Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

이 연구는 CONACyT의 기초 과학 보조금 (# 285480)과 오악 사카 대학교 생화학 과학 학부의 임상 면역학 연구과, Universidad Autónoma 'Benito Juárez'de Oaxaca의 지원을 받았습니다. A.A.A, S.A.S.L 및 W.J.R.R.은 각각 CONACyT 번호 #799779, #660793 및 #827788의 박사 펠로우십을 보유하고 있습니다.

혈액 샘플은 정보에 입각 한 동의 후 임상 적으로 건강한 참가자로부터 기증으로 획득되었습니다. 모든 실험은 오악 사카의 Universidad Autónoma 'Benito Juárez'생화학 학부의 인간 연구 윤리위원회의 허가를 받아 수행되었습니다.
참고: 연구의 포함 기준은 성별과 연령이 불분명했으며 혈액 샘플을 채취하기 전에 설문지에 대한 참가자 응답에 따라 임상적으로 건강했습니다. 세포 ?...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. 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D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

NET의 방출을 유도하기 위해서는 매우 순수한 생존 가능한 호중구 집단을 얻어야 하는데, 이는 이러한 세포가 모든 실험을 수행해야 하는 기간인 평균 8시간의 제한된 생체외 수명을 갖기 때문입니다. 이를 위해, 이상적인 방법론은 Ficoll-Histopaque 구배 또는 덱스트란 침강 기술(17)과 대조적으로, 외인성 자극에 더 반응하는 비활성화된 세포를 단리함으로써 정제 시간을 최적...

