Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
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この研究は、CONACyTからの基礎科学助成金(#285480)と、オアハカ自治大学生化学学部の臨床免疫学研究部門によってサポートされました。A.A.A、S.A.S.L、W.J.R.R.は、それぞれCONACyT番号#799779、#660793、#827788の博士号を取得しています。

血液サンプルは、インフォームドコンセントの後、臨床的に健康な参加者からの寄付として取得されました。すべての実験は、オアハカのベニート・フアレス大学生化学科学部の人間研究倫理委員会の許可を得て実施されました。
注:研究の選択基準は、性別と年齢が不明瞭であり、血液サンプルを採取する前の質問票への参加者の回答によると臨床的に健康でした。血?...

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	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

NETの放出を誘導するには、これらの細胞の 生体外 寿命が平均8時間に制限されているため、生存可能な好中球の高純度集団を取得する必要があり、その期間内にすべての実験を実行する必要があります。この目的のために、理想的な方法論は、Ficoll-Histopaque勾配またはデキストラン沈降技術とは対照的に、外因性刺激に対してより応答性の高い非活性化細胞を単離することによって精?...

好中球は血流中に最も豊富な白血球であり、DNAといくつかの核、細胞質、および粒状の抗菌タンパク質で構成される大きなクロマチン構造の放出を含む、いくつかのメカニズムによる病原体の除去中に重要な役割を果たします1,2。好中球のこの抗菌的役割を記述する直接の前例は、1996年に武井らによってなされた3。これらの著者らは、好中球のアポトーシスおよびネクロトーシスとは異なる新しい形態の死を報告し、核破裂を示す形態学的変化を示し、その後、核質から細胞質にこぼれ、ホルボールミリスチン酸酢酸塩(PMA)との3時間のインキュベーションから膜透過性の増加を示しました2,3。しかし、「好中球細胞外トラップ(NET)」という用語が使用されたのは2004年のことでした4。
NET形成は、細菌、真菌5、ウイルス6、寄生虫感染などのさまざまな条件で観察されており、微生物の拡散を中和、死滅、および防止します7。他の研究は、サイトカイン、尿酸一ナトリウムまたはコレステロール結晶、自己抗体、免疫複合体、および活性化血小板などの滅菌刺激によって非病原性状態でも起こり得ることを示している7。リポ多糖(LPS)、インターロイキン-8(IL-8)、およびPMAは、NET誘導物質として記載された最初のin vitro刺激の1つであり、病原性プロセスへのin vivoNETの関与は、急性炎症の2つのモデル、実験的赤痢と自然発生性ヒト虫垂炎で実証されました4。DNAは不可欠なNETコンポーネントです。NETとその殺菌特性を分解する短時間のデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)処理によって実証されるように、その適切な構造と組成は、捕獲された微生物に向かって高濃度の抗菌分子を送達することにより、微生物の隔離と死滅に必要です4。DNAに加えて、NETは、ヒストン、好中球エラスターゼ(NE)、カテプシンG(CG)、プロテイナーゼ3、ラクトフェリン、ゼラチナーゼ、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、およびカチオン性炎症誘発ペプチドカテリシジンLL-37などの抗菌ペプチド(AMP)などの付着タンパク質を含む8,9。そのような凝集体は、最大50nmの直径を有するより大きな糸を形成し得る。これらの要因は、微生物の病原性因子または病原体細胞膜の完全性を破壊する可能性があります。さらに、AMPは、細菌ヌクレアーゼによる分解に対してNET由来のDNAを安定化させることができる10。
NET形成を制御する具体的なメカニズムはまだ完全には解明されていません。NET放出につながる最も特徴のある経路は、NADPHオキシダーゼの活性化と活性酸素種(ROS)産生につながるERKシグナル伝達、およびMPO経路の活性化を引き起こす細胞内カルシウムの増加によるものです。これにより、過酸化水素が次亜塩素酸に変換され、酸化によってNEが活性化されます11,12。NEは、細胞骨格のアクチンフィラメントを分解して食作用をブロックし、それらを核に移動して、顆粒および細胞質タンパク質と会合し、細胞外に放出されるクロマチン線維の脱感作を促進するPAD4によるタンパク質分解切断および脱アミノ化による処理を行います7。これらのプロテアーゼとしては、アズロフィル顆粒のアズロソーム複合体やカテプシンG13などの他のプロテアーゼから放出されるものが挙げられる。
好中球の形態学的変化に応じて、NETは2つのタイプに分類されます:細胞死につながる自殺または溶解性のNET形成4、および貪食能力を備えた核細胞またはミトコンドリアDNAの小胞放出によって媒介される生存細胞によって生成されるバイタルまたは非溶解性のNET形成14,15。一般に、ミトコンドリアDNAからなるNETは細長い繊維14形態を示し、一方核DNAから構成されたものは雲のような外観3を有する。しかしながら、好中球がそのDNA起源をどのように選択するかは知られていない。NETの標準的な経路が数時間かかると説明していた以前の研究とは対照的に、バイタル経路はわずか5〜60分で急速に活性化されます15。
これらの進歩にもかかわらず、NET組成は刺激によって異なります。例えば、緑膿菌の異なるムコイド株および非ムコイド株は、33個の共通タンパク質および最大50個の可変タンパク質を含むNETの形成を誘導する7。したがって、研究グループで客観的な結論を生み出すことを可能にする技術を均質化する必要があります。本稿では、黄色ブドウ球菌(グラム陽性菌)、緑膿菌(グラム陰性菌)、カンジダ・アルビカンス(真菌)、および健常人のヒト好中球の化学刺激(PMA、HOCl)など、さまざまな微生物で誘導されたNETの組成、構造、形態を比較および評価できるさまざまな手法によるプロトコルについて説明します。代表的な結果は、DNA-DAPI染色、LL37の免疫染色、および酵素活性(NE、CG、およびMPO)の定量を特徴とする、同等のin vitro条件下での誘導刺激に依存するNETの不均一性を示しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

