Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et grunnleggende vitenskapsstipend (# 285480) fra CONACyT og av Institutt for klinisk immunologiforskning ved fakultetet for biokjemiske vitenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L og W.J.R.R. har doktorgradsstipend i henholdsvis CONACyT-nummer #799779, #660793 og #827788.

Blodprøvene ble innhentet som donasjoner fra klinisk friske deltakere etter informert samtykke. Alle eksperimenter ble utført med tillatelse fra Human Research Ethics Committee ved Fakultet for biokjemiske vitenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' i Oaxaca.
MERK: Inklusjonskriteriene i studien var utydelig kjønn og alder, og klinisk sunne i henhold til deltakernes svar på et spørreskjema før blodprøvetaking. En hematologisk analyse ble utført for å bestemme celletallet og ut...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

En svært ren populasjon av levedyktige nøytrofiler må oppnås for å indusere frigjøring av NETs siden disse cellene har en begrenset ex vivo levetid på 8 timer i gjennomsnitt, en periode hvor alle forsøkene må utføres. For dette formål er den ideelle metoden den doble tetthetsgradienten for å optimalisere rensetiden ved å isolere ikke-aktiverte celler som er mer lydhøre overfor eksogen stimulering, i motsetning til Ficoll-Histopaque gradient eller Dextran sedimenteringsteknikker17<...

Neutrofiler er de mest tallrike leukocytter i blodet, og spiller en viktig rolle under klaring av patogene midler ved flere mekanismer, inkludert frigjøring av store kromatinstrukturer sammensatt av DNA og flere kjernefysiske, cytoplasmatiske og granulære antibakterielle proteiner 1,2. Den direkte forløperen som beskriver denne antimikrobielle rollen til nøytrofiler ble laget av Takei et al.3 i 1996. Disse forfatterne rapporterte en ny form for død forskjellig fra apoptose og nekroptose hos nøytrofiler, viste morfologiske endringer som viste nukleær ruptur, etterfulgt av utslipp ut av nukleoplasma inn i cytoplasma, og en økning i membranpermeabilitet fra 3 timers inkubasjon med phorbol myristateacetat (PMA) 2,3. Det var imidlertid ikke før 2004 at begrepet "nøytrofile ekstracellulære feller (NETs)" ble brukt4.
NET-dannelse har blitt observert under forskjellige forhold, for eksempel bakteriell, sopp5, viral6 og parasittiske infeksjoner, for å nøytralisere, drepe og forhindre mikrobiell spredning7. Andre studier viser at det også kan forekomme i ikke-patogene forhold ved sterile stimuli, som cytokiner, mononatrium urinsyre eller kolesterolkrystaller, autoantistoffer, immunkomplekser og aktiverte blodplater. Lipopolysakkarid (LPS), interleukin-8 (IL-8) og PMA var blant de første in vitro-stimuliene beskrevet som NET-induktorer, og in vivo NET-involvering i patogene prosesser ble demonstrert i to modeller av akutt betennelse: eksperimentell dysenteri og spontan human blindtarmbetennelse4. DNA er en viktig NET-komponent. Dens passende struktur og sammensetning er nødvendig for sekvestrering og drap av mikroorganismer ved å levere en høy lokal konsentrasjon av antimikrobielle molekyler mot de fangede mikrober, som demonstrert ved en kort deoksyribonuklease (DNase) behandling som desintegrerer NETs og deres mikrobicidale egenskaper4. Foruten DNA består NETs av festede proteiner som histoner, nøytrofil elastase (NE), cathepsin G (CG), proteinase 3, laktoferrin, gelatinase, myeloperoksidase (MPO) og antimikrobielle peptider (AMPs) som det kationiske proinflammatoriske peptidet cathelicidin LL-37 blant andre 8,9. Slike aggregater kan danne større tråder med diametre opp til 50 nm. Disse faktorene kan forstyrre de mikrobielle virulensfaktorene eller integriteten til patogencellemembranen; I tillegg kan AMP-ene stabilisere NET-avledet DNA mot nedbrytning av bakterielle nukleaser10.
