Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da una borsa di studio scientifica di base (# 285480) da CONACyT e dal Dipartimento di ricerca immunologica clinica della Facoltà di Scienze Biochimiche, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L e W.J.R.R. hanno borse di dottorato dei numeri CONACyT #799779, #660793 e #827788, rispettivamente.

I campioni di sangue sono stati ottenuti come donazioni da partecipanti clinicamente sani dopo il consenso informato. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con il permesso del Comitato Etico di Ricerca Umana della Facoltà di Scienze Biochimiche, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' di Oaxaca.
NOTA: I criteri di inclusione nello studio erano sesso ed età indistinti e clinicamente sani in base alle risposte dei partecipanti a un questionario prima di prelevare un campione di sangue. È s...

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	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. 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D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Una popolazione altamente pura di neutrofili vitali deve essere ottenuta per indurre il rilascio di NET poiché queste cellule hanno una durata ex vivo limitata di 8 ore in media, un periodo entro il quale devono essere eseguiti tutti gli esperimenti. A tal fine, la metodologia ideale è il gradiente a doppia densità per ottimizzare il tempo di purificazione isolando cellule non attivate più sensibili alla stimolazione esogena, in contrasto con le tecniche di sedimentazione del gradiente di Ficoll-Histopaque o...

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel flusso sanguigno, svolgendo un ruolo essenziale durante la clearance degli agenti patogeni attraverso diversi meccanismi, tra cui il rilascio di grandi strutture cromatiniche composte da DNA e diverse proteine antibatteriche nucleari, citoplasmatiche e granulari 1,2. L'antecedente diretto che descrive questo ruolo antimicrobico dei neutrofili è stato fatto da Takei et al.3 nel 1996. Questi autori hanno riportato una nuova forma di morte diversa dall'apoptosi e dalla necroptosi nei neutrofili, hanno mostrato cambiamenti morfologici che mostrano rottura nucleare, seguita da fuoriuscita dal nucleoplasma nel citoplasma e un aumento della permeabilità della membrana da 3 ore di incubazione con forbolo miristato acetato (PMA)2,3. Tuttavia, non è stato fino al 2004 che è stato utilizzato il termine "trappole extracellulari di neutrofili (NET)"4.
La formazione di NET è stata osservata in varie condizioni, come infezioni batteriche, fungine5, virali6 e parassitarie, per neutralizzare, uccidere e prevenire la diffusione microbica7. Altri studi dimostrano che può verificarsi anche in condizioni non patogene da stimoli sterili, come citochine, acido urico monosodico o cristalli di colesterolo, autoanticorpi, immunocomplessi e piastrine attivate7. Il lipopolisaccaride (LPS), l'interleuchina-8 (IL-8) e la PMA sono stati tra i primi stimoli in vitro descritti come induttori NET e il coinvolgimento in vivo del NET nei processi patogeni è stato dimostrato in due modelli di infiammazione acuta: dissenteria sperimentale e appendicite umana spontanea4. Il DNA è un componente essenziale di NET. La sua struttura e composizione appropriate sono necessarie per il sequestro e l'uccisione dei microrganismi fornendo un'alta concentrazione locale di molecole antimicrobiche verso i microbi catturati, come dimostrato da un breve trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) che disintegra i NET e le loro proprietà microbicide4. Oltre al DNA, i NET comprendono proteine attaccate come istoni, elastasi neutrofila (NE), catepsina G (CG), proteinasi 3, lattoferrina, gelatinasi, mieloperossidasi (MPO) e peptidi antimicrobici (AMP) come il peptide pro-infiammatorio cationico catelicidina LL-37 tra gli altri 8,9. Tali aggregati possono formare fili più grandi con diametri fino a 50 nm. Questi fattori possono interrompere i fattori di virulenza microbica o l'integrità della membrana cellulare patogena; inoltre, gli AMP possono stabilizzare il DNA derivato dal NET contro la degradazione da parte delle nucleasi batteriche10.
I meccanismi specifici che regolano la formazione di NET non sono ancora stati completamente chiariti. La via meglio caratterizzata che porta al rilascio di NET è attraverso la segnalazione ERK, che porta all'attivazione della NADPH ossidasi e alla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), nonché all'aumento del calcio intracellulare che innesca l'attivazione della via MPO. Questo a sua volta trasforma il perossido di idrogeno in acido ipocloroso, attivando NE per ossidazione11,12. NE è responsabile della degradazione dei filamenti di actina del citoscheletro per bloccare la fagocitosi e della loro traslocazione al nucleo per l'elaborazione mediante scissione proteolitica e deaminazione da parte di PAD4 che guidano la desensibilizzazione delle fibre di cromatina, che si associano a proteine granulari e citoplasmatiche, e vengono quindi rilasciate extracellulare7. Queste proteasi includono quelle rilasciate dal complesso degli azurosomi dei granuli azurofili e altre proteasi come la catepsina G13.