好中球は、好中球細胞外トラップ(NET)の形成など、さまざまなメカニズムを採用することにより、自然免疫応答における細胞防御の第一線として機能します。この研究では、ヒト細胞でのNET誘導と特性評価のための標準化された in vitro 方法論を使用して、微生物および化学的刺激によって誘発されるNETの形態学的および組成的変化を分析します。ここで説明する手順により、NET形態(溶解性または非溶解性)および組成(DNA-タンパク質構造および酵素活性)、およびそのような特性に対する可溶性因子または細胞接触の影響の分析が可能になります。さらに、ここで説明する手法を変更して、NET組成に対する外因性可溶性因子または細胞接触の影響を評価することができます。
適用される技術には、二重密度勾配(1.079-1.098 g / mL)を使用したヒト末梢血からの多形核細胞の精製が含まれ、ライト染色、トリパンブルー排除、およびフローサイトメトリー(FSC対SSC分析および7AAD染色を含む)によって実証されるように、最適な純度と生存率(≥95%)を保証します。NET形成は微生物(緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カン ジダ・アルビカンス)および化学的刺激(ホルボールミリスチン酸酢酸塩、HOCl)刺激によって誘導され、NETはDNA-DAPI染色、抗菌ペプチドカテリシジン(LL37)の免疫染色、および酵素活性の定量(好中球エラスターゼ、カテプシンG、およびミエロペルオキシダーゼ)によって特徴付けられます。画像は蛍光顕微鏡で取得され、ImageJで分析されます。

好中球の純度と生存率 動的な細胞相は、倍密度勾配精製からチューブ内で視覚化されます。これらの層の中で、顆粒球に対応する層は1.079 g/mL密度層の上にあり、末梢血単核球(PBMC)および赤血球の相とは区別されます(図1A)。精製された細胞の形態は、成熟好中球に対応する糸状のフィラメントで接続されたセグメント化された核を持つ細胞を観察するこ?...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

ここに提示されるのは、 in vitro 好中球細胞外トラップ(NET)の誘導と分析のためのプロトコルです。DNA、カテリシジン(LL37)、および酵素活性の定量により、同様の制御条件下で微生物および化学刺激によって誘導されるNETの組成および形態の変動性を示すデータが得られました。