De spesifikke mekanismene som regulerer NET-dannelse er ennå ikke helt avklart. Den best karakteriserte veien som fører til NET-frigjøring er gjennom ERK-signalering, noe som fører til NADPH-oksidaseaktivering og reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, samt økt intracellulært kalsium som utløser aktivering av MPO-banen. Dette forvandler igjen hydrogenperoksid til hypoklorsyre, og aktiverer NE ved oksidasjon11,12. NE er ansvarlig for å nedbryte aktinfilamentene i cytoskelettet for å blokkere fagocytose og translokere dem til kjernen for behandling ved proteolytisk spaltning og deaminering av PAD4 som driver desensibiliseringen av kromatinfibre, som assosieres med granulat- og cytoplasmatiske proteiner, og frigjøres deretter ekstracellulært7. Disse proteasene inkluderer de som frigjøres fra azurosomkomplekset av azurofile granulater og andre proteaser som cathepsin G13.
Avhengig av de morfologiske endringene i nøytrofiler, er NET klassifisert i to typer: suicidal eller lytisk NET-formasjon som fører til celledød4, og vital eller ikke-lytisk NET-formasjon produsert av levedyktige celler mediert av en vesikulær frigjøring av nukleært eller mitokondrielt DNA, med en rest av en anukleert cytoplast med fagocytisk evne14,15. Vanligvis presenterer NETs sammensatt av mitokondrielt DNA en langstrakt fiber14 morfologi, mens de som er strukturert av nukleært DNA har et skylignende utseende3. Det er imidlertid ikke kjent hvordan nøytrofilen velger sin DNA-opprinnelse. I motsetning til tidligere studier som beskrev de kanoniske banene til NETs som krever flere timer, aktiveres den vitale banen raskt på bare 5-60 minutter15.
Til tross for disse fremskrittene varierer NET-sammensetningen avhengig av stimulansen; For eksempel induserer forskjellige mucoid og ikke-mucoid stammer av P. aeruginosa dannelsen av NETs som inneholder 33 vanlige proteiner og opptil 50 variable proteiner7. Dermed er det nødvendig å homogenisere teknikker som tillater generering av objektive konklusjoner i forskningsgrupper. Dette papiret beskriver en protokoll med ulike teknikker som tillater sammenligning og evaluering av sammensetningen, strukturen og morfologien til NETs indusert med forskjellige mikroorganismer: Staphylococcus aureus (gram-positiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gram-negativ bakterie) og Candida albicans (sopp), samt kjemiske stimuli (PMA, HOCl) i humane nøytrofiler fra friske individer. De representative resultatene viser heterogeniteten til NETs avhengig av deres induserende stimulus under sammenlignbare in vitro-forhold, preget av DNA-DAPI-farging, immunostaining for LL37 og kvantifisering av enzymatisk aktivitet (NE, CG og MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Neutrofiler fungerer som den første linjen av cellulært forsvar i en medfødt immunrespons ved å benytte ulike mekanismer, for eksempel dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs). Denne studien analyserer morfologiske og sammensetningsendringer i NETs indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli ved hjelp av standardiserte in vitro-metoder for NET-induksjon og karakterisering med humane celler. Prosedyrene beskrevet her tillater analyse av NET-morfologi (lytisk eller ikke-lytisk) og sammensetning (DNA-proteinstrukturer og enzymatisk aktivitet), og effekten av løselige faktorer eller cellulær kontakt på slike egenskaper. I tillegg kan teknikkene beskrevet her modifiseres for å evaluere effekten av eksogene løselige faktorer eller cellulær kontakt på NET-sammensetning.
