Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מדע בסיסי (#285480) מ- CONACyT ועל ידי המחלקה למחקר אימונולוגיה קלינית של הפקולטה למדעים ביוכימיים, אוניברסיטת אוטונומה 'בניטו חוארס' דה אואחאקה. ל-A.A.A, S.A.S.L ו-W.J.R.R. יש מלגות דוקטורט של מספרי CONACyT #799779, #660793 ו-#827788, בהתאמה.

דגימות הדם התקבלו כתרומות ממשתתפים בריאים מבחינה קלינית לאחר הסכמה מדעת. כל הניסויים בוצעו באישור ועדת האתיקה של המחקר האנושי של הפקולטה למדעי הביוכימיה, אוניברסיטת אוטונומה 'בניטו חוארס' מאואחאקה.
הערה: קריטריוני ההכללה במחקר היו מין וגיל לא ברורים, ובריאים מבחינה קלינית ...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

יש להשיג אוכלוסייה טהורה ביותר של נויטרופילים בני קיימא כדי לגרום לשחרור של NETs מכיוון שלתאים אלה יש אורך חיים מוגבל של 8 שעות בממוצע, תקופה שבה יש לבצע את כל הניסויים. לשם כך, המתודולוגיה האידיאלית היא שיפוע הצפיפות הכפולה כדי לייעל את זמן הטיהור על ידי בידוד תאים לא פעילים המגיבים יות?...

נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בזרם הדם, הממלאים תפקיד חיוני במהלך פינוי סוכנים פתוגניים על ידי מספר מנגנונים, כולל שחרור מבני כרומטין גדולים המורכבים מ- DNA ומספר חלבונים אנטיבקטריאליים גרעיניים, ציטופלסמיים וגרגירים 1,2. ההקדמה הישירה המתארת את התפקיד האנטי-מיקרוביאלי הזה של נויטרופילים נעשתה על ידי Takei et al.3 בשנת 1996. מחברים אלה דיווחו על צורה חדשה של מוות שונה מאפופטוזיס ונקרופטוזיס בנויטרופילים, הראו שינויים מורפולוגיים המציגים קרע גרעיני, ולאחר מכן נשפך מתוך הנוקלאופלזמה לתוך הציטופלסמה, ועלייה בחדירות הממברנה מ-3 שעות של דגירה עם phorbol myristate אצטט (PMA)2,3. עם זאת, רק בשנת 2004 נעשה שימוש במונח "מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs)"4.
היווצרות NET נצפתה במצבים שונים, כגון חיידקים חיידקיים, פטרייתיים5, ויראליים6 וזיהומים טפיליים, לנטרול, הרג ומניעת הפצה מיקרוביאלית7. מחקרים אחרים מראים כי זה יכול להתרחש גם בתנאים לא פתוגניים על ידי גירויים סטריליים, כגון ציטוקינים, חומצת שתן מונוסודיום או גבישי כולסטרול, נוגדנים עצמיים, קומפלקסים חיסוניים, וטסיות מופעלות7. ליפופוליסכריד (LPS), אינטרלוקין-8 (IL-8) ו-PMA היו בין הגירויים הראשונים במבחנה שתוארו כמשרי NET, ומעורבות in vivo NET בתהליכים פתוגניים הודגמה בשני מודלים של דלקת חריפה: דיזנטריה ניסיונית ודלקת התוספתן האנושית הספונטנית4. דנ"א הוא מרכיב NET חיוני. המבנה וההרכב המתאימים שלו נחוצים לריצוף והרג של מיקרואורגניזמים על ידי העברת ריכוז מקומי גבוה של מולקולות אנטי-מיקרוביאליות לעבר המיקרובים שנתפסו, כפי שמודגם על ידי טיפול קצר בדאוקסיריבונוקלאז (DNase) המפרק את ה-NETs ואת תכונותיהם המיקרו-ביצידליות4. מלבד דנ"א, NETs מורכבים מחלבונים מחוברים כגון היסטונים, נויטרופיל אלסטאז (NE), קתפסין G (CG), פרוטאינאז 3, לקטופרין, ג'לטינאז, מיאלופרוקסידאז (MPO) ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים (AMPs) כגון הפפטיד הקטיוני מרובה הדלקת קתליצידין LL-37 בין היתר 8,9. אגרגטים כאלה עשויים ליצור חוטים גדולים יותר עם קטרים של עד 50 ננומטר. גורמים אלה יכולים לשבש את גורמי האלימות המיקרוביאלית או את שלמות קרום התא הפתוגן; בנוסף, ה-AMPs יכולים לייצב את הדנ"א שמקורו ב-NET מפני פירוק על-ידי נוקלאזות חיידקיות10.
המנגנונים הספציפיים המסדירים את היווצרות NET טרם הובהרו במלואם. המסלול המאופיין בצורה הטובה ביותר המוביל לשחרור NET הוא באמצעות איתות ERK, מה שמוביל להפעלת NADPH אוקסידאז ולייצור חמצן תגובתי (ROS), כמו גם לסידן תוך תאי מוגבר המפעיל הפעלה של מסלול MPO. זה בתורו הופך מי חמצן לחומצה היפוכלורית, ומפעיל את NE על ידי חמצון11,12. NE אחראי להשפלת חוטי האקטין של השלד הציטוסקולרי כדי לחסום פאגוציטוזה ולהעביר אותם לגרעין לצורך עיבוד על ידי ביקוע פרוטאוליטי ופירוק על ידי PAD4 המניעים את הדה-סנסיטיזציה של סיבי הכרומטין, המתקשרים לחלבונים גרגירים וציטופלסמיים, ולאחר מכן משתחררים באופן חוץ-תאי7. פרוטאזות אלה כוללות את אלה המשתחררות מקומפלקס האזורוזומים של גרגירי האזורופיל ופרוטאזות אחרות כגון קתפסין G13.
בהתאם לשינויים המורפולוגיים בנויטרופילים, NETs מסווגים לשני סוגים: היווצרות NET אובדנית או ליטית המובילה למוות תאי4, והיווצרות NET חיונית או לא ליטית המיוצרת על ידי תאים בני קיימא המתווכים על ידי שחרור שלפוחית של דנ"א גרעיני או מיטוכונדריאלי, עם שריד של ציטופלסט אנוקליע עם יכולת פאגוציטית14,15. באופן כללי, NETs המורכבים מדנ"א מיטוכונדריאלי מציגים מורפולוגיה של סיב14 מוארך, ואילו אלה המובנים מדנ"א גרעיני הם בעלי מראה דמוי ענן3. עם זאת, לא ידוע כיצד הנויטרופיל בוחר את מקור הדנ"א שלו. בניגוד למחקרים קודמים שתיארו את המסלולים הקנוניים של NETs ככאלה שדורשים מספר שעות, המסלול החיוני מופעל במהירות תוך 5-60 דקות15 דקות בלבד.
למרות ההתקדמות הזו, הרכב ה-NET משתנה בהתאם לגירוי; לדוגמה, זנים שונים של רירית ולא רירית של P. aeruginosa גורמים להיווצרות NETs המכילים 33 חלבונים נפוצים ועד 50 חלבונים משתנים7. לכן, יש צורך הומוגניות טכניקות המאפשרות הדור של מסקנות אובייקטיביות בקבוצות מחקר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עם טכניקות שונות המאפשרות השוואה והערכה של הרכב, מבנה ומורפולוגיה של NETs המושרים עם מיקרואורגניזמים שונים: סטפילוקוקוס אאורוס (חיידק גראם חיובי), Pseudomonas aeruginosa (חיידק גראם שלילי) וקנדידה אלביקנס (פטרייה), כמו גם גירויים כימיים (PMA, HOCl) בנויטרופילים אנושיים מאנשים בריאים. התוצאות המייצגות מדגימות את ההטרוגניות של NETs בהתאם לגירוי הגורם שלהם בתנאים מקבילים במבחנה, המאופיינים בהכתמת DNA-DAPI, אימונוסטינינג עבור LL37 וכימות של פעילות אנזימטית (NE, CG ו- MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

