Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом фундаментальной науки (#285480) от CONACyT и Департаментом клинических иммунологических исследований факультета биохимических наук Автономного университета «Бенито Хуарес» де Оахака. A.A.A, S.A.S.L и W.J.R.R. имеют докторские стипендии номеров CONACyT #799779, #660793 и #827788 соответственно.

Образцы крови были получены в качестве донорства от клинически здоровых участников после информированного согласия. Все эксперименты проводились с разрешения Комитета по этике исследований человека факультета биохимических наук Автономного университета «Бенито Хуарес» в Оахаке....

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Высокочистая популяция жизнеспособных нейтрофилов должна быть получена, чтобы индуцировать высвобождение НЭТ, поскольку эти клетки имеют ограниченное время жизни ex vivo в среднем 8 ч, период, в течение которого должны быть выполнены все эксперименты. С этой целью идеальной методоло...

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами в кровотоке, играя существенную роль во время клиренса патогенных агентов несколькими механизмами, включая высвобождение крупных структур хроматина, состоящих из ДНК и нескольких ядерных, цитоплазматических и зернистых антибактериальных белков 1,2. Прямой предшественник, описывающий эту антимикробную роль нейтрофилов, был сделан Takei et al.3 в 1996 году. Эти авторы сообщили о новой форме смерти, отличной от апоптоза и некроптоза у нейтрофилов, показали морфологические изменения, демонстрирующие ядерный разрыв с последующим выплескиванием из нуклеоплазмы в цитоплазму и увеличением проницаемости мембраны от 3 ч инкубации с форбол миристатом ацетатом (PMA)2,3. Однако только в 2004 году был использован термин «внеклеточные ловушки нейтрофилов (NETs)»4.
Образование NET наблюдалось в различных условиях, таких как бактериальные, грибковые5, вирусные6 и паразитарные инфекции, для нейтрализации, уничтожения и предотвращения распространения микробов7. Другие исследования показывают, что он также может возникать в непатогенных условиях стерильными стимулами, такими как цитокины, мононатриевая мочевая кислота или кристаллы холестерина, аутоантитела, иммунные комплексы и активированные тромбоциты7. Липополисахарид (ЛПС), интерлейкин-8 (IL-8) и ПМА были одними из первых стимулов in vitro, описанных как индукторы NET, а участие IN VIVO NET в патогенных процессах было продемонстрировано в двух моделях острого воспаления: экспериментальной дизентерии и спонтанного аппендицита человека4. ДНК является важным компонентом NET. Его соответствующая структура и состав необходимы для связывания и уничтожения микроорганизмов путем доставки высокой локальной концентрации антимикробных молекул к пойманным микробам, о чем свидетельствует кратковременная обработка дезоксирибонуклеазой (ДНКаза), которая разрушает НЭТ и их микробицидные свойства4. Помимо ДНК, NETs содержат присоединенные белки, такие как гистоны, нейтрофильная эластаза (NE), катепсин G (CG), протеиназа 3, лактоферрин, желатиназа, миелопероксидаза (MPO) и антимикробные пептиды (AMPs), такие как катионный провоспалительный пептидный кателицидин LL-37 среди других 8,9. Такие агрегаты могут образовывать более крупные нити диаметром до 50 нм. Эти факторы могут нарушать микробные факторы вирулентности или целостность клеточной мембраны патогена; кроме того, AMP могут стабилизировать ПОЛУЧЕННУЮ ИЗ NET ДНК против деградации бактериальными нуклеазами10.
Конкретные механизмы, регулирующие образование NET, до сих пор полностью не выяснены. Наиболее характеризуемым путем, ведущим к высвобождению NET, является передача сигналов ERK, которая приводит к активации NADPH-оксидазы и производству активных форм кислорода (АФК), а также к увеличению внутриклеточного кальция, который вызывает активацию пути MPO. Это, в свою очередь, превращает перекись водорода в хлорноватистую кислоту, активируя NE путем окисления11,12. NE отвечает за деградацию актиновых нитей цитоскелета для блокирования фагоцитоза и перемещения их в ядро для обработки протеолитическим расщеплением и дезаминированием PAD4, которые управляют десенсибилизацией хроматиновых волокон, которые связываются с гранулами и цитоплазматическими белками, а затем высвобождаются внеклеточнымобразом 7. Эти протеазы включают те, которые высвобождаются из азуросомного комплекса гранул азурофилов и других протеаз, таких как катепсин G13.