호중구는 혈류에서 가장 풍부한 백혈구로, DNA와 여러 핵, 세포질 및 과립 항균 단백질로 구성된 큰 염색질 구조의 방출을 포함하여 여러 메커니즘에 의해 병원성 물질을 제거하는 동안 필수적인 역할을 합니다1,2. 호중구의 이러한 항균 역할을 설명하는 직접적인 선행은 1996 년 Takei et al.3에 의해 만들어졌습니다. 이 저자들은 호중구의 세포 사멸 및 괴사와는 다른 새로운 형태의 사망을보고했으며, 핵 파열을 나타내는 형태 학적 변화를 보인 후 핵질에서 세포질로 유출되고 포볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)로 배양 3 시간에서 막 투과성이 증가했다고보고했습니다.2,3. 그러나 2004 년이 되어서야 "호중구 세포 외 트랩 (NET)"이라는 용어가 사용되었습니다4.
NET 형성은 박테리아, 곰팡이5, 바이러스6 및 기생충 감염과 같은 다양한 조건에서 미생물 전파를 중화, 사멸 및 방지하기 위해관찰되었습니다7. 다른 연구에 따르면 사이토 카인, 요산 나트륨 또는 콜레스테롤 결정,자가 항체, 면역 복합체 및 활성화 된 혈소판과 같은 멸균 자극에 의해 비 병원성 조건에서도 발생할 수 있습니다7. 지질 다당류 (LPS), 인터루킨 -8 (IL-8) 및 PMA는 NET 유도제로 기술 된 최초의 시험관 내 자극 중 하나였으며, 병원성 과정에서의 생체 내 NET 관여는 급성 염증의 두 가지 모델에서 입증되었습니다 : 실험적 이질 및 자발적인 인간 맹장염4. DNA는 필수적인 NET 구성 요소입니다. NETs 및 그살균 특성을 분해하는 간단한 데옥시리보뉴클레아제(DNase) 처리에 의해 입증된 바와 같이, 포획된 미생물을 향해 높은 국소 농도의 항균 분자를 전달함으로써 미생물의 격리 및 사멸에 적절한 구조 및 조성이 필요합니다4. DNA 외에도 NET은 히스톤, 호중구 엘라스타제(NE), 카텝신 G(CG), 프로테이나제 3, 락토페린, 젤라티나제, 미엘로퍼옥시다제(MPO) 및 양이온성 전염증성 펩타이드 카텔리시딘 LL-37과 같은 항균 펩타이드(AMP)와 같은 부착 단백질로 구성됩니다. 이러한 응집체는 직경이 최대 50 nm 인 더 큰 나사를 형성 할 수 있습니다. 이러한 요인은 미생물 독성 인자 또는 병원체 세포막의 완전성을 파괴 할 수 있습니다. 추가적으로, AMP는 박테리아 뉴클레아제(10)에 의한 분해에 대해 NET-유래 DNA를 안정화시킬 수 있다.
NET 형성을 조절하는 특정 메커니즘은 아직 완전히 명확하지 않습니다. NET 방출로 이어지는 가장 잘 특성화된 경로는 NADPH 산화효소 활성화 및 활성 산소 종(ROS) 생성뿐만 아니라 MPO 경로의 활성화를 유발하는 세포 내 칼슘 증가로 이어지는 ERK 신호 전달을 통한 것입니다. 이것은 차례로 과산화수소를 차아염소산으로 변환하여 산화11,12에 의해 NE를 활성화시킵니다. NE는 세포 골격의 액틴 필라멘트를 분해하여 식균 작용을 차단하고 과립 및 세포질 단백질과 결합하는 염색질 섬유의 탈감작을 유도하는 PAD4에 의한 단백질 분해 절단 및 탈 아미노에 의한 처리를 위해 핵으로 전위시킨 다음 세포 외로 방출됩니다7. 이들 프로테아제는 아주로필 과립 및 다른 프로테아제, 예컨대 카텝신 G13의 아주로좀 복합체로부터 방출된 것을 포함한다.
호중구의 형태 학적 변화에 따라 NET은 세포 사멸을 유도하는 자살 또는 용해성 NET 형성4과 핵 또는 미토콘드리아 DNA의 소포 방출에 의해 매개되는 생존 세포에 의해 생성 된 필수 또는 비 용해성 NET 형성의 두 가지 유형으로 분류됩니다14,15. 일반적으로, 미토콘드리아 DNA로 구성된 NET은 길쭉한 섬유14 형태를 나타내는 반면, 핵 DNA로 구성된 NET은 구름과같은 외관3을 갖는다. 그러나 호중구가 DNA 기원을 선택하는 방법은 알려져 있지 않습니다. NET의 표준 경로가 몇 시간이 필요하다고 설명한 이전 연구와 달리 중요한 경로는 단 5-60분 만에 빠르게 활성화됩니다15.
이러한 발전에도 불구하고 NET 구성은 자극에 따라 다릅니다. 예를 들어, 녹농균의 상이한 점액질 및 비 점액 균주는 33 개의 공통 단백질과 최대 50 개의 가변 단백질7을 포함하는 NET의 형성을 유도합니다. 따라서 연구 그룹에서 객관적인 결론을 도출 할 수있는 기술을 균질화해야합니다. 이 논문은 황색포도상구균(그람 양성균), 녹농균(그람 음성 박테리아), 칸디다 알비칸스(곰팡이)와 같은 다양한 미생물로 유도된 NET의 구성, 구조 및 형태를 비교하고 평가할 수 있는 다양한 기술을 사용한 프로토콜과 건강한 개인의 인간 호중구에 대한 화학적 자극(PMA, HOCl)을 설명합니다. 대표적인 결과는 DNA-DAPI 염색, LL37에 대한 면역염색 및 효소 활성(NE, CG 및 MPO)의 정량화를 특징으로 하는 유사한 시험관 내 조건에서 유도 자극에 따라 NET의 이질성을 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