De anvendte teknikkene inkluderer rensing av polymorfonukleære celler fra humant perifert blod ved bruk av en dobbel tetthetsgradient (1.079-1.098 g / ml), som garanterer optimal renhet og levedyktighet (≥ 95%) som demonstrert av Wrights farging, trypanblå eksklusjon og flowcytometri, inkludert FSC versus SSC-analyse og 7AAD-farging. NET-dannelse induseres med mikrobielle (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Candida albicans) og kjemiske (phorbol myristateacetat, HOCl) stimuli, og NETs er preget av DNA-DAPI-farging, immunostaining for det antimikrobielle peptidet cathelicidin (LL37) og kvantifisering av enzymatisk aktivitet (nøytrofil elastase, cathepsin G og myeloperoksidase). Bildene er anskaffet gjennom fluorescensmikroskopi og analysert med ImageJ.

Renhet og levedyktighet av nøytrofiler De dynamiske cellulære fasene visualiseres i røret fra den doble tetthetsgradientrensingen. Innenfor disse lagene er laget som tilsvarer granulocytter over tetthetslaget på 1,079 g/ml, skilt fra fasene av perifere mononukleocytter (PBMC) og erytrocytter (figur 1A). Morfologien til de rensede cellene ble verifisert med Wrights farging ved å observere celler med segmenterte kjerner forbundet med trådlignende filamenter tilsvarend...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Presentert her er en protokoll for induksjon og analyse av in vitro nøytrofile ekstracellulære feller (NETs). Kvantifisering av DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet ga data som viser variasjonen i sammensetningen og morfologien til NETs indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli under lignende kontrollerte forhold.

Morfologisk og kompositorisk analyse av nøytrofile ekstracellulære feller indusert av mikrobielle og kjemiske stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Denne protokollen demonstrerer heterogeniteten i sammensetning, struktur og morfologi av nøytrofile ekstracellulære feller, avhengig av deres induserende stimulus under sammenlignbare in vitro-forhold hos humane nøytrofiler fra friske individer. Høy nøytrofil renhet og levedyktighet oppnås. Det gjør det mulig å sammenligne konsentrasjonen av DNA, LL-37 og enzymaktiviteten til myeloperoksidase, elastase og cathepsin G, frigjort av nøytrofile ekstracellulære feller.Denne protokollen tillot å analysere effekten av løselige faktorer eller cellulær kontakt eller mulige terapier eller mekanismer for å lukke produksjonen av NETs i autoimmun sykdom. Disse metodene kan hjelpe til med å undersøke autoimmun sykdom. På grunn av den ukontrollerte cellegjengivelsen av NETs og varigheten av justere komponentene deres, som betraktes som biomarkører av sykdommen.Fluorescensmikroskopi gjør det mulig å ta bilde av NETs som viser spredning av DNA i forbindelse med protein som LL37, som samlokalisert med mikroorganismer bidrar til å forstå hvordan de ser ut. For å begynne, utfør vena punktering for å samle 10 milliliter perifert blod i rør som inneholder dipotassium EDTA som antikoagulant. Utfør deretter standard blodbiometri og C-reaktivt proteintest for å utelukke infeksjon eller betennelse for å sikre kvaliteten på prøven.Sentrifuger den perifere blodprøven for å fjerne det blodplaterike plasmaet, etterfulgt av en ny sentrifugering og kast det gjenværende plasmaet. Fortynn den resulterende erytrocyt- og leukocyttpakken i en-til-en-volumforhold med en 1X DPBS. Deretter, i et sterilt 10 milliliter glassrør, må du først sette inn en milliliter på 1,08 gram per milliliter tetthetsløsning etterfulgt av en milliliter 1,079 gram per milliliter tetthetsløsning.Deretter legger du til fire milliliter av den fortynnede erytrocyt- og leukocyttpakken ved å helle over veggene. Sentrifuge uten akselerasjon eller retardasjon for å unngå å forstyrre gradienten. Aspirer fasen som tilsvarer granulocytter og overfør til et annet sterilt 10 milliliter