נויטרופילים מתפקדים כקו ההגנה התאי הראשון בתגובה חיסונית מולדת על ידי הפעלת מנגנונים מגוונים, כגון היווצרות מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות (NETs). מחקר זה מנתח את השינויים המורפולוגיים והקומפוזיציוניים ב-NETs המושרים על-ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים תוך שימוש במתודולוגיות סטנדרטיות במבחנה להשראת NET ואפיון עם תאים אנושיים. ההליכים המתוארים כאן מאפשרים ניתוח של מורפולוגיה NET (ליטית או לא ליטית) והרכב (מבנים של חלבון DNA ופעילות אנזימטית), ואת ההשפעה של גורמים מסיסים או מגע תאי על מאפיינים אלה. בנוסף, ניתן לשנות את הטכניקות המתוארות כאן כדי להעריך את ההשפעה של גורמים מסיסים אקסוגניים או מגע תאי על הרכב NET.
הטכניקות המיושמות כוללות טיהור של תאים פולימורפונוקליאריים מדם היקפי אנושי באמצעות שיפוע בצפיפות כפולה (1.079-1.098 גרם/מ"ל), מה שמבטיח טוהר וכדאיות אופטימליים (≥ 95%) כפי שהוכח על ידי הכתמה, הרחקת טריפן כחול וציטומטריה של זרימה, כולל ניתוח FSC לעומת SSC וצביעת 7AAD. היווצרות NET מושרית באמצעות גירויים מיקרוביאליים (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ו-Candida albicans) וכימיים (phorbol myristate acetate, HOCl), וה-NETs מאופיינים בהכתמת DNA-DAPI, אימונוסטינינג לפפטיד האנטי-מיקרוביאלי קתליצידין (LL37), וכימות הפעילות האנזימטית (נויטרופיל אלסטאז, קתפסין G ומיאלופרוקסידאז). התמונות נרכשות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומנותחות באמצעות ImageJ.

טוהר וכדאיות של נויטרופילים השלבים התאיים הדינמיים מוצגים בצינור מטיהור הדרגתי בצפיפות כפולה. בתוך השכבות האלה, השכבה המתאימה לגרנולוציטים נמצאת מעל שכבת הצפיפות של 1.079 גרם/מ"ל, בשונה מהשלבים של מונונוקלוציטים בדם היקפי (PBMCs) ואריתרוציטים (איור 1A). המורפולוגיה ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