A seconda dei cambiamenti morfologici nei neutrofili, i NET sono classificati in due tipi: formazione di NET suicidaria o litica che porta alla morte cellulare4 e formazione di NET vitale o non litica prodotta da cellule vitali mediate da un rilascio vescicolare di DNA nucleare o mitocondriale, con un residuo di un citoplasto anucleato con capacità fagocitaria14,15. Generalmente, i NET composti da DNA mitocondriale presentano una morfologia allungata della fibra14, mentre quelli strutturati di DNA nucleare hanno un aspetto simile a una nuvola3. Tuttavia, non è noto come il neutrofilo scelga la sua origine del DNA. Contrariamente a studi precedenti che descrivevano i percorsi canonici dei NET come se richiedessero diverse ore, il percorso vitale viene rapidamente attivato in soli 5-60 minutie 15.
Nonostante questi progressi, la composizione NET varia a seconda dello stimolo; ad esempio, diversi ceppi mucoidi e non mucoidi di P. aeruginosa inducono la formazione di NET contenenti 33 proteine comuni e fino a 50 proteine variabili7. Pertanto, è necessario omogeneizzare le tecniche che consentono la generazione di conclusioni oggettive nei gruppi di ricerca. Questo articolo descrive un protocollo con varie tecniche che consentono il confronto e la valutazione della composizione, della struttura e della morfologia dei NET indotti con diversi microrganismi: Staphylococcus aureus (batterio gram-positivo), Pseudomonas aeruginosa (batterio gram-negativo) e Candida albicans (fungo), nonché stimoli chimici (PMA, HOCl) in neutrofili umani da individui sani. I risultati rappresentativi dimostrano l'eterogeneità dei NET a seconda del loro stimolo inducente in condizioni comparabili in vitro, caratterizzate da colorazione DNA-DAPI, immunocolorazione per LL37 e quantificazione dell'attività enzimatica (NE, CG e MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

I neutrofili funzionano come la prima linea di difesa cellulare in una risposta immunitaria innata impiegando diversi meccanismi, come la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET). Questo studio analizza i cambiamenti morfologici e composizionali nei NET indotti da stimoli microbici e chimici utilizzando metodologie standardizzate in vitro per l'induzione e la caratterizzazione del NET con cellule umane. Le procedure qui descritte consentono l'analisi della morfologia NET (litica o non litica) e della composizione (strutture DNA-proteina e attività enzimatica), e l'effetto di fattori solubili o di contatto cellulare su tali caratteristiche. Inoltre, le tecniche qui descritte potrebbero essere modificate per valutare l'effetto di fattori solubili esogeni o del contatto cellulare sulla composizione NET.
Le tecniche applicate includono la purificazione di cellule polimorfonucleate dal sangue periferico umano utilizzando un gradiente a doppia densità (1,079-1,098 g/ml), garantendo purezza e vitalità ottimali (≥ 95%) come dimostrato dalla colorazione di Wright, dall'esclusione del blu di tripano e dalla citometria a flusso, compresa l'analisi FSC versus SSC e la colorazione 7AAD. La formazione di NET è indotta da stimoli microbici (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e chimici (phorbol myristate acetate, HOCl) e i NET sono caratterizzati da colorazione DNA-DAPI, immunocolorazione per il peptide antimicrobico catelicidina (LL37) e quantificazione dell'attività enzimatica (elastasi neutrofila, catepsina G e mieloperossidasi). Le immagini vengono acquisite al microscopio a fluorescenza e analizzate con ImageJ.

