Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een basisbeurs voor wetenschap (# 285480) van CONACyT en door de afdeling Klinisch Immunologieonderzoek van de faculteit Biochemische Wetenschappen, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L. en W.J.R.R. hebben doctoraatsbeurzen van respectievelijk CONACyT-nummers #799779, #660793 en #827788.

De bloedmonsters werden verkregen als donaties van klinisch gezonde deelnemers na geïnformeerde toestemming. Alle experimenten werden uitgevoerd met toestemming van de Human Research Ethics Committee van de Faculteit biochemische Wetenschappen, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' van Oaxaca.
OPMERKING: De inclusiecriteria in de studie waren onduidelijk geslacht en leeftijd, en klinisch gezond volgens de antwoorden van de deelnemers op een vragenlijst voorafgaand aan het nemen van een bloed...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Een zeer zuivere populatie van levensvatbare neutrofielen moet worden verkregen om de afgifte van NET's te induceren, aangezien deze cellen een beperkte ex vivo levensduur hebben van gemiddeld 8 uur, een periode waarbinnen alle experimenten moeten worden uitgevoerd. Hiertoe is de ideale methodologie de gradiënt met dubbele dichtheid om de zuiveringstijd te optimaliseren door niet-geactiveerde cellen te isoleren die beter reageren op exogene stimulatie, in tegenstelling tot Ficoll-Histopaque gradiënt of Dextran...

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de bloedbaan en spelen een essentiële rol tijdens de klaring van pathogene agentia door verschillende mechanismen, waaronder de afgifte van grote chromatinestructuren bestaande uit DNA en verschillende nucleaire, cytoplasmatische en granulaire antibacteriële eiwitten 1,2. Het directe antecedent dat deze antimicrobiële rol van neutrofielen beschrijft, werd gemaakt door Takei et al.3 in 1996. Deze auteurs rapporteerden een nieuwe vorm van overlijden die verschilt van apoptose en necroptose bij neutrofielen, vertoonden morfologische veranderingen die nucleaire breuk vertoonden, gevolgd door het morsen van het nucleoplasma in het cytoplasma en een toename van de membraanpermeabiliteit vanaf 3 uur incubatie met phorbol myristate acetaat (PMA)2,3. Het was echter pas in 2004 dat de term "neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)" werd gebruikt4.
NET-vorming is waargenomen in verschillende omstandigheden, zoals bacteriële, schimmel5, virale6 en parasitaire infecties, voor het neutraliseren, doden en voorkomen van microbiële verspreiding7. Andere studies tonen aan dat het ook kan voorkomen in niet-pathogene omstandigheden door steriele stimuli, zoals cytokines, mononatriumurinezuur of cholesterolkristallen, auto-antilichamen, immuuncomplexen en geactiveerde bloedplaatjes7. Lipopolysaccharide (LPS), interleukine-8 (IL-8) en PMA behoorden tot de eerste in vitro stimuli beschreven als NET-inductoren, en de in vivo NET-betrokkenheid bij pathogene processen werd aangetoond in twee modellen van acute ontsteking: experimentele dysenterie en spontane menselijke appendicitis4. DNA is een essentieel NET-onderdeel. De juiste structuur en samenstelling zijn noodzakelijk voor het vastleggen en doden van micro-organismen door een hoge lokale concentratie van antimicrobiële moleculen aan de gevangen microben te leveren, zoals aangetoond door een korte deoxyribonuclease (DNase) behandeling die NET's en hun microbicide eigenschappen desintegreert4. Naast DNA bestaan NET's uit aangehechte eiwitten zoals histonen, neutrofiel elastase (NE), cathepsine G (CG), proteïnase 3, lactoferrine, gelatinase, myeloperoxidase (MPO) en antimicrobiële peptiden (AMPs) zoals het kationische pro-inflammatoire peptide cathelicidin LL-37 onder andere 8,9. Dergelijke aggregaten kunnen grotere draden vormen met diameters tot 50 nm. Deze factoren kunnen de microbiële virulentiefactoren of de integriteit van het pathogene celmembraan verstoren; bovendien kunnen de AMPs het NET-afgeleide DNA stabiliseren tegen afbraak door bacteriële nucleasen10.