호중구는 호중구 세포 외 트랩 (NET) 형성과 같은 다양한 메커니즘을 사용하여 선천성 면역 반응에서 세포 방어의 첫 번째 라인으로 기능합니다. 이 연구는 인간 세포를 사용한 NET 유도 및 특성화를 위한 표준화된 시험관 내 방법론을 사용하여 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 형태학적 및 조성적 변화를 분석합니다. 여기에 설명된 절차를 통해 NET 형태(용균 또는 비용균) 및 조성(DNA-단백질 구조 및 효소 활성)을 분석하고 이러한 특성에 대한 가용성 인자 또는 세포 접촉의 영향을 분석할 수 있습니다. 부가적으로, 여기에 기술된 기술은 NET 조성물에 대한 외인성 가용성 인자 또는 세포 접촉의 효과를 평가하기 위해 변형될 수 있다.
응용 기술에는 이중 밀도 구배(1.079-1.098g/mL)를 사용하여 인간 말초 혈액에서 다형핵 세포를 정제하는 것이 포함되며, Wright의 염색, 트립판 블루 배제 및 FSC 대 SSC 분석 및 7AAD 염색을 포함한 유세포분석에서 입증된 최적의 순도와 생존력(≥ 95%)을 보장합니다. NET 형성은 미생물 (녹농균, 황색 포도상 구균 및 칸 디다 알비 칸스) 및 화학적 (포볼 미리 스테이트 아세테이트, HOCl) 자극으로 유도되며, NETs는 DNA-DAPI 염색, 항균 펩티드 카텔리시딘 (LL37)에 대한 면역 염색 및 효소 활성의 정량화 (호중구 엘라스타제, 카텝신 G 및 미엘로 퍼 옥시다제)를 특징으로합니다. 이미지는 형광 현미경을 통해 획득되고 ImageJ로 분석됩니다.

호중구의 순도와 생존력 동적 세포 단계는 이중 밀도 그래디언트 정제에서 튜브에서 시각화됩니다. 이 층 내에서 과립구에 해당하는 층은 말초 혈액 단핵구(PBMC) 및 적혈구의 위상과 구별되는 1.079g/mL 밀도 층 위에 있습니다(그림 1A). 정제된 세포의 형태는 성숙한 호중구에 해당하는 실 모양의 필라멘트로 연결된 분절된 핵을 가진 세포를 관찰함으로써 Wright의 ...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