פרוטוקול זה מדגים את ההטרוגניות בהרכב, במבנה ובמורפולוגיה של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות, בהתאם לגירוי שלהן בתנאי מבחנה דומים בנויטרופילים אנושיים מאנשים בריאים. טוהר נויטרופילים גבוה וכדאיות מתקבלים. זה מאפשר להשוות את ריכוז הדנ"א, LL-37 ופעילות האנזים של מיאלופרוקסידאז, אלסטאז וקתפסין G, המשתחררים על ידי מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות.פרוטוקול זה איפשר לנתח את ההשפעה של גורמים מסיסים או מגע תאי או טיפולים או מנגנונים אפשריים לסגירת הייצור של NETs במחלות אוטואימוניות. שיטות אלה יכולות לסייע בחקר מחלות אוטואימוניות. בשל רבייה תאית בלתי מבוקרת של NETs ומשך הזמן של ליישר את המרכיבים שלהם, אשר נחשבים סמנים ביולוגיים של המחלה.מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת ללכוד תמונה של NETs המציגה את פיזור הדנ"א בשיתוף עם חלבונים כגון LL37, אשר ממוקמים יחד עם מיקרואורגניזמים ומסייעים להבין כיצד הם מופיעים. כדי להתחיל, לבצע נקב vena לאסוף 10 מיליליטר של דם היקפי בצינורות המכילים dipotassium EDTA כמו נוגדי קרישה. לאחר מכן בצע ביומטריה סטנדרטית של דם ובדיקת חלבון מגיב C כדי לשלול זיהום או דלקת כדי להבטיח את איכות הדגימה.צנטריפוגה את דגימת הדם ההיקפית כדי להסיר את הפלזמה העשירה בטסיות, ולאחר מכן צנטריפוגה שנייה ולהשליך את הפלזמה הנותרת. דלל את אריתרוציטים וכתוצאה מכך חבילת לויקוציטים ביחס נפח אחד לאחד עם DPBS אחד 1X. לאחר מכן, בצינור זכוכית סטרילי של 10 מיליליטר, הפקד תחילה מיליליטר אחד של 1.08 גרם לתמיסת צפיפות מיליליטר ואחריו מיליליטר אחד של 1.079 גרם לתמיסת צפיפות מיליליטר.לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של אריתרוציטים מדולל חבילת לויקוציטים על ידי שפיכה על הקירות. צנטריפוגה ללא האצה או האטה כדי למנוע הפרעה לשיפוע. לשאוף את השלב המתאים גרנולוציטים ולהעביר צינור זכוכית סטרילי אחר 10 מיליליטר.לשטוף עם ארבעה מיליליטר של 1X DPBS ב 300 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. כדי להסיר את אריתרוציטים הנותרים, לטפל בתאים עם הלם אוסמוטי על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של 0.2% תמיסת מלח. דגירה במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה.יש להשליך את הסופר-נטנט ולהוסיף ארבעה מיליליטר של תמיסת מלח של 0.65%. דגירה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להחזיר את שלמות הממברנה ולחזור על הצנטריפוגה. הסר את הסופר-נאטנט והשעה מחדש את התאים בארבעה מיליליטר של 1X DPBS כדי להסיר פסולת תאית.שוב, צנטריפוגה להשעות מחדש את כדור התא בשני מיליליטר של חיץ HBSS קר. כדי לבצע בדיקת הרחקה כחולה טריפאן, יש לדלל חמישה מיקרוליטרים של תרחיף התא ב-20 מיקרוליטרים של 0.4% טריפאן כחול. ספרו את התאים בתא קשת חדש וקבעו את כדאיות התאים באמצעות מבחן אי-הכללה.לאחר מכן, הרכיבו 5 מיקרוליטרים של מתלה התא על מגלשה והכתימו בכתם של רייט למשך 15 שניות. מיד לתקן את הדגימה, לשטוף עם מים מזוקקים, ולבחון את המורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אופטי. לאחר מכן, הוסיפו פעם אחת 10 לתאים החמישיים כדי להזרים צינורות ציטומטריה ולהכתים במיקרוליטר אחד של 7AAD ב-100 מיקרוליטרים של חיץ FACS למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך.יש לשטוף עם 500 מיקרוליטר של מאגר FACS במשקל 300 גרם למשך 10 דקות. לתקן את התאים עם 500 microliters של 2% paraformaldehyde ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס עד ניתוח ציטומטריה זרימה. לבקרת תאים מתים, לתקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות ולשטוף עם 500 microliters של 1XPBS ב 300 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את הסופר-נטנט והוסיפו 200 מיקרוליטרים של 0.1% טריטון X-100. דגירה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף עם 500 מיקרוליטר של 1X PBS ולהכתים עם 7AAD.נתח את הנתונים שנלכדו בתוכנת ציטומטר הזרימה. טען את הקבצים ולחץ פעמיים על קובץ הנויטרופילים הלא מוכתם. בחר פיזור קדימה או FSC על ציר X ופיזור צדדי או SSC על ציר Y כדי להציג את אוכלוסיית התאים המתאימה לנויטרופילים.לאחר מכן בחר את הערוץ B3-A:PerCP vio 700-A על ציר X כדי לבטל את ההגבלה האוטומטית של התאים ובחר היסטוגרמה על ציר Y. לאחר מכן, פתח את קובץ הנויטרופילים המוכתם. בחר FSC על ציר X ו- SSC על ציר Y כדי להציג את אוכלוסיית התאים המתאימים לנויטרופילים.