Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
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Ce travail a été soutenu par une subvention de science fondamentale (#285480) de CONACyT et par le Département de recherche en immunologie clinique de la Faculté des sciences biochimiques de l’Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L et W.J.R.R. ont des bourses doctorales de CONACyT numéros #799779, #660793 et #827788, respectivement.

Les échantillons de sang ont été prélevés sous forme de dons de participants cliniquement sains après consentement éclairé. Toutes les expériences ont été réalisées avec l’autorisation du Comité d’éthique de la recherche humaine de la Faculté des sciences biochimiques de l’Université autonome Benito Juárez d’Oaxaca.
REMARQUE : Les critères d’inclusion dans l’étude étaient le sexe et l’âge indistincts, et cliniquement sains selon les réponses des participant...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. 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D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Une population très pure de neutrophiles viables doit être obtenue pour induire la libération de TNE, car ces cellules ont une durée de vie ex vivo limitée de 8 h en moyenne, période au cours de laquelle toutes les expériences doivent être effectuées. Pour cela, la méthodologie idéale est le gradient de double densité pour optimiser le temps de purification en isolant les cellules non activées plus sensibles à la stimulation exogène, contrairement au gradient de Ficoll-Histopaque ou aux techniques...

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans la circulation sanguine, jouant un rôle essentiel lors de la clairance des agents pathogènes par plusieurs mécanismes, dont la libération de grandes structures chromatiniques composées d’ADN et de plusieurs protéines antibactériennes nucléaires, cytoplasmiques et granulaires 1,2. L’antécédent direct décrivant ce rôle antimicrobien des neutrophiles a été fait par Takei et al.3 en 1996. Ces auteurs ont rapporté une nouvelle forme de mort différente de l’apoptose et de la nécroptose chez les neutrophiles, ont montré des changements morphologiques présentant une rupture nucléaire, suivie d’un débordement du nucléoplasme dans le cytoplasme, et une augmentation de la perméabilité de la membrane à partir de 3 h d’incubation avec l’acétate de myristate de phorbol (PMA)2,3. Cependant, ce n’est qu’en 2004 que le terme « pièges extracellulaires (TNE) » a été utilisé4.
La formation de TNE a été observée dans diverses conditions, telles que les infections bactériennes, fongiques5, virales6 et parasitaires, pour neutraliser, tuer et prévenir la dissémination microbienne7. D’autres études montrent qu’il peut également se produire dans des conditions non pathogènes par des stimuli stériles, tels que des cytokines, des cristaux d’acide urique monosodique ou de cholestérol, des auto-anticorps, des complexes immunitaires et des plaquettes activées7. Le lipopolysaccharide (LPS), l’interleukine-8 (IL-8) et la PMA ont été parmi les premiers stimuli in vitro décrits comme des inducteurs NET, et l’implication in vivo des TNE dans les processus pathogènes a été démontrée dans deux modèles d’inflammation aiguë : la dysenterie expérimentale et l’appendicite humaine spontanée4. L’ADN est une composante essentielle de la TNE. Sa structure et sa composition appropriées sont nécessaires à la séquestration et à la destruction des micro-organismes en délivrant une forte concentration locale de molécules antimicrobiennes vers les microbes capturés, comme le démontre un bref traitement par désoxyribonucléase (DNase) qui désintègre les TNE et leurs propriétés microbicides4. Outre l’ADN, les TNE comprennent des protéines attachées telles que les histones, l’élastase neutrophile (NE), la cathepsine G (CG), la protéinase 3, la lactoferrine, la gélatinase, la myéloperoxydase (MPO) et les peptides antimicrobiens (AMP) tels que le peptide cationique pro-inflammatoire cathélicidine LL-37, entre autres, 8,9. Ces agrégats peuvent former des fils plus grands avec des diamètres allant jusqu’à 50 nm. Ces facteurs peuvent perturber les facteurs de virulence microbienne ou l’intégrité de la membrane cellulaire pathogène; de plus, les AMPs peuvent stabiliser l’ADN dérivé de NET contre la dégradation par les nucléases bactériennes10.
Les mécanismes spécifiques régulant la formation des TNE n’ont pas encore été complètement clarifiés. La voie la mieux caractérisée menant à la libération de NET est la signalisation ERK, qui conduit à l’activation de la NADPH oxydase et à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), ainsi qu’à une augmentation du calcium intracellulaire qui déclenche l’activation de la voie MPO. Cela transforme à son tour le peroxyde d’hydrogène en acide hypochloreux, activant NE par oxydation11,12. L’entérite nécrotique est responsable de la dégradation des filaments d’actine du cytosquelette pour bloquer la phagocytose et de leur translocation vers le noyau pour traitement par clivage protéolytique et désamination par PAD4 qui entraînent la désensibilisation des fibres de chromatine, qui s’associent aux protéines granulaires et cytoplasmiques, et sont ensuite libérées extracellulairement7. Ces protéases comprennent celles libérées par le complexe azurosome des granules azurophiles et d’autres protéases telles que la cathepsine G13.