이 프로토콜은 건강한 개체의 인간 호중구에서 유사한 시험관 내 조건 하에서 유도 자극에 따라 호중구 세포 외 트랩의 구성, 구조 및 형태의 이질성을 입증합니다. 높은 호중구 순도 및 생존력이 얻어진다. 이는 호중구 세포 외 트랩에 의해 방출되는 DNA, LL-37 및 myeloperoxidase, elastase 및 cathepsin G의 효소 활성을 비교할 수있게합니다.이 프로토콜은자가 면역 질환에서 NET의 생산에 대한 가용성 인자 또는 세포 접촉 또는 폐쇄를위한 가능한 치료법 또는 메커니즘의 효과를 분석 할 수있게했다. 이러한 방법은자가 면역 질환의 조사에 도움이 될 수 있습니다. NETs의 통제되지 않은 세포 재생산 및 질병의 바이오 마커로 간주되는 구성 요소의 정렬 기간으로 인해.형광 현미경을 사용하면 LL37과 같은 단백질과 관련하여 DNA의 분산을 보여주는 NET의 이미지를 캡처 할 수 있으며, 이는 미생물과 함께 국소화되어 어떻게 나타나는지 이해하는 데 도움이됩니다. 시작하려면 대정맥 천자를 수행하여 항응고제로 EDTA 디 칼륨이 들어있는 튜브에 말초 혈액 10 밀리리터를 수집하십시오. 그런 다음 표준 혈액 생체 측정 및 C 반응성 단백질 검사를 수행하여 감염이나 염증을 배제하여 샘플의 품질을 보장합니다.말초 혈액 샘플을 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장을 제거하고, 이어서 2차 원심분리하고 나머지 혈장을 버린다. 생성된 적혈구 및 백혈구 패키지를 하나의 1X DPBS로 일대일 부피비로 희석합니다. 그런 다음 멸균 된 10 밀리리터 유리관에 먼저 밀리리터 밀도 용액 1.08 밀리리터 1 밀리리터 후 밀도 용액 1.079 그램 1 밀리리터를 증착합니다.그런 다음 희석 된 적혈구 및 백혈구 패키지 4 밀리리터를 벽에 부어 넣으십시오. 기울기를 방해하지 않도록 가속 또는 감속없이 원심 분리기. 과립구에 해당하는 상을 흡인하고 다른 멸균 10 밀리리터 유리관으로 옮깁니다.섭씨 4도에서 10분 동안 300G의 1X DPBS 4밀리리터로 세척하고 상층액을 버립니다. 나머지 적혈구를 제거하려면 0.2 % 식염수 4 밀리리터를 추가하여 삼투압 쇼크로 세포를 치료하십시오. 섭씨 4도에서 2 분간 배양하고 원심 분리합니다.상청액을 버리고 0.65 % 식염수 용액 4 밀리리터를 첨가하십시오. 막 무결성을 복원하고 원심 분리를 반복하기 위해 섭씨 4도에서 5 분 동안 배양합니다. 상청액을 제거하고 세포를 4밀리리터의 1X DPBS에 재현탁하여 세포 파편을 제거합니다.다시, 원심분리하고 2밀리리터의 차가운 HBSS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 트리판 블루 배제 테스트를 수행하려면 5 마이크로리터의 세포 현탁액을 20 마이크로리터의 0.4% 트리판 블루로 희석합니다. 새로운 바우어 챔버에서 세포를 세고 배제 테스트를 사용하여 세포 생존율을 결정합니다.그런 다음 5 마이크로리터의 세포 현탁액을 슬라이드에 장착하고 15초 동안 Wright's 염색으로 염색합니다. 즉시 샘플을 고정하고 증류수로 씻은 다음 광학 현미경으로 형태를 관찰합니다. 다음으로, 5번째 세포를 유세포 분석기 튜브에 1회 10회 첨가하고 100 마이크로리터의 FACS 완충액에 1 마이크로리터의 7AAD로 염색하여 암실에서 섭씨 4도에서 15분 동안 염색한다.300G에서 500마이크로리터의 FACS 완충액으로 10분 동안 세척합니다. 세포를 500 마이크로 리터의 2 % 파라 포름 알데히드로 고정하고 유세포 분석 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 죽은 세포 제어의 경우 세포를 200 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 30 분 동안 고정하고 섭씨 4도에서 10 분 동안 300G에서 500 마이크로 리터의 1XPBS로 세척하십시오.상청액을 버리고 200 마이크로 리터의 0.1 % Triton X-100을 첨가하십시오. 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양하십시오. 500 마이크로 리터의 1X PBS로 씻고 7AAD로 염색하십시오.유세포분석기 소프트웨어에서 캡처된 데이터를 분석합니다. 파일을로드하고 염색되지 않은 호중구 파일을 두 번 클릭하십시오. X축의 전방 산란 또는 FSC와 Y축의 측면 산란 또는 SSC를 선택하여 호중구에 해당하는 세포 집단을 표시합니다.그런 다음 X축에서 채널 B3-A:PerCP vio 700-A를 선택하여 세포의 자가형광을 디라인하고 Y축에서 히스토그램을 선택합니다. 그런 다음 염색된 호중구 파일을 엽니다. X축에서 FSC를 선택하고 Y축에서 SSC를 선택하여 호중구에 해당하는 세포 집단을 표시합니다.다시, 채널 B3-A:PerCP vio 700-A를 선택하여 염료 7AAD에 대해 양성인 호중구의 집단을 구분한다. 