Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de ciência básica (#285480) do CONACyT e pelo Departamento de Pesquisa em Imunologia Clínica da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L e W.J.R.R. têm bolsas de doutorado dos números CONACyT #799779, #660793 e #827788, respectivamente.

As amostras de sangue foram obtidas como doações de participantes clinicamente saudáveis após consentimento informado. Todos os experimentos foram realizados com a permissão do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Ciências Bioquímicas da Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.
NOTA: Os critérios de inclusão no estudo foram sexo e idade indistintos e clinicamente saudáveis de acordo com as respostas dos participantes a um questionário antes de uma...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Uma população altamente pura de neutrófilos viáveis deve ser obtida para induzir a liberação de TNEs, uma vez que essas células têm uma vida útil ex vivo limitada de 8 h em média, um período dentro do qual todos os experimentos devem ser realizados. Para tanto, a metodologia ideal é o gradiente de dupla densidade para otimizar o tempo de purificação, isolando células não ativadas mais responsivas à estimulação exógena, em contraste com o gradiente Ficoll-Histopaque ou as técnicas de sediment...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na corrente sanguínea, desempenhando um papel essencial durante a depuração de agentes patogênicos por diversos mecanismos, incluindo a liberação de grandes estruturas cromatina compostas de DNA e várias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas e granulares 1,2. O antecedente direto descrevendo esse papel antimicrobiano dos neutrófilos foi feito por Takei et al.3 em 1996. Esses autores relataram uma nova forma de morte diferente da apoptose e necroptose em neutrófilos, mostraram alterações morfológicas exibindo ruptura nuclear, seguidas de derramamento do nucleoplasma para o citoplasma, e um aumento na permeabilidade da membrana a partir de 3 h de incubação com acetato de miristato de forbol (PMA)2,3. No entanto, foi somente em 2004 que o termo "armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs)" foi utilizado4.
A formação de NET tem sido observada em diversas condições, como infecções bacterianas, fúngicas5, virais6 e parasitárias, para neutralizar, matar e prevenir a disseminação microbiana7. Outros estudos mostram que também pode ocorrer em condições não patogênicas por estímulos estéreis, como citocinas, ácido úrico monossódico ou cristais de colesterol, autoanticorpos, imunocomplexos e plaquetas ativadas7. Lipopolissacarídeo (LPS), interleucina-8 (IL-8) e PMA estavam entre os primeiros estímulos in vitro descritos como indutores de NET, e o envolvimento in vivo da TNE em processos patogênicos foi demonstrado em dois modelos de inflamação aguda: disenteria experimental e apendicite humana espontânea4. O DNA é um componente essencial da NET. Sua estrutura e composição adequadas são necessárias para o sequestro e morte de microrganismos, fornecendo uma alta concentração local de moléculas antimicrobianas em direção aos micróbios capturados, como demonstrado por um breve tratamento com desoxirribonuclease (DNase) que desintegra TNEs e suas propriedades microbicidas4. Além do DNA, os TNEs compreendem proteínas aderentes, como histonas, elastase de neutrófilos (NE), catepsina G (GC), proteinase 3, lactoferrina, gelatinase, mieloperoxidase (MPO) e peptídeos antimicrobianos (AMPs), como o peptídeo pró-inflamatório catiônico catelicidina LL-37, entre outros 8,9. Tais agregados podem formar roscas maiores com diâmetros de até 50 nm. Esses fatores podem perturbar os fatores de virulência microbiana ou a integridade da membrana celular do patógeno; além disso, os AMPs podem estabilizar o DNA derivado da TNE contra a degradação por nucleases bacterianas10.
Os mecanismos específicos que regulam a formação da NET ainda não foram completamente esclarecidos. A via mais bem caracterizada que leva à liberação de NET é através da sinalização ERK, que leva à ativação da NADPH oxidase e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como ao aumento do cálcio intracelular que desencadeia a ativação da via MPO. Este, por sua vez, transforma o peróxido de hidrogênio em ácido hipocloroso, ativando o NE por oxidação11,12. O NE é responsável por degradar os filamentos de actina do citoesqueleto para bloquear a fagocitose e translocá-los para o núcleo para processamento por clivagem proteolítica e desaminação por PAD4 que impulsionam a dessensibilização das fibras cromatinas, que se associam a proteínas granulográficas e citoplasmáticas, e são então liberadas extracelularmente7. Essas proteases incluem aquelas liberadas do complexo azurossomo dos grânulos azurófilos e outras proteases, como a catepsina G13.