Selon les changements morphologiques des neutrophiles, les TNE sont classées en deux types : la formation de TNE suicidaires ou lytiques conduisant à la mort cellulaire4, et la formation de TNE vitale ou non lytique produite par des cellules viables médiées par une libération vésiculeuse d’ADN nucléaire ou mitochondrial, avec un reste d’un cytoplaste anucléé ayant une capacité phagocytaire14,15. Généralement, les TNE composées d’ADN mitochondrial présentent une morphologie allongéede fibres 14, tandis que celles structurées d’ADN nucléaire ont une apparence nuageuse3. Cependant, on ne sait pas comment le neutrophile choisit son origine ADN. Contrairement aux études précédentes qui décrivaient les voies canoniques des TNE comme nécessitant plusieurs heures, la voie vitale est rapidement activée en seulement 5 à 60 minutes15.
Malgré ces avancées, la composition de l’EVF varie en fonction du stimulus; par exemple, différentes souches mucoïdes et non mucoïdes de P. aeruginosa induisent la formation de TNE contenant 33 protéines communes et jusqu’à 50 protéines variables7. Ainsi, il est nécessaire d’homogénéiser les techniques qui permettent la génération de conclusions objectives dans les groupes de recherche. Cet article décrit un protocole avec diverses techniques qui permettent de comparer et d’évaluer la composition, la structure et la morphologie des TNE induites par différents micro-organismes: Staphylococcus aureus (bactérie à Gram positif), Pseudomonas aeruginosa (bactérie à Gram négatif) et Candida albicans (champignon), ainsi que des stimuli chimiques (PMA, HOCl) dans les neutrophiles humains d’individus sains. Les résultats représentatifs démontrent l’hétérogénéité des TNE en fonction de leur stimulus inducteur dans des conditions in vitro comparables, caractérisées par la coloration de l’ADN-DAPI, l’immunomarquage pour LL37 et la quantification de l’activité enzymatique (NE, CG et MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Les neutrophiles fonctionnent comme la première ligne de défense cellulaire dans une réponse immunitaire innée en utilisant divers mécanismes, tels que la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Cette étude analyse les changements morphologiques et compositionnels des TNE induits par des stimuli microbiens et chimiques à l’aide de méthodologies in vitro normalisées pour l’induction et la caractérisation des TNE avec des cellules humaines. Les procédures décrites ici permettent d’analyser la morphologie (lytique ou non lytique) et la composition des NET (structures ADN-protéines et activité enzymatique), ainsi que l’effet des facteurs solubles ou du contact cellulaire sur ces caractéristiques. De plus, les techniques décrites ici pourraient être modifiées pour évaluer l’effet des facteurs solubles exogènes ou du contact cellulaire sur la composition des TNE.
Les techniques appliquées comprennent la purification de cellules polymorphonucléaires du sang périphérique humain à l’aide d’un double gradient de densité (1,079-1,098 g / mL), garantissant une pureté et une viabilité optimales (≥ 95%), comme démontré par la coloration de Wright, l’exclusion du bleu de trypan et la cytométrie en flux, y compris l’analyse FSC versus SSC et la coloration 7AAD. La formation de TNE est induite par des stimuli microbiens (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Candida albicans) et chimiques (acétate de myristate de phorbol, HOCl), et les TNE sont caractérisées par une coloration de l’ADN-DAPI, une immunocoloration pour le peptide antimicrobien cathélicidine (LL37) et une quantification de l’activité enzymatique (élastase neutrophile, cathepsine G et myéloperoxydase). Les images sont acquises par microscopie à fluorescence et analysées avec ImageJ.