De specifieke mechanismen die de netvorming reguleren, zijn nog niet volledig opgehelderd. De best gekarakteriseerde route die leidt tot NET-afgifte is via ERK-signalering, wat leidt tot NADPH-oxidaseactivering en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), evenals verhoogd intracellulair calcium dat activering van de MPO-route veroorzaakt. Dit zet waterstofperoxide op zijn beurt om in hypochloorzuur, waardoor NE wordt geactiveerd door oxidatie11,12. NE is verantwoordelijk voor het afbreken van de actinefilamenten van het cytoskelet om fagocytose te blokkeren en ze naar de kern te transloceren voor verwerking door proteolytische splitsing en deaminering door PAD4 die de desensibilisatie van chromatinevezels aansturen, die associëren met korrel- en cytoplasmatische eiwitten, en vervolgens extracellulair worden vrijgegeven7. Deze proteasen omvatten die welke vrijkomen uit het azurosoomcomplex van de azurofielkorrels en andere proteasen zoals cathepsine G13.
Afhankelijk van de morfologische veranderingen in neutrofielen, worden NET's ingedeeld in twee typen: suïcidale of lytische NET-vorming die leidt tot celdood4, en vitale of niet-lytische NET-formatie geproduceerd door levensvatbare cellen gemedieerd door een vesiculaire afgifte van nucleair of mitochondriaal DNA, met een overblijfsel van een geanucleeerde cytoplast met fagocytisch vermogen14,15. Over het algemeen vertonen NET's die zijn samengesteld uit mitochondriaal DNA een langwerpige vezel14 morfologie, terwijl die gestructureerd van nucleair DNA een wolkachtig uiterlijk hebben3. Het is echter niet bekend hoe de neutrofiel zijn DNA-oorsprong kiest. In tegenstelling tot eerdere studies die de canonieke paden van NET's beschreven als enkele uren nodig, wordt de vitale route snel geactiveerd in slechts 5-60 minuten15.
Ondanks deze vooruitgang varieert de NET-samenstelling afhankelijk van de stimulus; verschillende mucoid en niet-mucoid stammen van P. aeruginosa induceren bijvoorbeeld de vorming van NET's met 33 gemeenschappelijke eiwitten en maximaal 50 variabele eiwitten7. Het is dus noodzakelijk om technieken te homogeniseren die het genereren van objectieve conclusies in onderzoeksgroepen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft een protocol met verschillende technieken die vergelijking en evaluatie van de samenstelling, structuur en morfologie van NET's geïnduceerd met verschillende micro-organismen mogelijk maken: Staphylococcus aureus (grampositieve bacterie), Pseudomonas aeruginosa (gramnegatieve bacterie) en Candida albicans (schimmel), evenals chemische stimuli (PMA, HOCl) bij menselijke neutrofielen van gezonde individuen. De representatieve resultaten tonen de heterogeniteit van NET's aan, afhankelijk van hun inducerende stimulus onder vergelijkbare in vitro omstandigheden, gekenmerkt door DNA-DAPI-kleuring, immunostaining voor LL37 en kwantificering van enzymatische activiteit (NE, CG en MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Neutrofielen functioneren als de eerste lijn van cellulaire verdediging in een aangeboren immuunrespons door gebruik te maken van verschillende mechanismen, zoals de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Deze studie analyseert de morfologische en compositorische veranderingen in NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli met behulp van gestandaardiseerde in vitro methodologieën voor NET-inductie en karakterisering met menselijke cellen. De hier beschreven procedures maken de analyse van NET-morfologie (lytisch of niet-lytisch) en samenstelling (DNA-eiwitstructuren en enzymatische activiteit) en het effect van oplosbare factoren of cellulair contact op dergelijke kenmerken mogelijk. Bovendien kunnen de hier beschreven technieken worden gewijzigd om het effect van exogene oplosbare factoren of cellulair contact op de NET-samenstelling te evalueren.
