Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Basic Science Grant (#285480) von CONACyT und von der Abteilung für klinische Immunologieforschung der Fakultät für Biochemische Wissenschaften der Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca unterstützt. A.A.A, S.A.S.L. und W.J.R.R. haben Doktorandenstipendien der CONACyT-Nummern #799779, #660793 bzw. #827788.

Die Blutproben wurden als Spenden von klinisch gesunden Teilnehmern nach Einverständniserklärung entnommen. Alle Experimente wurden mit Genehmigung der Ethikkommission für Humanforschung der Fakultät für Biochemische Wissenschaften der Universidad Autónoma "Benito Juárez" von Oaxaca durchgeführt.
HINWEIS: Die Einschlusskriterien in der Studie waren undeutliches Geschlecht und Alter und klinisch gesund gemäß den Antworten der Teilnehmer auf einen Fragebogen vor der Entnahme einer Blut...

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	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Um die Freisetzung von NETs zu induzieren, muss eine hochreine Population lebensfähiger Neutrophilen erhalten werden, da diese Zellen eine begrenzte Ex-vivo-Lebensdauer von durchschnittlich 8 Stunden haben, ein Zeitraum, in dem alle Experimente durchgeführt werden müssen. Zu diesem Zweck ist die ideale Methodik der Double-Density-Gradient zur Optimierung der Reinigungszeit durch Isolierung nicht aktivierter Zellen, die im Gegensatz zu Ficoll-Histopaque-Gradienten- oder Dextran-Sedimentationstechniken besser a...

Neutrophile sind die am häufigsten vorkommenden Leukozyten im Blutkreislauf und spielen eine wesentliche Rolle bei der Beseitigung von Krankheitserregern durch verschiedene Mechanismen, einschließlich der Freisetzung großer Chromatinstrukturen, die aus DNA und mehreren nuklearen, zytoplasmatischen und granulären antibakteriellen Proteinen bestehen 1,2. Der direkte Vorläufer, der diese antimikrobielle Rolle von Neutrophilen beschreibt, wurde 1996 von Takei et al.3 erstellt. Diese Autoren berichteten über eine neue Form des Todes, die sich von Apoptose und Nekroptose bei Neutrophilen unterschied, morphologische Veränderungen zeigten, die einen Kernbruch zeigten, gefolgt von einem Austreten aus dem Nukleoplasma in das Zytoplasma und einer Erhöhung der Membranpermeabilität nach 3 Stunden Inkubation mit Phorbolmyristatacetat (PMA)2,3. Es dauerte jedoch bis 2004, bis der Begriff "neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs)" verwendet wurde4.
Die NET-Bildung wurde unter verschiedenen Bedingungen beobachtet, wie z. B. bakteriellen,Pilz-5-,Virus-6- und parasitären Infektionen, um die mikrobielle Verbreitung zu neutralisieren, abzutöten und zu verhindern7. Andere Studien zeigen, dass es auch unter nicht-pathogenen Zuständen durch sterile Reize wie Zytokine, Mononatriumharnsäure- oder Cholesterinkristalle, Autoantikörper, Immunkomplexe und aktivierte Blutplättchen auftretenkann 7. Lipopolysaccharid (LPS), Interleukin-8 (IL-8) und PMA gehörten zu den ersten In-vitro-Stimuli, die als NET-Induktoren beschrieben wurden, und die In-vivo-Beteiligung von NET an pathogenen Prozessen wurde in zwei Modellen akuter Entzündung nachgewiesen: experimentelle Dysenterie und spontane menschliche Appendizitis4. DNA ist eine wesentliche NET-Komponente. Seine geeignete Struktur und Zusammensetzung sind für die Sequestrierung und Abtötung von Mikroorganismen notwendig, indem eine hohe lokale Konzentration antimikrobieller Moleküle an die gefangenen Mikroben abgegeben wird, wie eine kurze Desoxyribonuklease (DNase)-Behandlung zeigt, die NETs und ihre mikrobiziden Eigenschaften zersetzt4. NETs umfassen neben DNA u.a. angehängte Proteine wie Histone, neutrophile Elastase (NE), Cathepsin G (CG), Proteinase 3, Lactoferrin, Gelatinase, Myeloperoxidase (MPO) und antimikrobielle Peptide (AMPs) wie das kationische proinflammatorische Peptid Cathelicidin LL-37 u.a. 8,9. Solche Aggregate können größere Fäden mit Durchmessern von bis zu 50 nm bilden. Diese Faktoren können die mikrobiellen Virulenzfaktoren oder die Integrität der Zellmembran des Erregers stören. zusätzlich können die AMPs die NET-abgeleitete DNA gegen den Abbau durch bakterielle Nukleasenstabilisieren 10.