В зависимости от морфологических изменений нейтрофилов, НЭТ классифицируются на два типа: суицидальное или литическое образование NET, приводящее к гибели клеток4, и жизненно важное или нелитическое ОБРАЗОВАНИЕ NET, продуцируемое жизнеспособными клетками, опосредованными везикулярным высвобождением ядерной или митохондриальной ДНК, с остатком ануклеированного цитопласта с фагоцитарной способностью14,15. Как правило, НЭТ, состоящие из митохондриальной ДНК, имеют удлиненную морфологию волокна14, в то время как те, которые структурированы из ядерной ДНК, имеют облачный вид3. Однако неизвестно, как нейтрофил выбирает свое ДНК-происхождение. В отличие от предыдущих исследований, которые описывали канонические пути НЭТ как требующие нескольких часов, жизненно важный путь быстро активируется всего за 5-60 минут15.
Несмотря на эти достижения, состав NET варьируется в зависимости от стимула; например, различные мукоидные и немукоидные штаммы P. aeruginosa индуцируют образование NETs, содержащих 33 общих белка и до 50 переменных белков7. Таким образом, необходимо гомогенизировать методики, позволяющие формировать объективные выводы в исследовательских группах. В данной работе описан протокол с различными методами, позволяющими сравнивать и оценивать состав, структуру и морфологию НЭТ, индуцированных различными микроорганизмами: золотистым стафилококком (грамположительная бактерия), Pseudomonas aeruginosa (грамотрицательная бактерия) и Candida albicans (гриб), а также химическими стимулами (PMA, HOCl) в нейтрофилах человека от здоровых людей. Репрезентативные результаты демонстрируют гетерогенность НЭТ в зависимости от их индуцирующего стимула в сопоставимых условиях in vitro, характеризующихся окрашиванием ДНК-DAPI, иммуноокрашиванием для LL37 и количественной оценкой ферментативной активности (NE, CG и MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Нейтрофилы функционируют как первая линия клеточной защиты во врожденном иммунном ответе, используя различные механизмы, такие как формирование внеклеточных ловушек нейтрофилов (NETs). В этом исследовании анализируются морфологические и композиционные изменения в НЭТ, индуцированные микробными и химическими стимулами, с использованием стандартизированных методологий in vitro для индукции и характеристики NET с клетками человека. Описанные здесь процедуры позволяют проанализировать морфологию NET (литическую или нелитическую) и состав (ДНК-белковые структуры и ферментативную активность), а также влияние растворимых факторов или клеточного контакта на такие характеристики. Кроме того, методы, описанные здесь, могут быть модифицированы для оценки влияния экзогенных растворимых факторов или клеточного контакта на композицию NET.
Применяемые методы включают очистку полиморфноядерных клеток из периферической крови человека с использованием градиента двойной плотности (1,079-1,098 г / мл), гарантируя оптимальную чистоту и жизнеспособность (≥ 95%), что продемонстрировано окрашиванием Райта, исключением трипан-синего и проточной цитометрией, включая анализ FSC против SSC и окрашивание 7AAD. Образование NET индуцируется микробными (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Candida albicans) и химическими (форбол миристата ацетат, HOCl) стимулами, а NETs характеризуются окрашиванием ДНК-DAPI, иммуноокрашиванием антимикробного пептида кателицидина (LL37) и количественной оценкой ферментативной активности (нейтрофильная эластаза, катепсин G и миелопероксидаза). Изображения получены с помощью флуоресцентной микроскопии и проанализированы с помощью ImageJ.