glassrør.Vask med fire milliliter 1X DPBS ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten. For å fjerne de resterende erytrocyttene, behandle cellene med osmotisk sjokk ved å tilsette fire milliliter 0,2% saltoppløsning. Inkuber i to minutter ved fire grader Celsius og sentrifuge.Kast supernatanten og tilsett fire milliliter 0,65% saltoppløsning. Inkuber i fem minutter ved fire grader Celsius for å gjenopprette membranintegritet og gjenta sentrifugering. Fjern supernatanten og suspender cellene på nytt i fire milliliter 1X DPBS for å fjerne cellulært rusk.Igjen, sentrifuger og suspendere cellepelleten i to milliliter kald HBSS-buffer. For å utføre en trypan blå eksklusjonstest, fortynn fem mikroliter av cellesuspensjonen i 20 mikroliter på 0,4% trypanblå. Tell cellene i et nytt buekammer og bestem cellens levedyktighet ved hjelp av en eksklusjonstest.Monter deretter 5 mikroliter av cellesuspensjonen på et lysbilde og flekk med Wrights flekk i 15 sekunder. Fest prøven umiddelbart, vask med destillert vann og observer morfologien under et optisk mikroskop. Deretter legger du til en gang 10 til de femte cellene for å strømme cytometrirør og flekke med en mikroliter 7AAD i 100 mikroliter FACS-buffer i 15 minutter ved fire grader Celsius i mørket.Vask med 500 mikroliter FACS-buffer ved 300 G i 10 minutter. Fest cellene med 500 mikroliter 2% paraformaldehyd og oppbevar ved fire grader Celsius til flowcytometrianalyse. For en død cellekontroll, fest cellene med 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minutter og vask med 500 mikroliter 1XPBS ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Kast supernatanten og tilsett 200 mikroliter 0,1% Triton X-100. Inkuber i en time ved fire grader Celsius. Vask med 500 mikroliter 1X PBS og flekk med 7AAD.Analyser de fangede dataene i flowcytometerprogramvaren. Last inn filene og dobbeltklikk på den ufargede nøytrofilfilen. Velg fremoverspredning eller FSC på X-aksen og sidespredningen eller SSC på Y-aksen for å vise cellepopulasjonen som tilsvarer nøytrofiler.Velg deretter kanalen B3-A: PerCP vio 700-A på X-aksen for å begrense autofluorescensen til cellene og velg histogram på Y-aksen. Åpne deretter den fargede nøytrofilfilen. Velg FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen for å vise cellepopulasjonen som tilsvarer nøytrofiler.Igjen velger du kanalen B3-A: PerCP vio 700-A for å avgrense populasjonen av nøytrofiler som er positive for fargestoffet 7AAD. Generer det endelige histogrammet ved å høyreklikke på vinduet og velge kopier til layoutredigerer. Legg bakteriell eller sopp pseudohyphae i 1,5 milliliter mikrorør.Tilsett 200 mikroliter, så fem mikromolar CFSC i 1X PBS. Bland og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter i mørket. Stopp reaksjonen ved å tilsette 500 mikroliter dekomplementert plasma og sentrifuge.Kast supernatanten og vask pelleten med en milliliter 1XPBS med sentrifugering. Deretter suspenderes mikroorganismene i 250 mikroliter 1X PBS. Forbered 50 mikroliter aliquots i 1,5 milliliter mikrorør med to ganger 10 til den syvende bakterier eller to ganger 10 til den femte pseudohyphae for NET induksjon.Plasser 10 x 10 millimeter sterilt glassdeksel i en 24-brønns plate. Dekk med 10 mikroliter 0,001% poly l-lysin i en time ved romtemperatur og vask to ganger med 100 mikroliter 1X PBS. Lufttørk og bestråling med UV-lys i 15 minutter.Erstatt deretter HBSS-oppløsning av nøytrofilsuspensjonen fremstilt tidligere med RPMI 1640-medium supplert med 10% varmedekomplementert autologt plasma. Tilsett 350 mikroliter av denne cellesuspensjonen til 24-brønnsplaten for en endelig konsentrasjon på to ganger 10 til de femte nøytrofile per brønn. Inkuber platen i 20 minutter ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid for å la cellene feste seg til bunnen av brønnene.For å indusere nettdannelse, legg til bakteriestimuliene