Die spezifischen Mechanismen, die die NET-Bildung regulieren, sind noch nicht vollständig geklärt. Der am besten charakterisierte Weg, der zur NET-Freisetzung führt, ist der ERK-Signalweg, der zur Aktivierung der NADPH-Oxidase und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sowie zu erhöhtem intrazellulärem Kalzium führt, das die Aktivierung des MPO-Signalwegs auslöst. Dies wiederum wandelt Wasserstoffperoxid in hypochlorige Säure um und aktiviert NE durch Oxidation11,12. NE ist verantwortlich für den Abbau der Aktinfilamente des Zytoskeletts, um die Phagozytose zu blockieren, und für die Translokation in den Zellkern zur Verarbeitung durch proteolytische Spaltung und Desaminierung durch PAD4, die die Desensibilisierung von Chromatinfasern vorantreiben, die sich mit granulierten und zytoplasmatischen Proteinen verbinden und dann extrazellulär freigesetzt werden7. Zu diesen Proteasen gehören diejenigen, die aus dem Azurosomenkomplex des azurophilen Granulats und anderen Proteasen wie Cathepsin G13 freigesetzt werden.
Abhängig von den morphologischen Veränderungen der Neutrophilen werden NETs in zwei Typen eingeteilt: suizidale oder lytische NET-Bildung, die zum Zelltod führt4, und vitale oder nicht-lytische NET-Bildung, die von lebensfähigen Zellen erzeugt wird, die durch eine vesikuläre Freisetzung von nukleärer oder mitochondrialer DNA vermittelt wird, mit einem Überrest eines kernhaltigen Zytoplasten mit phagozytärer Fähigkeit14,15. Im Allgemeinen weisen NETs, die aus mitochondrialer DNA bestehen, eine länglicheFaser-14-Morphologie auf, während solche, die aus Kern-DNA strukturiert sind, ein wolkenartiges Aussehenaufweisen 3. Es ist jedoch nicht bekannt, wie die Neutrophile ihren DNA-Ursprung wählt. Im Gegensatz zu früheren Studien, die die kanonischen Signalwege von NETs als mehrere Stunden dauernd beschrieben, wird der Vitalweg in nur 5-60 min15 schnell aktiviert.
Trotz dieser Fortschritte variiert die NET-Zusammensetzung je nach Stimulus; Zum Beispiel induzieren verschiedene schleimige und nicht-mukoide Stämme von P. aeruginosa die Bildung von NETs, die 33 gemeinsame Proteine und bis zu 50 variable Proteine enthalten7. Daher ist es notwendig, Techniken zu homogenisieren, die die Generierung objektiver Schlussfolgerungen in Forschungsgruppen ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll mit verschiedenen Techniken, die den Vergleich und die Bewertung der Zusammensetzung, Struktur und Morphologie von NETs ermöglichen, die mit verschiedenen Mikroorganismen induziert werden: Staphylococcus aureus (grampositives Bakterium), Pseudomonas aeruginosa (gramnegatives Bakterium) und Candida albicans (Pilz) sowie chemische Stimuli (PMA, HOCl) in menschlichen Neutrophilen von gesunden Personen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Heterogenität von NETs in Abhängigkeit von ihrem induzierenden Stimulus unter vergleichbaren in vitro Bedingungen, gekennzeichnet durch DNA-DAPI-Färbung, Immunfärbung für LL37 und Quantifizierung der enzymatischen Aktivität (NE, CG und MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Neutrophile fungieren als erste Linie der zellulären Abwehr in einer angeborenen Immunantwort, indem sie verschiedene Mechanismen einsetzen, wie z.B. die Bildung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs). Diese Studie analysiert die morphologischen und kompositorischen Veränderungen in NETs, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden, unter Verwendung standardisierter In-vitro-Methoden für die NET-Induktion und Charakterisierung mit menschlichen Zellen. Die hier beschriebenen Verfahren ermöglichen die Analyse der NET-Morphologie (lytisch oder nicht-lytisch) und der Zusammensetzung (DNA-Proteinstrukturen und enzymatische Aktivität) sowie die Wirkung löslicher Faktoren oder zellulärer Kontakte auf solche Eigenschaften. Zusätzlich könnten die hier beschriebenen Techniken modifiziert werden, um die Wirkung von exogenen löslichen Faktoren oder zellulärem Kontakt auf die NET-Zusammensetzung zu bewerten.