Dependendo das alterações morfológicas nos neutrófilos, os TNEs são classificados em dois tipos: formação de TNE suicida ou lítica levando à morte celular4 e formação de TNE vital ou não lítica produzida por células viáveis mediadas por uma liberação vesicular de DNA nuclear ou mitocondrial, com remanescente de citoplasto anucleado com capacidade fagocítica14,15. Geralmente, TNEs compostos de DNA mitocondrial apresentam morfologia de fibra alongada14, enquanto aqueles estruturados de DNA nuclear têm aparência de nuvem3. No entanto, não se sabe como o neutrófilo escolhe sua origem no DNA. Ao contrário de estudos anteriores que descreveram as vias canônicas dos TNEs como exigindo várias horas, a via vital é rapidamente ativada em apenas 5-60 min15.
Apesar desses avanços, a composição da TNE varia de acordo com o estímulo; por exemplo, diferentes cepas mucoides e não mucoides de P. aeruginosa induzem a formação de TNEs contendo 33 proteínas comuns e até 50 proteínas variáveis7. Assim, faz-se necessário homogeneizar técnicas que permitam a geração de conclusões objetivas em grupos de pesquisa. Este trabalho descreve um protocolo com várias técnicas que permitem comparar e avaliar a composição, estrutura e morfologia de TNEs induzidos com diferentes microrganismos: Staphylococcus aureus (bactéria gram-positiva), Pseudomonas aeruginosa (bactéria gram-negativa) e Candida albicans (fungo), bem como estímulos químicos (PMA, HOCl) em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Os resultados representativos demonstram a heterogeneidade dos TNEs dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis, caracterizadas por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para LL37 e quantificação da atividade enzimática (NE, GC e MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Os neutrófilos funcionam como a primeira linha de defesa celular em uma resposta imune inata, empregando diversos mecanismos, como a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs). Este estudo analisa as alterações morfológicas e composicionais em TNEs induzidas por estímulos microbianos e químicos utilizando metodologias padronizadas in vitro para indução e caracterização da TNE com células humanas. Os procedimentos aqui descritos permitem a análise da morfologia da NET (lítica ou não lítica) e da composição (estruturas DNA-proteína e atividade enzimática), e o efeito de fatores solúveis ou contato celular sobre tais características. Além disso, as técnicas aqui descritas poderiam ser modificadas para avaliar o efeito de fatores solúveis exógenos ou de contato celular na composição da TNE.
As técnicas aplicadas incluem a purificação de células polimorfonucleares do sangue periférico humano usando um gradiente de densidade dupla (1,079-1,098 g/mL), garantindo pureza e viabilidade ideais (≥ 95%), conforme demonstrado pela coloração de Wright, exclusão de azul de tripano e citometria de fluxo, incluindo análise FSC versus SSC e coloração 7AAD. A formação de NET é induzida com estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e químicos (acetato de miristato de phorbol, HOCl), e os TNEs são caracterizados por coloração DNA-DAPI, imunocoloração para o peptídeo antimicrobiano catelicidina (LL37) e quantificação da atividade enzimática (elastase de neutrófilos, catepsina G e mieloperoxidase). As imagens são adquiridas por microscopia de fluorescência e analisadas com ImageJ.