Pureté et viabilité des neutrophiles Les phases cellulaires dynamiques sont visualisées dans le tube à partir de la purification à double gradient de densité. Au sein de ces couches, la couche correspondant aux granulocytes est supérieure à la couche de densité de 1,079 g/mL, ce qui se distingue des phases des mononucléocytes du sang périphérique (PBMC) et des érythrocytes (Figure 1A). La morphologie des cellules purifiées a été vérifiée avec la colorati...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Ce protocole démontre l’hétérogénéité de la composition, de la structure et de la morphologie des pièges extracellulaires à neutrophiles, en fonction de leur stimulus induisant dans des conditions in vitro comparables chez les neutrophiles humains d’individus sains. Une pureté et une viabilité élevées des neutrophiles sont obtenues. Cela permet de comparer la concentration d’ADN, de LL-37 et l’activité enzymatique de la myéloperoxydase, de l’élastase et de la cathepsine G, libérée par les pièges extracellulaires des neutrophiles.Ce protocole a permis d’analyser l’effet des facteurs solubles ou du contact cellulaire ou des thérapies ou mécanismes possibles pour fermer la production de TNE dans les maladies auto-immunes. Ces méthodes peuvent aider à l’investigation des maladies auto-immunes. En raison de la reproduction cellulaire incontrôlée des TNE et de la durée de l’alignement de leurs composants, qui sont considérés comme des biomarqueurs de la maladie.La microscopie à fluorescence permet de capturer l’image des TNE montrant la dispersion de l’ADN en association avec des protéines telles que LL37, qui co-localisées avec des micro-organismes aidant à comprendre comment ils apparaissent. Pour commencer, effectuez une ponction veineuse pour recueillir 10 millilitres de sang périphérique dans des tubes contenant de l’EDTA dipotassique comme anticoagulant. Ensuite, effectuez une biométrie sanguine standard et un test de protéine C-réactive pour exclure une infection ou une inflammation afin de garantir la qualité de l’échantillon.Centrifuger l’échantillon de sang périphérique pour éliminer le plasma riche en plaquettes, suivi d’une deuxième centrifugation et éliminer le plasma restant. Diluer l’ensemble érythrocytaire et leucocytaire résultant dans un rapport de volume un pour un avec une DPBS 1X. Ensuite, dans un tube de verre stérile de 10 millilitres, déposez d’abord un millilitre de solution de densité de 1,08 gramme par millilitre, suivi d’un millilitre de solution de densité de 1,079 gramme par millilitre.Ensuite, ajoutez quatre millilitres de l’érythrocyte dilué et du paquet de leucocytes en versant sur les parois. Centrifuger sans accélération ni décélération pour éviter de perturber la pente. Aspirer la phase correspondant aux granulocytes et transférer dans un autre tube de verre stérile de 10 millilitres.Laver avec quatre millilitres de 1X DPBS à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Pour éliminer les érythrocytes restants, traiter les cellules avec un choc osmotique en ajoutant quatre millilitres de solution saline à 0,2%. Incuber pendant deux minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger.Jeter le surnageant et ajouter quatre millilitres de solution saline à 0,65%. Incuber pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour rétablir l’intégrité de la membrane et répéter la centrifugation. Retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans quatre millilitres de 1X DPBS pour éliminer les débris cellulaires.Encore une fois, centrifugez et remettez en suspension la pastille de cellule dans deux millilitres de tampon HBSS froid. Pour effectuer un test d’exclusion du bleu de trypan, diluez cinq microlitres de la suspension cellulaire dans 20 microlitres de bleu de trypan à 0,4%. Compter les cellules dans une nouvelle chambre de bower et déterminer la viabilité cellulaire à l’aide d’un test d’exclusion.Ensuite, montez 5 microlitres de la suspension cellulaire sur une glissière et colorez avec la tache de Wright pendant 15 secondes. Fixez immédiatement l’échantillon, lavez à l’eau distillée et observez la morphologie au microscope optique. Ensuite, ajoutez une fois 10 aux cellules cinquièmes pour écouler les tubes de cytométrie et colorez avec un microlitre de 7AAD dans 100 microlitres de tampon FACS pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.Laver avec 500 microlitres de tampon FACS à 300 G pendant 10 minutes. Fixez les cellules avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2% et stockez à quatre degrés Celsius jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux. Pour un contrôle des cellules mortes, fixez les cellules avec 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes et lavez avec 500 microlitres de 1XPBS à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant et ajoutez 200 microlitres de 0,1% Triton X-100. Incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius. Laver avec 500 microlitres de 1X PBS et teindre avec 7AAD.Analysez les données capturées dans le logiciel de cytomètre en flux. Chargez les fichiers et double-cliquez sur le fichier neutrophile non taché. Choisissez la diffusion vers l’avant ou FSC sur l’axe X et la diffusion latérale ou SSC sur l’axe Y pour afficher la population