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 레이아웃 편집기에 복사를 선택하여 최종 히스토그램을 생성합니다. 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 박테리아 또는 곰팡이 의사 균사를 추가하십시오.200 마이크로리터이므로 5 마이크로몰 CFSC를 1X PBS에 첨가한다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 10 분 동안 혼합하고 배양하십시오. 500 마이크로 리터의 비 보수 된 혈장과 원심 분리기를 추가하여 반응을 중지하십시오.상청액을 버리고 원심 분리로 1XPBS 1 밀리리터로 펠릿을 세척하십시오. 이어서 미생물을 250 마이크로리터의 1X PBS에 재현탁시킨다. NET 유도를 위해 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 50 마이크로 리터 분취량을 7 번째 박테리아에 2 배 10 또는 5 번째 의사 균사에 2 배 10으로 준비합니다.10 x 10mm 멸균 유리 커버 슬립을 24웰 플레이트에 놓습니다. 실온에서 1시간 동안 10마이크로리터의 0.001%폴리 l-라이신으로 덮고 100마이크로리터의 1X PBS로 두 번 세척합니다. 자연 건조 및 자외선으로 15 분 동안 조사하십시오.다음으로, 이전에 준비된 호중구 현탁액의 HBSS 용액을 10%열 탈보충된 자가 혈장이 보충된 RPMI 1640 배지로 교체합니다. 350 마이크로리터의 이 세포 현탁액을 24-웰 플레이트에 첨가하여 웰당 10 내지 5번째 호중구의 2배의 최종 농도를 갖는다. 세포가 웰 바닥에 부착되도록 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소로 플레이트를 20 분 동안 배양합니다.그물 형성을 유도하려면 MOI1에 박테리아 자극 MOI100과 유사 균사를 추가하십시오. 또한 생화학적 자극을 추가하고 50 마이크로리터의 HBSS를 첨가하여 자극 없이 대조군을 준비한다. 웰당 400마이크로리터의 최종 부피를 얻고 플레이트 셰이커에서 140RPM에서 30초 동안 혼합합니다.그런 다음 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 4 시간 동안 배양하십시오. 순 유도 후, 조심스럽게 피펫팅하여 웰에서 상청액을 제거하고 세포를 300마이크로리터의 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정합니다. 원심분리 없이 200마이크로리터의 1X PBS로 세포를 세척하고 200마이크로리터의 블로킹 완충액을 30분 동안 추가합니다.LL37 염색의 경우 1X PBS에서 200 마이크로 리터의 0.2 % 트리톤 X-100으로 세포를 10 분 동안 투과시키고 1X PBS로 두 번 세척합니다. 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하십시오. DNA는 2 마이크로 리터의 DAPI로 세포를 염색하고 공초점 형광 현미경으로 분석 할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.동적 세포 단계는 이중 밀도 구배 정제 후에 시각화되었습니다. 전형적인 호중구 형태는 오른쪽 염색으로 확인하였다. 세포는 또한 막 파괴 없이 트리판 블루 배제에 의해 관찰된 최적의 생존력을 보였다.유동 세포분석에 의한 SSC 대 FSC의 분석은 높은 세포 순도를 갖는 PMN에 상응하는 집단을 확인하였다. 염색되지 않은 세포 대 7AAD 염색 세포에 대한 PMN 점도표 및 각각의 히스토그램은 투과화된 대조군 세포와 비교하여 새로 분리된 호중구에서 높은 세포 생존율을 나타냈다. 화학 및 미생물 자극제로 호중구를 자극한 후, DNA DPI 및 항-LL37을 사용하여 형광 현미경으로 NET을 시각화하였다.미생물을 CFSE로 미리 염색하였다. PMA 유도 자살 그물 형성은 LL37과의 공동 국소화로 나타납니다. HOCI로 형성된 NET은 중요한 NET 형성에 해당하는 세포 외 공간에서 약간의 DNA 분산을 보였다.진균 유사 균사에 의해 유도 된 NET은 중요한 NET 형성의 특징 인 필라멘트 구조를 갖는 세포 외 공간으로 방출 된 낮은 농도의 DNA를 보였다. S.aureus는 중요한 NET 형성을 보인 반면 녹농균은 자살 NET 형성을 나타내는 LL37과 공동 국소화되는 흐린 형태로 많은 농도의 DNA 방출을 유도했습니다. 이중 밀도 구배 방법론을 수행하면 호중구의 높은 순도와 생존력을 얻을 수 있습니다.그리고 우리는 세척을 높이고 구조를 손상시키지 않습니다. 이 방법에 따라 NET 생산에서 물질 또는 세포의 효과뿐만 아니라 일부 메커니즘 또는자가 면역 질환의 치료법으로 사용되는지 여부를 분석 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

면역형광 현미경을 사용하여 파라핀 내장 펠린 동맥 혈전에서 호중구 세포 외 트랩의 식별

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...