Die angewandten Techniken umfassen die Reinigung von polymorphkernigen Zellen aus menschlichem peripherem Blut unter Verwendung eines doppelten Dichtegradienten (1,079-1,098 g/ml), der eine optimale Reinheit und Lebensfähigkeit (≥ 95%) garantiert, wie die Wright-Färbung, der Trypanblauausschluss und die Durchflusszytometrie, einschließlich FSC- versus SSC-Analyse und 7AAD-Färbung, zeigen. Die NET-Bildung wird mit mikrobiellen (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus und Candida albicans) und chemischen (Phorbolmyristatacetat, HOCl) Stimuli induziert, und die NETs sind durch DNA-DAPI-Färbung, Immunfärbung für das antimikrobielle Peptid Cathelicidin (LL37) und Quantifizierung der enzymatischen Aktivität (neutrophile Elastase, Cathepsin G und Myeloperoxidase) gekennzeichnet. Die Bilder werden mittels Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen und mit ImageJ analysiert.

Reinheit und Lebensfähigkeit von Neutrophilen Die dynamischen zellulären Phasen werden in der Röhre aus der Double-Density-Gradientenreinigung visualisiert. Innerhalb dieser Schichten befindet sich die Schicht, die den Granulozyten entspricht, oberhalb der Dichteschicht von 1,079 g/ml, die von den Phasen der peripheren Blutmononukleozyten (PBMCs) und Erythrozyten unterschieden wird (Abbildung 1A). Die Morphologie der gereinigten Zellen wurde mit Wright-Färbung verifiz...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Dieses Protokoll zeigt die Heterogenität in Zusammensetzung, Struktur und Morphologie von neutrophilen extrazellulären Fallen, abhängig von ihrem induzierenden Reiz unter vergleichbaren In-vitro-Bedingungen in humanen Neutrophilen von gesunden Individuen. Es wird eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit der neutrophilen Granulozyten erreicht. Dies ermöglicht es, die Konzentration von DNA, LL-37 und die Enzymaktivität von Myeloperoxidase, Elastase und Cathepsin G zu vergleichen, die von extrazellulären Neutrophilenfallen freigesetzt werden.Dieses Protokoll ermöglichte es, die Wirkung von löslichen Faktoren oder Zellkontakt oder mögliche Therapien oder Mechanismen zum Schließen der Produktion von NETs bei Autoimmunerkrankungen zu analysieren. Diese Methoden können bei der Untersuchung von Autoimmunerkrankungen helfen. Aufgrund der unkontrollierten Zellvermehrung von NETs und der Dauer der Ausrichtung ihrer Bestandteile, die als Biomarker der Krankheit gelten.Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Bilder von NETs aufzunehmen, die die Dispersion von DNA in Verbindung mit Proteinen wie LL37 zeigen, die mit Mikroorganismen kolokalisiert sind, um zu verstehen, wie sie aussehen. Führen Sie zunächst eine Venenpunktion durch, um 10 Milliliter peripheres Blut in Röhrchen zu sammeln, die Dikalium-EDTA als Antikoagulans enthalten. Führen Sie dann eine Standard-Blutbiometrie und einen C-reaktiven Proteintest durch, um eine Infektion oder Entzündung auszuschließen und die Qualität der Probe sicherzustellen.Zentrifugieren Sie die periphere Blutprobe, um das plättchenreiche Plasma zu entfernen, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation und verwerfen Sie das verbleibende Plasma. Verdünnen Sie das resultierende Erythrozyten- und Leukozytenpaket im Eins-zu-Eins-Volumenverhältnis mit einem 1X DPBS. Dann geben Sie in einem sterilen 10-Milliliter-Glasröhrchen zuerst einen Milliliter mit 1,08 Gramm pro Milliliter Dichtelösung, gefolgt von einem Milliliter mit 1,079 Gramm pro Milliliter Dichtelösung.Dann fügen Sie vier Milliliter des verdünnten Erythrozyten- und Leukozytenpakets hinzu, indem Sie es über die Wände gießen. Zentrifuge ohne Beschleunigung oder Verzögerung, um das Gefälle nicht zu stören. Die Phase, die den Granulozyten entspricht, wird abgesaugt und in ein anderes steriles 10-Milliliter-Glasröhrchen überführt.Mit vier Millilitern 1X DPBS bei 300 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius waschen und den Überstand entsorgen. Um die verbleibenden Erythrozyten zu entfernen, behandeln Sie die Zellen mit einem osmotischen Schock, indem Sie vier Milliliter 0,2% Kochsalzlösung hinzufügen. Zwei Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren und zentrifugieren.Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie vier Milliliter 0,65% Kochsalzlösung hinzu. Fünf Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, um die Integrität der Membran wiederherzustellen und die Zentrifugation zu wiederholen. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern 1X DPBS, um Zelltrümmer zu entfernen.Zentrifugieren Sie das Zellpellet erneut und suspendieren Sie es erneut in zwei Milliliter kaltem HBSS-Puffer. Um einen Trypanblau-Ausschlusstest durchzuführen, verdünnen Sie fünf Mikroliter der Zellsuspension in 20 Mikrolitern 0,4% Trypanblau. Zählen Sie die Zellen in einer neuen Laubenkammer und bestimmen Sie die Zelllebensfähigkeit mit einem Ausschlusstest.Dann montieren Sie 5 Mikroliter der Zellsuspension auf einem Objektträger und färben Sie 15 Sekunden lang mit Wright-Färbung. Fixieren Sie die Probe sofort, waschen Sie sie mit destilliertem Wasser und beobachten Sie die Morphologie unter einem optischen Mikroskop. Als nächstes geben Sie einmal 10 bis fünf Zellen in Durchflusszytometrieröhrchen und färben Sie mit einem Mikroliter 7AAD in 100 Mikroliter FACS-Puffer für 15 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Mit 500 Mikroliter FACS-Puffer bei 300 g 10 Minuten waschen. Fixieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius bis zur Durchflusszytometrie-Analyse. Für eine tote Zelle fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten und waschen Sie mit 500 Mikrolitern 1XPBS bei 300 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter 0,1% Triton X-100 hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius. Mit 500 Mikrolitern 1X PBS waschen und mit 7AAD einfärben.Analysieren Sie die erfassten Daten in der Durchflusszytometer-Software. Laden Sie die Dateien und doppelklicken Sie auf die ungefärbte Neutrophilendatei. Wählen Sie Vorwärtsstreuung oder FSC auf der X-Achse und Seitenstreuung oder SSC auf der Y-Achse, um die Zellpopulation anzuzeigen, die den Neutrophilen entspricht.Wählen Sie dann den Kanal B3-A:PerCP vio 700-A auf der X-Achse, um die Autofluoreszenz der Zellen zu begrenzen und wählen Sie das Histogramm auf der Y-Achse. Öffnen Sie dann die gefärbte Neutrophilendatei. Wählen Sie FSC auf der X-Achse und SSC auf der Y-Achse, um die Zellpopulation anzuzeigen, die den Neutrophilen entspricht.Wählen Sie erneut den Kanal B3-A:PerCP vio 700-A, um die Population der Neutrophilen abzugrenzen, die für den Farbstoff 7AAD positiv sind. Generieren Sie das endgültige Histogramm, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Fenster klicken und In Layout-Editor kopieren auswählen. Geben Sie bakterielle oder pilzliche Pseudohyphen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen hinzu.Fügen Sie 200 Mikroliter hinzu, also fünf mikromolare CFSC in 1X PBS. Mischen und bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten im Dunkeln inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 500 Mikroliter dekomplementäres Plasma und Zentrifuge hinzufügen.Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter 1XPBS durch Zentrifugation. Dann suspendieren Sie die Mikroorganismen in 250 Mikrolitern 1X PBS. Bereiten Sie 50 Mikroliter-Aliquots in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit zweimal 10 bis zum siebten Bakterium oder zweimal 10 bis zum fünften Pseudohyphen für die NET-Induktion vor.Legen Sie 10 x 10 Millimeter große sterile Glasabdeckungen in eine 24-Well-Platte. Mit 10 Mikrolitern 0,001%Poly-L-Lysin für eine Stunde bei Raumtemperatur bedecken und zweimal mit 100 Mikrolitern 1X PBS waschen. An der Luft trocknen und 15 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlen.Als nächstes wird die HBSS-Lösung