cellulaire correspondant aux neutrophiles.Sélectionnez ensuite le canal B3-A:PerCP vio 700-A sur l’axe X pour délimiter l’autofluorescence des cellules et choisissez l’histogramme sur l’axe Y. Ensuite, ouvrez le fichier des neutrophiles tachés. Choisissez FSC sur l’axe X et SSC sur l’axe Y pour afficher la population cellulaire correspondant aux neutrophiles.Encore une fois, sélectionnez le canal B3-A:PerCP vio 700-A pour délimiter la population de neutrophiles positifs pour le colorant 7AAD. Générez l’histogramme final en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre et en sélectionnant Copier dans l’éditeur de mise en page. Ajouter des pseudohyphes bactériens ou fongiques dans des microtubes de 1,5 millilitre.Ajoutez 200 microlitres, donc cinq micromolaires CFSC dans 1X PBS. Mélanger et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 500 microlitres de plasma décomplété et de centrifugeuse.Jetez le surnageant et lavez la pastille avec un millilitre de 1XPBS avec centrifugation. Ensuite, re-suspendez les micro-organismes dans 250 microlitres de 1X PBS. Préparer 50 microlitres aliquotes dans des microtubes de 1,5 millilitre avec deux fois 10 à la septième bactérie ou deux fois 10 à la cinquième pseudohyphe pour l’induction NET.Placez des couvercles de verre stérile de 10 millimètres sur 10 millimètres dans une assiette de 24 puits. Couvrir avec 10 microlitres de 0,001% poly l-lysine pendant une heure à température ambiante et laver deux fois avec 100 microlitres de 1X PBS. Sécher à l’air libre et irradier à la lumière UV pendant 15 minutes.Ensuite, remplacer la solution HBSS de la suspension de neutrophiles préparée précédemment par un milieu RPMI 1640 complété par du plasma autologue décomplété à 10% par la chaleur. Ajouter 350 microlitres de cette suspension cellulaire à la plaque de 24 puits pour une concentration finale de deux fois 10 à cinq neutrophiles par puits. Incuber la plaque pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pour permettre aux cellules d’adhérer au fond des puits.Pour induire la formation de filets, ajoutez les stimuli bactériens MOI100 et pseudohyphes à MOI1. Ajoutez également les stimuli biochimiques et préparez un contrôle sans stimulus en ajoutant 50 microlitres de HBSS. Obtenir un volume final de 400 microlitres par puits et mélanger sur un agitateur à plaques à 140 RPM pendant 30 secondes.Puis incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après induction nette, retirer le surnageant des puits en le pipetant soigneusement et fixer les cellules avec 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes. Lavez les cellules avec 200 microlitres de 1X PBS sans centrifuger et ajoutez 200 microlitres de tampon bloquant pendant 30 minutes.Pour la coloration LL37, perméabiliser les cellules avec 200 microlitres de 0,2% Triton X-100 dans 1X PBS pendant 10 minutes et laver avec 1X PBS deux fois. Montez les bordereaux de couverture sur des lames de verre. L’ADN colore les cellules avec deux microlitres de DAPI et les stocke à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse par microscopie confocale à fluorescence.Les phases cellulaires dynamiques ont été visualisées après purification à double gradient de densité. La morphologie typique des neutrophiles a été confirmée par une coloration droite. Les cellules ont également montré une viabilité optimale observée par exclusion du bleu de trypan sans perturbation de la membrane.L’analyse des SSC par rapport aux FSC par cytométrie en flux a confirmé une population correspondant à la PMN avec une pureté cellulaire élevée. Les diagrammes de points PMN pour les cellules non colorées par rapport aux cellules colorées 7AAD et leurs histogrammes respectifs ont indiqué une viabilité cellulaire élevée dans les neutrophiles fraîchement isolés par rapport aux cellules témoins perméabilisées. Après avoir stimulé les neutrophiles avec des stimulants chimiques et microbiens, les TNE ont été visualisées par microscopie à fluorescence à l’aide de l’ADN DPI et de l’anti-LL37.Les micro-organismes ont été pré-colorés avec CFSE. Formation de filet suicidaire induite par la PMA indiquée par co-localisation avec LL37. Alors que les TNE formées avec HOCI ont montré une dispersion mineure de l’ADN dans l’espace extracellulaire qui correspondait à la formation vitale de TNE.Les TNE induites par les pseudohyphes fongiques ont montré de faibles concentrations d’ADN libérées dans l’espace extracellulaire avec des structures filamenteuses caractéristiques de la formation vitale de TNE. S. aureus a montré une formation vitale de TNE tandis que P. aeruginosa a induit la libération de grandes concentrations d’ADN avec une morphologie trouble qui co-localisée avec LL37 indiquant la formation de NET suicidaire. La réalisation d’une méthodologie de gradient de double densité nous permet d’obtenir une pureté et une viabilité élevées des neutrophiles.Et nous élevons les lavages, nous évitons d’endommager la structure de ceux-ci. En suivant cette méthode, nous pouvons analyser l’effet de substances ou de cellules dans la production de TNE ainsi que si elles sont impliquées dans un mécanisme ou leur utilisation comme thérapies dans les maladies auto-immunes.

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