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

このプロトコルは、好中球細胞外トラップの組成、構造、および形態の不均一性を、健康な個体からのヒト好中球における同等のin vitro条件下での誘導刺激に応じて実証します。高い好中球純度および生存率が得られる。これにより、好中球細胞外トラップによって放出されるDNA、LL-37、およびミエロペルオキシダーゼ、エラスターゼ、およびカテプシンGの酵素活性の濃度を比較することができます。このプロトコルは、自己免疫疾患におけるNETの産生に対する可溶性因子または細胞接触または可能な治療法または閉鎖メカニズムの効果を分析することを可能にした。これらの方法は、自己免疫疾患の調査に役立ちます。NETの制御されていない細胞再生およびそれらの成分の整列期間のために、これらは疾患のバイオマーカーと考えられている。蛍光顕微鏡は、微生物と共局在するLL37などのタンパク質と結合したDNAの分散を示すNETの画像をキャプチャし、それらがどのように出現しているかを理解するのに役立ちます。まず、静脈穿刺を行い、抗凝固剤として二カリウムEDTAを含むチューブに10ミリリットルの末梢血を採取します。次に、標準的な血液バイオメトリーとC反応性タンパク質検査を実行して、感染や炎症を除外し、サンプルの品質を確保します。末梢血サンプルを遠心分離して多血小板血漿を除去し、続いて2回目の遠心分離を行い、残りの血漿を廃棄する。得られた赤血球と白血球のパッケージを1つの1X DPBSで1対1の体積比で希釈します。次いで、滅菌10ミリリットルのガラス管中に、最初に1ミリリットルの1ミリリットルの1.08グラムの密度溶液を堆積させ、続いて1ミリリットルの1ミリリットルの1.079グラムの密度溶液を堆積させる。次に、壁に注ぐことによって、4ミリリットルの希釈赤血球と白血球のパッケージを追加します。勾配を乱さないように、加速または減速せずに遠心分離します。顆粒球に対応する相を吸引し、別の滅菌10ミリリットルガラス管に移します。4ミリリットルの1X DPBSで300Gで摂氏4度で10分間洗浄し、上清を廃棄します。残りの赤血球を除去するには、4ミリリットルの0.2%生理食塩水を加えて細胞を浸透圧ショックで処理します。摂氏4度で2分間インキュベートし、遠心分離します。上清を廃棄し、4ミリリットルの0.65%食塩水を加える。摂氏4度で5分間インキュベートして膜の完全性を回復し、遠心分離を繰り返します。上清を除去し、細胞を4ミリリットルの1X DPBSに再懸濁して、細胞の破片を除去します。再度、遠心分離し、細胞ペレットを2ミリリットルの冷たいHBSSバッファーに再懸濁する。トリパンブルー排除試験を実施するには、5マイクロリットルの細胞懸濁液を20マイクロリットルの0.4%トリパンブルーで希釈します。新しいバウアーチャンバー内の細胞をカウントし、除外テストを使用して細胞の生存率を決定します。次に、5マイクロリットルの細胞懸濁液をスライドにマウントし、ライト染色剤で15秒間染色します。直ちに試料を固定し、蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡で形態を観察します。次に、フローサイトメトリーチューブに5番目の細胞に10回10を加え、100マイクロリットルのFACSバッファーに1マイクロリットルの7AADで摂氏4度の暗所で15分間染色します。500マイクロリットルのFACSバッファーで300 Gで10分間洗浄します。細胞を500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー分析まで摂氏4度で保存します。死細胞コントロールのために、細胞を200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、500マイクロリットルの1XPBSで300Gで摂氏4度で10分間洗浄します。上清を廃棄し、200マイクロリットルの0.1%Triton X-100を追加します。摂氏4度で1時間インキュベートします。500マイクロリットルの1X PBSで洗浄し、7AADで染色します。キャプチャしたデータをフローサイトメーターソフトウェアで解析します。ファイルをロードし、染色されていない好中球ファイルをダブルクリックします。X軸に前方散乱またはFSC、Y軸に側方散乱またはSSCを選択して、好中球に対応する細胞集団を表示します。次に、X軸でチャンネルB3-A:PerCP vio 700-Aを選択して細胞の自家蛍光を絞り出し、Y軸でヒストグラムを選択します。