der zuvor hergestellten neutrophilen Suspension durch RPMI 1640-Medium ersetzt, das mit 10% wärmedekomplementärem autologen Plasma ergänzt wird. Fügen Sie 350 Mikroliter dieser Zellsuspension zu der 24-Well-Platte hinzu, um eine Endkonzentration von zwei mal 10 bis zur fünften Neutrophile pro Vertiefung zu erhalten. Inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, damit die Zellen am Boden der Vertiefungen haften bleiben.Um die Netzbildung zu induzieren, fügen Sie die Bakterienreize MOI100 und Pseudohyphen an MOI1 hinzu. Fügen Sie auch die biochemischen Stimuli hinzu und bereiten Sie eine Kontrolle ohne Stimulus vor, indem Sie 50 Mikroliter HBSS hinzufügen. Erhalten Sie ein Endvolumen von 400 Mikrolitern pro Vertiefung und mischen Sie auf einem Plattenschüttler bei 140 U/min für 30 Sekunden.Dann vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Nach der Nettoinduktion wird der Überstand durch vorsichtiges Pipettieren aus den Vertiefungen entfernt und die Zellen 30 Minuten lang mit 300 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd fixiert. Waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 1X PBS ohne Zentrifugieren und fügen Sie 200 Mikroliter Blockpuffer für 30 Minuten hinzu.Für die LL37-Färbung permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,2% Triton X-100 in 1X PBS für 10 Minuten und waschen Sie zweimal mit 1X PBS. Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträgern. DNA färbt die Zellen mit zwei Mikrolitern DAPI und lagert sie bei minus 20 Grad Celsius bis zur Analyse durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie.Die dynamischen zellulären Phasen wurden nach doppelter Dichtegradientenreinigung visualisiert. Die typische Morphologie der neutrophilen Granulozyten wurde durch eine rechte Färbung bestätigt. Die Zellen zeigten auch eine optimale Lebensfähigkeit, die durch Trypanblau-Ausschluss ohne Membranzerstörung beobachtet wurde.Die Analyse von SSC versus FSC mittels Durchflusszytometrie bestätigte eine PMN-konforme Population mit hoher Zellreinheit. PMN-Punktdiagramme für ungefärbte Zellen im Vergleich zu 7AAD-Färbungszellen und ihre jeweiligen Histogramme zeigten eine hohe Zelllebensfähigkeit in den frisch isolierten Neutrophilen im Vergleich zu den permeabilisierten Kontrollzellen. Nach der Stimulation der Neutrophilen mit chemischen und mikrobiellen Stimulanzien wurden NETs durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von DNA-DPI und Anti-LL37 sichtbar gemacht.Die Mikroorganismen wurden mit CFSE vorgefärbt. PMA-induzierte suizidale Netzbildung, indiziert durch Kolokalisation mit LL37. Während NETs, die mit HOCI gebildet wurden, eine geringe DNA-Dispersion im extrazellulären Raum zeigten, die der vitalen NET-Bildung entsprach.NET, das durch pilzliche Pseudohyphen induziert wurde, zeigte niedrige Konzentrationen von DNA, die in den extrazellulären Raum freigesetzt wurden, mit filamentösen Strukturen, die für die vitale NET-Bildung charakteristisch sind. S. aureus zeigte eine vitale NET-Bildung, während P. aeruginosa die Freisetzung großer DNA-Konzentrationen mit einer trüben Morphologie induzierte, die mit LL37 kolokalisiert war, was auf eine Selbstmord-NET-Bildung hindeutet. Die Durchführung der Doppeldichtegradientenmethode ermöglicht es uns, eine hohe Reinheit und Lebensfähigkeit von Neutrophilen zu erreichen.Und wir heben die Waschungen an, wir vermeiden es, die Struktur von ihnen zu beschädigen. Mit dieser Methode können wir die Wirkung von Substanzen oder Zellen auf die NET-Produktion analysieren, sowie ob sie an einem Mechanismus beteiligt sind oder ob sie als Therapie bei Autoimmunerkrankungen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisierung von Makrophagen extrazelluläre fallen mit der konfokalen Mikroskopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

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Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...