De toegepaste technieken omvatten de zuivering van polymorfonucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed met behulp van een gradiënt met dubbele dichtheid (1,079-1,098 g / ml), waardoor optimale zuiverheid en levensvatbaarheid (≥ 95%) worden gegarandeerd, zoals aangetoond door Wright's kleuring, trypan blue uitsluiting en flowcytometrie, inclusief FSC versus SSC-analyse en 7AAD-kleuring. NET-vorming wordt geïnduceerd met microbiële (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Candida albicans) en chemische (phorbol myristate acetaat, HOCl) stimuli, en de NET's worden gekenmerkt door DNA-DAPI-kleuring, immunostaining voor het antimicrobiële peptide cathelicidin (LL37) en kwantificering van enzymatische activiteit (neutrofiel elastase, cathepsine G en myeloperoxidase). De beelden worden verkregen door fluorescentiemicroscopie en geanalyseerd met ImageJ.

Zuiverheid en levensvatbaarheid van neutrofielen De dynamische cellulaire fasen worden in de buis gevisualiseerd vanuit de gradiëntzuivering met dubbele dichtheid. Binnen deze lagen bevindt de laag die overeenkomt met granulocyten zich boven de dichtheidslaag van 1,079 g/ml, onderscheiden van de fasen van perifere bloedmononucleocyten (PBMC's) en erytrocyten (figuur 1A). De morfologie van de gezuiverde cellen werd geverifieerd met de kleuring van Wright door cellen te ob...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Dit protocol toont de heterogeniteit in samenstelling, structuur en morfologie van neutrofiele extracellulaire vallen, afhankelijk van hun inducerende stimulus onder vergelijkbare in vitro omstandigheden bij menselijke neutrofielen van gezonde individuen. Hoge neutrofiele zuiverheid en levensvatbaarheid worden verkregen. Dat maakt het mogelijk om de concentratie dna, LL-37 en enzymactiviteit van myeloperoxidase, elastase en cathepsine G, vrijgegeven door neutrofiele extracellulaire vallen, te vergelijken.Dit protocol maakte het mogelijk om het effect van oplosbare factoren of cellulair contact of mogelijke therapieën of mechanismen voor het sluiten van de productie van NET's bij auto-immuunziekten te analyseren. Deze methoden kunnen helpen bij het onderzoek naar auto-immuunziekten. Vanwege de ongecontroleerde celreproductie van NET's en de duur van de aligneren van hun componenten, die worden beschouwd als biomarkers van de ziekte.Fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om een beeld te maken van NET's die de dispersie van DNA laten zien in associatie met eiwitten zoals LL37, die samen met micro-organismen zijn gelokaliseerd en helpen begrijpen hoe ze verschijnen. Voer om te beginnen vena-punctie uit om 10 milliliter perifeer bloed te verzamelen in buizen die dipotassium EDTA als antistollingsmiddel bevatten. Voer vervolgens standaard bloedbiometrie en C-reactieve proteïnetest uit om infectie of ontsteking uit te sluiten om de kwaliteit van het monster te waarborgen.Centrifugeer het perifere bloedmonster om het bloedplaatjesrijke plasma te verwijderen, gevolgd door een tweede centrifugatie en gooi het resterende plasma weg. Verdun het resulterende erytrocyten- en leukocytenpakket in één-op-één volumeverhouding met één 1X DPBS. Vervolgens, in een steriele glazen buis van 10 milliliter, eerst één milliliter van 1,08 gram per milliliter dichtheidsoplossing afgezet, gevolgd door één milliliter van 1,079 gram per milliliter dichtheidsoplossing.Voeg vervolgens vier milliliter van het verdunde erytrocyten- en leukocytenpakket toe door over de wanden te gieten. Centrifugeer zonder versnelling of vertraging om te voorkomen dat de helling wordt verstoord. Aspirateer de fase die overeenkomt met