Pureza e viabilidade dos neutrófilos As fases celulares dinâmicas são visualizadas no tubo a partir da purificação do gradiente de dupla densidade. Dentro dessas camadas, a camada correspondente aos granulócitos está acima da camada de densidade de 1,079 g/mL, distinta das fases de mononucleócitos do sangue periférico (PBMCs) e eritrócitos (Figura 1A). A morfologia das células purificadas foi verificada com a coloração de Wright por meio da observação de c?...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Este protocolo demonstra a heterogeneidade na composição, estrutura e morfologia de armadilhas extracelulares de neutrófilos, dependendo de seu estímulo indutor em condições in vitro comparáveis em neutrófilos humanos de indivíduos saudáveis. Alta pureza e viabilidade de neutrófilos são obtidas. Isso permite comparar a concentração de DNA, LL-37 e a atividade enzimática da mieloperoxidase, elastase e catepsina G, liberadas por armadilhas extracelulares de neutrófilos.Este protocolo permitiu analisar o efeito de fatores solúveis ou contato celular ou possíveis terapias ou mecanismos de fechamento sobre a produção de TNEs em doenças autoimunes. Esses métodos podem auxiliar na investigação de doenças autoimunes. Devido à reprodução celular descontrolada dos TNEs e à duração do alinhamento de seus componentes, que são considerados biomarcadores da doença.A microscopia de fluorescência permite capturar imagens de TNEs mostrando a dispersão do DNA em associação com proteínas como a LL37, que co-localizada com microrganismos ajudando a entender como eles estão aparecendo. Para começar, realize punção de veia para coletar 10 mililitros de sangue periférico em tubos contendo EDTA dipotássico como anticoagulante. Em seguida, realize a biometria sanguínea padrão e o teste de proteína C-reativa para descartar infecção ou inflamação para garantir a qualidade da amostra.Centrifugar a amostra de sangue periférico para remover o plasma rico em plaquetas, seguido de uma segunda centrifugação e descartar o plasma restante. Diluir o pacote de eritrócitos e leucócitos resultante na proporção de um para um volume com um DPBS 1X. Em seguida, em um tubo de vidro estéril de 10 mililitros, primeiro deposite um mililitro de 1,08 gramas por solução de densidade de mililitros, seguido por um mililitro de 1,079 gramas por solução de densidade de mililitro.Em seguida, adicione quatro mililitros do pacote diluído de eritrócitos e leucócitos derramando sobre as paredes. Centrífuga sem aceleração ou desaceleração para evitar perturbar o gradiente. Aspirar a fase correspondente aos granulócitos e transferir para outro tubo de vidro estéril de 10 mililitros.Lave com quatro mililitros de 1X DPBS a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Para remover os eritrócitos restantes, trate as células com choque osmótico adicionando quatro mililitros de solução salina a 0,2%. Incubar por dois minutos a quatro graus Celsius e centrifugar.Rejeitar o sobrenadante e adicionar quatro mililitros de solução salina a 0,65%. Incubar por cinco minutos a quatro graus Celsius para restaurar a integridade da membrana e repetir a centrifugação. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em quatro mililitros de 1X DPBS para remover os detritos celulares.Novamente, centrifugar e ressuspender a pastilha de célula em dois mililitros de tampão HBSS frio. Para realizar um teste de exclusão de azul de tripano, diluir cinco microlitros da suspensão celular em 20 microlitros de azul de tripano a 0,4%. Conte as células em uma nova câmara de bower e determine a viabilidade celular usando um teste de exclusão.Em seguida, monte 5 microlitros da suspensão celular em uma lâmina e manche com a mancha de Wright por 15 segundos. Fixe imediatamente a amostra, lave com água destilada e observe a morfologia sob um microscópio óptico. Em seguida, adicione uma vez 10 às quintas células aos tubos de citometria de fluxo e core com um microlitro de 7AAD em 100 microlitros de tampão FACS por 15 minutos a quatro graus Celsius no escuro.Lave com 500 microlitros de tampão FACS a 300 G durante 10 minutos. Fixar as células com 500 microlitros de paraformaldeído a 2% e armazenar a quatro graus Celsius até a análise da citometria de fluxo. Para um controle de células mortas, fixe as células com 200 microlitros de paraformaldeído a 4% por 30 minutos e lave com 500 microlitros de 1XPBS a 300 G por 10 minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante e adicione 200 microlitros de 0,1%Triton X-100. Incubar por uma hora a quatro graus Celsius. Lave com 500 microlitros de 1X PBS e manche com 7AAD.Analise os dados capturados no software do citômetro de fluxo. Carregue os arquivos e clique duas vezes no arquivo de neutrófilos não manchado. Escolha dispersão para frente ou FSC no eixo X e dispersão lateral ou SSC no eixo Y para exibir a população celular correspondente aos neutrófilos.Em seguida, selecione o canal B3-A:PerCP vio 700-A no eixo X para delimitar a autofluorescência das células e escolha o histograma no eixo Y. Em seguida, abra o arquivo de