次に、染色した好中球ファイルを開きます。X軸にFSC、Y軸にSSCを選択して、好中球に対応する細胞集団を表示します。ここでも、チャネルB3-A:PerCP vio 700-Aを選択して、色素7AAD陽性の好中球の集団を区切る。最終的なヒストグラムを生成するには、ウィンドウを右クリックし、[レイアウト エディターにコピー] を選択します。1.5ミリリットルのマイクロチューブに細菌性または真菌性の偽菌糸を加えます。200マイクロリットルを追加するので、1X PBSに5マイクロモルのCFSCを追加します。暗所で10分間摂氏37度で混合してインキュベートします。500マイクロリットルの脱補血漿と遠心分離機を加えて反応を停止します。上清を捨て、遠心分離しながら1ミリリットルの1XPBSでペレットを洗浄する。次に、微生物を250マイクロリットルの1X PBSに再懸濁します。NET誘導のために、10〜7番目の細菌の2倍または10〜5番目の偽菌糸を含む1.5ミリリットルのマイクロチューブに50マイクロリットルのアリコートを準備します。10 x 10ミリメートルの滅菌ガラスカバースリップを24ウェルプレートに入れます。10マイクロリットルの0.001%ポリl-リジンで室温で1時間覆い、100マイクロリットルの1X PBSで2回洗浄します。風乾し、UV光を15分間照射します。次に、先に調製した好中球懸濁液のHBSS溶液を、10%熱脱離した自家血漿を添加したRPMI 1640培地に交換する。この細胞懸濁液を350マイクロリットルを24ウェルプレートに加え、ウェルあたり10〜5番目の好中球の2倍の最終濃度にします。プレートを摂氏37度で20分間、5%二酸化炭素でインキュベートして、細胞がウェルの底に付着できるようにします。網形成を誘導するには、細菌刺激MOI100と偽菌糸をMOI1に追加します。また、生化学的刺激を加え、50マイクロリットルのHBSSを加えることによって刺激のない対照を調製する。ウェルあたり400マイクロリットルの最終容量を取得し、プレートシェーカーで140 RPMで30秒間混合します。その後、摂氏37度と5%二酸化炭素で4時間インキュベートします。ネット誘導後、慎重にピペッティングしてウェルから上清を取り除き、細胞を300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで30分間固定します。遠心分離せずに200マイクロリットルの1X PBSで細胞を洗浄し、200マイクロリットルのブロッキングバッファーを30分間加えます。LL37染色剤の場合、細胞を1X PBS中の0.2%Triton X-100の200マイクロリットルで10分間透過処理し、1X PBSで2回洗浄します。カバースリップをスライドガラスに取り付けます。DNAは2マイクロリットルのDAPIで細胞を染色し、共焦点蛍光顕微鏡による分析まで摂氏マイナス20度で保存します。動的細胞相は、二重密度勾配精製後に視覚化されました。典型的な好中球形態は右染色により確認した。細胞はまた、膜破壊なしにトリパンブルー排除によって観察された最適な生存率を示した。フローサイトメトリーによるSSC対FSCの分析により、高い細胞純度でPMNに対応する集団が確認されました。非染色細胞対7AAD染色細胞のPMNドットプロットおよびそれぞれのヒストグラムは、透過処理されたコントロール細胞と比較して、新たに単離された好中球において高い細胞生存率を示した。好中球を化学的および微生物刺激剤で刺激した後、DNA DPIおよび抗LL37を用いた蛍光顕微鏡法によってNETを可視化した。微生物をCFSEで予め染色した。PMA誘発性自殺ネット形成は、LL37との共局在によって示されます。一方、HOCIで形成されたNETは、細胞外空間にわずかなDNA分散を示し、これは重要なNET形成に対応していました。真菌偽菌糸によって誘導されたNETは、重要なNET形成に特徴的な糸状構造を有する細胞外空間に放出された低濃度のDNAを示した。黄色ブドウ球菌は重要なNET形成を示したが、緑膿菌はLL37と共局在する濁った形態で高濃度のDNAの放出を誘導し、自殺NET形成を示した。二重密度勾配法を行うことで、好中球の高純度と生存率を得ることができます。そして私達は洗剤を高くします、私達はそれらの構造を傷つけません。この方法に従って、NET産生における物質または細胞の影響、およびそれらが何らかのメカニズムに関与しているかどうか、または自己免疫疾患の治療法としての使用を分析することができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...