granulocyten en breng over naar een andere steriele glazen buis van 10 milliliter.Was met vier milliliter 1X DPBS op 300 G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Om de resterende erytrocyten te verwijderen, behandelt u de cellen met osmotische shock door vier milliliter 0,2% zoutoplossing toe te voegen. Incubeer gedurende twee minuten bij vier graden Celsius en centrifugeer.Gooi het supernatant weg en voeg vier milliliter 0,65% zoutoplossing toe. Incubeer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de membraanintegriteit te herstellen en de centrifugatie te herhalen. Verwijder het supernatant en suspensieer de cellen opnieuw in vier milliliter 1X DPBS om cellulair afval te verwijderen.Nogmaals, centrifugeer en suspensie de celpellet opnieuw in twee milliliter koude HBSS-buffer. Om een trypan blue exclusietest uit te voeren, verdunt u vijf microliter van de celsuspensie in 20 microliter van 0,4% trypan blue. Tel de cellen in een nieuwe bowerkamer en bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een uitsluitingstest.Monteer vervolgens 5 microliter van de celophanging op een dia en bevlek gedurende 15 seconden met de vlek van Wright. Bevestig het monster onmiddellijk, was met gedestilleerd water en observeer de morfologie onder een optische microscoop. Voeg vervolgens een keer 10 toe aan de vijfde cellen aan flowcytometriebuizen en kleur met één microliter 7AAD in 100 microliter FACS-buffer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in het donker.Was met 500 microliter FACS-buffer op 300 G gedurende 10 minuten. Fixeer de cellen met 500 microliter 2% paraformaldehyde en bewaar bij vier graden Celsius tot flowcytometrie-analyse. Voor een dode celcontrole fixeert u de cellen gedurende 30 minuten met 200 microliter 4% paraformaldehyde en wast u met 500 microliter 1XPBS op 300 G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius.Gooi het supernatant weg en voeg 200 microliter van 0,1% Triton X-100 toe. Incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius. Wassen met 500 microliter 1X PBS en beitsen met 7AAD.Analyseer de vastgelegde gegevens in de flowcytometersoftware. Laad de bestanden en dubbelklik op het niet-gekleurde neutrofiele bestand. Kies forward scatter of FSC op de X-as en side scatter of SSC op de Y-as om de celpopulatie weer te geven die overeenkomt met neutrofielen.Selecteer vervolgens het kanaal B3-A:PerCP vio 700-A op de X-as om de autofluorescentie van de cellen te de-limiteren en kies histogram op de Y-as. Open vervolgens het gebeitste neutrofielenbestand. Kies FSC op de X-as en SSC op de Y-as om de celpopulatie weer te geven die overeenkomt met neutrofielen.Selecteer nogmaals het kanaal B3-A: PerCP vio 700-A om de populatie neutrofielen af te bakenen die positief zijn voor de kleurstof 7AAD. Genereer het uiteindelijke histogram door met de rechtermuisknop op het venster te klikken en copy to layout editor te selecteren. Voeg bacteriële of schimmel pseudohyphae toe in microbuisjes van 1,5 milliliter.Voeg 200 microliter toe, dus vijf micromolaire CFSC in 1X PBS. Meng en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten in het donker. Stop de reactie door 500 microliter gedecomplementeerd plasma en centrifuge toe te voegen.Gooi het supernatant weg en was de pellet met één milliliter 1XPBS met centrifugatie. Vervolgens suspensie de micro-organismen opnieuw in 250 microliter 1X PBS. Bereid 50 microliter aliquots in 1,5 milliliter microbuisjes met twee keer 10 tot de zevende bacterie of twee keer 10 tot de vijfde pseudohyphae voor NET-inductie.Plaats 10 bij 10 millimeter steriele glazen afdekkingsslips in een 24-wells plaat. Dek af met 10 microliter 0,001% poly l-lysine gedurende één uur bij kamertemperatuur en was tweemaal met 100 microliter 1X PBS. Droog aan de lucht en bestraal met UV-licht gedurende 15 minuten.Vervang vervolgens hbss-oplossing van de neutrofielenususpensie die eerder is bereid met RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte gedecomplementeerd autoloog plasma. Voeg 350 microliter van deze celsuspensie toe aan de 24-wellsplaat voor een uiteindelijke concentratie van twee keer 10 tot de vijfde neutrofielen per put. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide om de cellen aan de bodem van de putten te laten hechten.Om nettovorming te induceren, voegt u de bacterieprikkels MOI100 en pseudohyphae toe aan MOI1. Voeg ook de biochemische stimuli toe en bereid een controle voor zonder een stimulus door 50 microliter HBSS toe te voegen. Verkrijg een eindvolume van 400 microliter per put en meng op een platenschudder bij 140 RPM gedurende 30 seconden.Incubeer vervolgens vier uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verwijder na de netto-inductie het supernatant uit de putten door voorzichtig te pipetteren en fixeer de cellen gedurende 30 minuten met 300 microliter 4% paraformaldehyde. Was de cellen met 200 microliter 1X PBS zonder centrifugeren en voeg gedurende 30 minuten 200 microliter blokkeerbuffer toe.Voor LL37-kleuring, permeabilize de cellen met 200 microliter van 0,2% Triton X-100 in 1X PBS gedurende 10 minuten en was tweemaal met 1X PBS. Monteer de afdekselglijders op glazen glijbanen. DNA kleurt de cellen met twee microliter DAPI en slaat op bij min 20 graden Celsius tot analyse door confocale fluorescentiemicroscopie.De dynamische cellulaire fasen werden gevisualiseerd na een gradiëntzuivering met dubbele dichtheid. De typische neutrofiele morfologie werd bevestigd door rechterkleuring. De cellen vertoonden ook optimale levensvatbaarheid waargenomen door trypan blue uitsluiting zonder membraanverstoring.Analyse van SSC versus FSC door flowcytometrie bevestigde een populatie die overeenkomt met PMN met een hoge celzuiverheid. PMN dot plots voor niet-gekleurde cellen versus 7AAD-kleurcellen en hun respectieve histogrammen wezen op een hoge levensvatbaarheid van cellen in de vers geïsoleerde neutrofielen in vergelijking met de permeabiliseerde controlecellen. Na het stimuleren van de neutrofielen met chemische en microbiële stimulerende middelen, werden NET's gevisualiseerd door fluorescentiemicroscopie met behulp van DNA DPI en anti-LL37.De micro-organismen waren vooraf gekleurd met CVSE. PMA-geïnduceerde suïcidale nettovorming aangegeven door co-lokalisatie met LL37. Terwijl NET's gevormd met HOCI een kleine DNA-dispersie in de extracellulaire ruimte vertoonden die overeenkwam met vitale NET-vorming.NET geïnduceerd door schimmel pseudohyphae toonde lage concentraties DNA vrijgegeven in de extracellulaire ruimte met filamenteuze structuren die kenmerkend zijn voor de vitale NET-vorming. S.aureus vertoonde vitale NET-vorming, terwijl P.aeruginosa de afgifte van grote concentraties DNA veroorzaakte met een troebele morfologie die samen met LL37 wees op zelfmoord NET-vorming. Het uitvoeren van een gradiëntmethodologie met dubbele dichtheid stelt ons in staat om een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van neutrofielen te verkrijgen.En we verhogen de wassingen, we voorkomen dat de structuur ervan wordt beschadigd. Volgens deze methode kunnen we het effect van stoffen of cellen in NET-productie analyseren en of ze betrokken zijn bij een mechanisme of hun gebruik als therapieën bij auto-immuunziekten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...