neutrófilos corado. Escolha FSC no eixo X e SSC no eixo Y para exibir a população celular correspondente aos neutrófilos.Novamente, selecione o canal B3-A:PerCP vio 700-A para delimitar a população de neutrófilos positivos para o corante 7AAD. Gere o histograma final clicando com o botão direito do mouse na janela e selecionando copiar para o editor de layout. Adicione pseudo-hifas bacterianas ou fúngicas em microtubos de 1,5 mililitro.Adicione 200 microlitros, então cinco CFSC micromolares em 1X PBS. Misture e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos no escuro. Pare a reação adicionando 500 microlitros de plasma descomplementado e centrífuga.Descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de 1XPBS com centrifugação. Em seguida, ressuscite os microrganismos em 250 microlitros de 1X PBS. Prepare alíquotas de 50 microlitros em microtubos de 1,5 mililitro com duas vezes 10 para a sétima bactéria ou duas vezes 10 para a quinta pseudo-hifas para indução NET.Coloque 10 por 10 milímetros de tampa de vidro estéril deslizes em uma placa de 24 poços. Cubra com 10 microlitros de 0,001% de l-lisina poli por uma hora à temperatura ambiente e lave duas vezes com 100 microlitros de 1X PBS. Secar ao ar e irradiar com luz UV por 15 minutos.Em seguida, substitua a solução HBSS da suspensão de neutrófilos preparada anteriormente por um meio RPMI 1640 suplementado com plasma autólogo descomplementado a 10%. Adicione 350 microlitros desta suspensão celular à placa de 24 poços para uma concentração final de duas vezes 10 aos quintos neutrófilos por poço. Incubar a placa por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir que as células adiram ao fundo dos poços.Para induzir a formação líquida, adicione os estímulos bacterianos MOI100 e pseudo-hifas no MOI1. Adicione também os estímulos bioquímicos e prepare um controle sem estímulo adicionando 50 microlitros de HBSS. Obter um volume final de 400 microlitros por poço e misturar em um agitador de placa a 140 RPM por 30 segundos.Em seguida, incubar por quatro horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a indução líquida, retire o sobrenadante dos poços pipetando cuidadosamente e fixe as células com 300 microlitros de paraformaldeído a 4% por 30 minutos. Lave as células com 200 microlitros de 1X PBS sem centrifugar e adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos.Para a coloração LL37, permeabilizar as células com 200 microlitros de 0,2%Triton X-100 em 1X PBS por 10 minutos e lavar com 1X PBS duas vezes. Monte a tampa desliza em lâminas de vidro. O DNA cora as células com dois microlitros de DAPI e armazena a menos 20 graus Celsius até a análise por microscopia de fluorescência confocal.As fases celulares dinâmicas foram visualizadas após purificação do gradiente de dupla densidade. A morfologia típica dos neutrófilos foi confirmada pela coloração direita. As células também apresentaram viabilidade ótima observada pela exclusão do azul de tripano sem ruptura da membrana.A análise do CSC versus FSC por citometria de fluxo confirmou uma população correspondente ao PMN com alta pureza celular. Gráficos de pontos PMN para células não coradas versus células de coloração 7AAD e seus respectivos histogramas indicaram uma alta viabilidade celular nos neutrófilos recém-isolados em comparação com as células controle permeabilizadas. Após estimular os neutrófilos com estimulantes químicos e microbianos, os TNEs foram visualizados por microscopia de fluorescência utilizando DNA DPI e anti-LL37.Os microrganismos foram pré-corados com CFSE. Formação de rede suicida induzida por PMA indicada por co-localização com LL37. Enquanto os TNEs formados com HOCI mostraram menor dispersão de DNA no espaço extracelular que correspondeu à formação de TNE vital.NET induzida por pseudo-hifas fúngicas mostrou baixas concentrações de DNA liberado no espaço extracelular com estruturas filamentosas características da formação de NET vital. S.aureus mostrou formação de NET vital, enquanto P.aeruginosa induziu a liberação de grandes concentrações de DNA com uma morfologia turva que co-localizou com LL37 indicando formação de NET suicida. A realização da metodologia de gradiente de dupla densidade nos permite obter uma alta pureza e viabilidade dos neutrófilos.E elevamos as lavagens, evitamos danificar a estrutura delas. Seguindo este método, podemos analisar o efeito de substâncias ou células na produção de NET, bem como se elas estão envolvidas em algum mecanismo ou seu uso como terapias em doenças autoimunes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Imunologia e Infecção

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Visualizando o macrófago armadilhas extracelular usando microscopia Confocal

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Quantificação automatizada baseada em imagem de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identificação de Armadilhas Extracelulares De Neutrófilos em Trombo Arterial Felino Embutido parafina usando Microscopia de Imunofluorescência

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...