שוב, בחר את הערוץ B3-A:PerCP vio 700-A כדי לתחום את אוכלוסיית הנויטרופילים החיוביים לצבע 7AAD. צור את ההיסטוגרמה הסופית על ידי לחיצה ימנית על החלון ובחירת העתק לעורך הפריסה. הוסף פסאודוהיפאה חיידקית או פטרייתית בצינורות מיקרו של 1.5 מיליליטר.הוסף 200 מיקרוליטרים, כך שחמישה מיקרומולרים CFSC ב-PBS אחד. מערבבים ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בחושך. עצור את התגובה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של פלזמה וצנטריפוגה.השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הכדור במיליליטר אחד של 1XPBS עם צנטריפוגה. לאחר מכן להשעות מחדש את המיקרואורגניזמים ב 250 מיקרוליטר של 1X PBS. הכינו 50 מיקרוליטר אליקוטים במיקרו-צינוריות של 1.5 מיליליטר עם פעמיים 10 לחיידק השביעי או פעמיים 10 לפסאודוהיפאה החמישית להשראת NET.מניחים 10 על 10 מילימטרים כיסוי זכוכית סטרילי מחליק בלוח של 24 בארות. מכסים עם 10 מיקרוליטרים של 0.001% פולי l-ליזין במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים עם 100 מיקרוליטר של 1X PBS. יש לייבש באוויר ולהקרין אור UV למשך 15 דקות.לאחר מכן, החלף את תמיסת HBSS של מתלה הנויטרופילים שהוכן קודם לכן במדיום RPMI 1640 בתוספת פלזמה אוטולוגית עם 10% חום. הוסף 350 מיקרוליטרים של תרחיף תא זה לצלחת 24 באר לריכוז סופי של פעמיים 10 לנויטרופילים החמישי לכל באר. דגירה של הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית הבארות.כדי לגרום להיווצרות נטו, הוסיפו את גירויי החיידקים MOI100 ופסאודוהיפאה ב-MOI1. כמו כן להוסיף את הגירויים הביוכימיים ולהכין שליטה ללא גירוי על ידי הוספת 50 microliters של HBSS. להשיג נפח סופי של 400 מיקרוליטר לכל באר ולערבב על שייקר צלחת ב 140 סל"ד במשך 30 שניות.לאחר מכן דגירה במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר אינדוקציה נטו, הסר את supernatant מן הבארות על ידי pipetting בזהירות לתקן את התאים עם 300 microliters של 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות. לשטוף את התאים עם 200 microliters של 1X PBS ללא צנטריפוגה ולהוסיף 200 microliters של חיץ חוסם במשך 30 דקות.עבור כתם LL37, יש לחדור לתאים עם 200 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100 ב-1X PBS למשך 10 דקות ולשטוף עם 1X PBS פעמיים. הרכב את תלושי הכיסוי על מגלשות זכוכית. הדנ"א מכתים את התאים בשני מיקרוליטרים של DAPI ומאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית.השלבים התאיים הדינמיים הודגמו לאחר טיהור הדרגתי בצפיפות כפולה. המורפולוגיה הנויטרופילית הטיפוסית אושרה על ידי צביעה נכונה. התאים גם הראו כדאיות אופטימלית שנצפתה על ידי הרחקה כחולה טריפאן ללא הפרעה לממברנה.ניתוח של SSC לעומת FSC על ידי ציטומטריה של זרימה אישר אוכלוסייה המתאימה ל- PMN עם טוהר תאים גבוה. נקודות PMN עבור תאים לא מוכתמים לעומת תאי כתם 7AAD וההיסטוגרמות שלהם בהתאמה הצביעו על כדאיות גבוהה של תאים בנויטרופילים שבודדו זה עתה בהשוואה לתאי הביקורת המחלחלים. לאחר גירוי הנויטרופילים באמצעות ממריצים כימיים ומיקרוביאליים, NETs הודגמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית באמצעות DNA DPI ואנטי-LL37.המיקרואורגניזמים הוכתמו מראש ב-CFSE. היווצרות רשת אובדנית הנגרמת על ידי PMA המצוינת על ידי לוקליזציה משותפת עם LL37. ואילו NETs שנוצרו עם HOCI הראו פיזור דנ"א מינורי בחלל החוץ-תאי שהתאים להיווצרות NET חיונית.NET המושרה על ידי פסאודוהיפאה פטרייתית הראתה ריכוזים נמוכים של דנ"א ששוחררו לחלל החוץ-תאי עם מבנים נימה האופייניים להיווצרות NET חיונית. S.aureus הראה היווצרות NET חיונית ואילו P.aeruginosa גרם לשחרור של ריכוזים גדולים של דנ"א עם מורפולוגיה עכורה שהתמקמה עם LL37 המצביעה על היווצרות NET התאבדותית. ביצוע מתודולוגיית שיפוע צפיפות כפולה מאפשר לנו להשיג טוהר גבוה וכדאיות של נויטרופילים.ואנחנו מרימים את השטיפות, אנחנו נמנעים מפגיעה במבנה שלהן. בעקבות שיטה זו אנו יכולים לנתח את ההשפעה של חומרים או תאים בייצור NET, כמו גם אם הם מעורבים במנגנון כלשהו או בשימוש בהם כטיפולים במחלות אוטואימוניות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

פשוטה מלכודות תאיות נויטרופילים אדם בידוד (רשתות) וטיפול

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

זיהוי של המלכודות נויטרופילים מסחטות ב פרפין-מוטבע בעורקים בעורק החתולים באמצעות מיקרוסקופ אימונולומוטורנציה

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...