vaskerne, vi undgår at beskadige strukturen af dem. Efter denne metode kan vi analysere effekten af stoffer eller celler i NET-produktion, samt om de er involveret i en eller anden mekanisme eller deres anvendelse som terapier i autoimmun sygdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklet human neutrofil Ekstracellulære Fælder (NET) Isolering og Håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder til at studere Lipidforandringer i neutrofiler og den efterfølgende dannelse af neutrofile ekstracellulær fælder

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere makrofag ekstracellulære fælder ved hjælp af konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofile ekstracellulære fælde dannelse: Dynamisk og kvantitativ analyse af Fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiseret billedbaseret kvantificering af neutrofile ekstracellulære fælder med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifikation af neutrofile ekstracellulære fælder i paraffin-embedded feline arteriel trombose ved hjælp af Immunofluorescence Mikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kvantificering af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser fra neutrofile ekstracellulære fælder ved hjælp af en modificeret sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Farvning og billeddannelse til visualisering af neutrofile ekstracellulære fælder

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Forfatter Spotlight: Neutrofile ekstracellulære fælder billeddannelse i menneske- og musevæv 

Immunofluorescensbilleddannelse af neutrofile ekstracellulære fælder i væv fra mennesker og mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...