MOI100 og pseudohyphae ved MOI1. Legg også til biokjemiske stimuli og lag en kontroll uten stimulans ved å legge til 50 mikroliter HBSS. Få et endelig volum på 400 mikroliter per brønn og bland på en plateshaker ved 140 o / min i 30 sekunder.Inkuber deretter i fire timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter netto induksjon, fjern supernatanten fra brønnene ved å pipettere forsiktig og fest cellene med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Vask cellene med 200 mikroliter 1X PBS uten sentrifugering og tilsett 200 mikroliter blokkeringsbuffer i 30 minutter.For LL37-flekk, permeabiliser cellene med 200 mikroliter 0,2% Triton X-100 i 1X PBS i 10 minutter og vask med 1X PBS to ganger. Monter dekselet på glassflater. DNA flekker cellene med to mikroliter DAPI og lagrer ved minus 20 grader Celsius til analyse ved konfokal fluorescensmikroskopi.De dynamiske cellulære fasene ble visualisert etter rensing av dobbel tetthetsgradient. Den typiske nøytrofile morfologien ble bekreftet ved høyre farging. Cellene viste også optimal levedyktighet observert ved trypanblå eksklusjon uten membranforstyrrelser.Analyse av SSC versus FSC ved flowcytometri bekreftet en populasjon tilsvarende PMN med høy cellerenhet. PMN-punktplott for ikke-fargede celler versus 7AAD-flekkceller og deres respektive histogrammer indikerte en høy celle levedyktighet i de nylig isolerte nøytrofile sammenlignet med de permeabiliserte kontrollcellene. Etter å ha stimulert nøytrofile stoffer med kjemiske og mikrobielle stimulanter, ble NETs visualisert ved fluorescensmikroskopi ved bruk av DNA DPI og anti-LL37.Mikroorganismene var forhåndsfarget med CFSE. PMA-indusert selvmordsnettdannelse indikert ved samlokalisering med LL37. Mens NETs dannet med HOCI viste mindre DNA-dispersjon i det ekstracellulære rommet som korresponderte med vital NET-dannelse.NET indusert av sopp pseudohyphae viste lave konsentrasjoner av DNA frigjort i det ekstracellulære rommet med filamentøse strukturer som er karakteristiske for den vitale NET-formasjonen. S.aureus viste vital NET-dannelse mens P.aeruginosa induserte frigjøring av store konsentrasjoner av DNA med en uklar morfologi som samlokaliserte med LL37 som indikerer selvmord NET-dannelse. Ved å utføre dobbel tetthetsgradientmetodikk kan vi oppnå høy renhet og levedyktighet av nøytrofiler.Og vi løfter vaskene, vi unngår å skade strukturen til dem. Etter denne metoden kan vi analysere effekten av stoffer eller celler i NET-produksjon, samt om de er involvert i en eller annen mekanisme eller deres bruk som terapier ved autoimmun sykdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Forenklede menneske Nøytrofile Ekstracellulære Traps (NET) Isolasjon og håndtering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder for å studere Lipidendringer av nøytrofile granulocytter og etterfølgende dannelse av Neutrofil Ekstracellulær feller

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisere Macrophage ekstracellulære feller bruker AC Confocal mikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hjørnetann nøytrofile ekstracellulære felle formasjon: Dynamisk og kvantitativ analyse av fluorescens mikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisert image-basert kvantifisering av nøytrofile ekstracellulære feller bruke NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifikasjon av nøytrofile ekstracellulære feller i parafininnebygd feline arteriell trombi ved hjelp av immunofluorescens mikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kvantifisering av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser fra nøytrofile ekstracellulære feller ved hjelp av en modifisert Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunfluorescensavbildning av nøytrofile ekstracellulære feller i vev fra mennesker og mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...