Purezza e vitalità dei neutrofili Le fasi cellulari dinamiche sono visualizzate nel tubo dalla purificazione a gradiente a doppia densità. All'interno di questi strati, lo strato corrispondente ai granulociti è al di sopra dello strato di densità di 1,079 g/ml, distinto dalle fasi dei mononucleociti del sangue periferico (PBMC) e degli eritrociti (Figura 1A). La morfologia delle cellule purificate è stata verificata con la colorazione di Wright osservando cellule con...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Presentato qui è un protocollo per l'induzione e l'analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell'attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Questo protocollo dimostra l'eterogeneità nella composizione, struttura e morfologia delle trappole extracellulari dei neutrofili, a seconda del loro stimolo inducente in condizioni comparabili in vitro nei neutrofili umani di individui sani. Si ottengono un'elevata purezza e vitalità dei neutrofili. Ciò consente di confrontare la concentrazione di DNA, LL-37 e l'attività enzimatica della mieloperossidasi, dell'elastasi e della catepsina G, rilasciate dalle trappole extracellulari dei neutrofili.Questo protocollo ha permesso di analizzare l'effetto di fattori solubili o di contatto cellulare o possibili terapie o meccanismi di chiusura sulla produzione di NET nelle malattie autoimmuni. Questi metodi possono aiutare nello studio della malattia autoimmune. A causa della riproduzione cellulare incontrollata dei NET e della durata dell'allineamento dei loro componenti, che sono considerati biomarcatori della malattia.La microscopia a fluorescenza permette di catturare immagini di NET che mostrano la dispersione del DNA in associazione con proteine come LL37, che co-localizzato con microrganismi aiutando a capire come stanno apparendo. Per iniziare, eseguire la puntura della vena per raccogliere 10 millilitri di sangue periferico in provette contenenti EDTA dipotassico come anticoagulante. Quindi eseguire la biometria del sangue standard e il test della proteina C-reattiva per escludere infezioni o infiammazioni per garantire la qualità del campione.Centrifugare il campione di sangue periferico per rimuovere il plasma ricco di piastrine, seguito da una seconda centrifugazione e scartare il plasma rimanente. Diluire il pacchetto eritrocitario e leucocitario risultante in un rapporto di volume uno-a-uno con un DPBS 1X. Quindi, in un tubo di vetro sterile da 10 millilitri, depositare prima un millilitro di soluzione di densità da 1,08 grammi per millilitro seguito da un millilitro di soluzione di densità di 1,079 grammi per millilitro.Quindi, aggiungere quattro millilitri del pacchetto eritrocitario e leucocitario diluito versando sulle pareti. Centrifugare senza accelerazione o decelerazione per evitare di disturbare la pendenza. Aspirare la fase corrispondente ai granulociti e trasferire in un altro tubo di vetro sterile da 10 millilitri.Lavare con quattro millilitri di 1X DPBS a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Per rimuovere gli eritrociti rimanenti, trattare le cellule con shock osmotico aggiungendo quattro millilitri di soluzione salina allo 0,2%. Incubare per due minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare.Scartare il surnatante e aggiungere quattro millilitri di soluzione salina allo 0,65%. Incubare per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ripristinare l'integrità della membrana e ripetere la centrifugazione. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in quattro millilitri di 1X DPBS per rimuovere i detriti cellulari.Ancora una volta, centrifugare e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone HBSS freddo. Per eseguire un test di esclusione del blu tripano, diluire cinque microlitri della sospensione cellulare in 20 microlitri di blu tripano allo 0,4%. Contare le cellule in una nuova camera bower e determinare la vitalità cellulare utilizzando un test di esclusione.Quindi, montare 5 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino e colorare con la macchia di Wright per 15 secondi. Fissare immediatamente il campione, lavare con acqua distillata e osservare la morfologia al microscopio ottico. Quindi, aggiungere una volta 10 alle quinte cellule per far fluire i tubi di citometria e colorare con un microlitro di 7AAD in 100 microlitri di tampone FACS per 15 minuti a quattro gradi Celsius al buio.Lavare con 500 microlitri di tampone FACS a 300 G per 10 minuti. Fissare le cellule con 500 microlitri di paraformaldeide al 2% e conservare a quattro gradi Celsius fino all'analisi citometrica a flusso. Per un controllo delle cellule morte, fissare le cellule con 200 microlitri di paraformaldeide al 4% per 30 minuti e lavare con 500 microlitri di 1XPBS a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante e aggiungere 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,1%. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius. Lavare con 500 microlitri di 1X PBS e colorare con 7AAD.Analizza i dati acquisiti nel software del citometro a flusso. Carica i file e fai doppio clic sul file neutrofilo non macchiato. Scegliere forward scatter o FSC sull'asse X e dispersione laterale o SSC sull'asse Y per visualizzare la popolazione cellulare corrispondente ai neutrofili.Quindi selezionare il canale B3-A:PerCP vio 700-A sull'asse X per delimitare l'autofluorescenza delle celle e scegliere l'istogramma sull'asse Y. Quindi, aprire il file di neutrofili macchiati. Scegliere FSC sull'asse X e SSC sull'asse Y per visualizzare la popolazione cellulare corrispondente ai neutrofili.Anche in questo caso, selezionare il canale B3-A:PerCP vio 700-A per delimitare la popolazione di neutrofili positivi per il colorante 7AAD. Generare l'istogramma finale facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra e selezionando copia nell'editor di layout. Aggiungere pseudoife batteriche o fungine in micro tubi da 1,5 millilitri.Aggiungi 200 microlitri, quindi cinque CFSC micromolari in 1X PBS. Mescolare e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti al buio. Interrompere la reazione aggiungendo 500 microlitri di plasma decomplementato e centrifuga.Scartare il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di 1XPBS con centrifugazione. Quindi risospendere i microrganismi in 250 microlitri di 1X PBS. Preparare aliquote da 50 microlitri in microtubi da 1,5 millilitri con due volte 10 al settimo batterio o due volte 10 alla quinta pseudoife per l'induzione NET.Posizionare 10 per 10 millimetri di copertura sterile di vetro scivola in una piastra da 24 pozzetti. Coprire con 10 microlitri di l-lisina poli-0,001% per un'ora a temperatura ambiente e lavare due volte con 100 microlitri di 1X PBS. Asciugare all'aria e irradiare con luce UV per 15 minuti.Quindi, sostituire la soluzione HBSS della sospensione di neutrofili preparata in precedenza con mezzo RPMI 1640 integrato con plasma autologo decomplementato al 10% di calore. Aggiungere 350 microlitri di questa sospensione cellulare alla piastra a 24 pozzetti per una concentrazione finale di due volte 10 al quinto neutrofilo per pozzetto. Incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire alle cellule di aderire al fondo dei pozzetti.Per indurre la formazione di reti, aggiungere gli stimoli batterici MOI100 e le pseudoife a MOI1. Aggiungi anche gli stimoli biochimici e prepara un controllo senza stimolo aggiungendo 50 microlitri di HBSS. Ottenere un volume finale di 400 microlitri per pozzetto e mescolare su uno scuotitore a 140 RPM per 30 secondi.Quindi incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'induzione netta, rimuovere il surnatante dai pozzetti pipettando accuratamente e fissare le cellule con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Lavare le celle con 200 microlitri di 1X PBS senza centrifugare e aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti.Per la colorazione LL37, permeabilizzare le cellule con 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,2% in 1X PBS per 10 minuti e lavare con 1X PBS due volte. Montare le scivolate di copertura su vetrini. Colorare le cellule con due microlitri di DAPI e conservarle a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi mediante microscopia a fluorescenza confocale.Le fasi cellulari dinamiche sono state visualizzate dopo la purificazione del gradiente a doppia densità. La tipica morfologia dei neutrofili è stata confermata dalla giusta colorazione. Le cellule hanno anche mostrato una vitalità ottimale osservata dall'esclusione del blu di tripano senza interruzione della membrana.L'analisi di SSC versus FSC mediante citometria a flusso ha confermato una popolazione corrispondente a PMN con elevata purezza cellulare. I dot plot PMN per le cellule non colorate rispetto alle cellule colorate 7AAD e i loro rispettivi istogrammi hanno indicato un'elevata vitalità cellulare nei neutrofili appena isolati rispetto alle cellule di controllo permeabilizzate. Dopo aver stimolato i neutrofili con stimolanti chimici e microbici, i NET sono stati visualizzati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando DPI del DNA e anti-LL37.I microrganismi sono stati pre-colorati con CFSE. Formazione di rete suicidaria indotta da PMA indicata dalla co-localizzazione con LL37. Mentre i NET formati con HOCI hanno mostrato una minore dispersione del DNA nello spazio extracellulare che corrispondeva alla formazione di NET vitale.NET indotta da pseudoife fungine ha mostrato basse concentrazioni di DNA rilasciato nello spazio extracellulare con strutture filamentose caratteristiche della formazione vitale di NET. S.aureus ha mostrato la formazione di NET vitale mentre P.aeruginosa ha indotto il rilascio di grandi concentrazioni di DNA con una morfologia torbida che si è co-localizzata con LL37 indicando la formazione di NET suicida. L'esecuzione della metodologia del doppio gradiente di densità ci consente di ottenere un'elevata purezza e vitalità dei neutrofili.E eleviamo i lavaggi, evitiamo di danneggiarne la struttura. Seguendo questo metodo possiamo analizzare l'effetto di sostanze o cellule nella produzione di NET e se sono coinvolte in qualche meccanismo o il loro uso come terapie nelle malattie autoimmuni.

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