Чистота и жизнеспособность нейтрофилов Динамические клеточные фазы визуализируются в трубке от очистки градиента двойной плотности. Внутри этих слоев слой, соответствующий гранулоцитам, находится выше слоя плотности 1,079 г/мл, что отличается от фаз мононуклеоцитов перифери...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Здесь представлен протокол индукции и анализа внеклеточных ловушек нейтрофилов in vitro (NETs). Количественная оценка ДНК, кателицидина (LL37) и активности ферментов дала данные, которые показывают изменчивость состава и морфологии NETs, индуцированных микробными и химическими стимулами в аналогичных контролируемых условиях.

Морфологический и композиционный анализ внеклеточных ловушек нейтрофилов, индуцированных микробными и химическими раздражителями

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Этот протокол демонстрирует неоднородность в составе, структуре и морфологии внеклеточных ловушек нейтрофилов в зависимости от их индуцирующего стимула в сопоставимых условиях in vitro у нейтрофилов человека от здоровых людей. Получена высокая чистота и жизнеспособность нейтрофилов. Это позволяет сравнить концентрацию ДНК, LL-37 и активность ферментов миелопероксидазы, эластазы и катепсина G, высвобождаемых внеклеточными ловушками нейтрофилов.Этот протокол позволил проанализировать влияние растворимых факторов или клеточного контакта или возможных методов лечения или механизмов закрытия на выработку НЭТ при аутоиммунных заболеваниях. Эти методы могут помочь в исследовании аутоиммунных заболеваний. Из-за неконтролируемого размножения клеток НЭТ и длительности выравнивания их компонентов, которые считаются биомаркерами заболевания.Флуоресцентная микроскопия позволяет захватывать изображения NETs, показывающие дисперсию ДНК в ассоциации с белком, таким как LL37, который солидаризируется с микроорганизмами, помогая понять, как они появляются. Для начала выполните пункцию вены для сбора 10 миллилитров периферической крови в пробирках, содержащих дикалий ЭДТА в качестве антикоагулянта. Затем выполните стандартную биометрию крови и тест на С-реактивный белок, чтобы исключить инфекцию или воспаление, чтобы обеспечить качество образца.Центрифугирование образца периферической крови для удаления обогащенной тромбоцитами плазмы с последующей второй центрифугированием и отбрасывание оставшейся плазмы. Развести полученный пакет эритроцитов и лейкоцитов в объемном соотношении один к одному с одним 1X DPBS. Затем в стерильную стеклянную трубку размером 10 миллилитров сначала нанесите один миллилитр 1,08 г на раствор с плотностью миллилитра, а затем один миллилитр 1,079 грамма на раствор с плотностью миллилитра.Затем добавьте четыре миллилитра разбавленного эритроцита и лейкоцитарного пакета, перелив по стенкам. Центрифуга без ускорения или замедления, чтобы не нарушать градиент. Аспирировать фазу, соответствующую гранулоцитам и перенести в другую стерильную 10-миллилитровую стеклянную трубку.Вымойте четырьмя миллилитрами 1X DPBS при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант. Чтобы удалить оставшиеся эритроциты, обработайте клетки осмотическим шоком, добавив четыре миллилитра 0,2% физиологического раствора. Инкубировать в течение двух минут при четырех градусах Цельсия и центрифугировать.Откажитесь от супернатанта и добавьте четыре миллилитра 0,65% физиологического раствора. Инкубируйте в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы восстановить целостность мембраны и повторить центрифугирование. Удалите супернатант и повторно приостановите клетки в четырех миллилитрах 1X DPBS для удаления клеточного мусора.Снова центрифугируйте и повторно суспендируйте ячейку гранулы в двух миллилитрах холодного буфера HBSS. Чтобы выполнить тест на исключение трипанового синего цвета, разбавьте пять микролитров клеточной суспензии в 20 микролитрах 0,4% трипан-синего цвета. Подсчитайте клетки в новой камере и определите жизнеспособность клеток с помощью теста на исключение.Затем установите 5 микролитров клеточной суспензии на слайд и окрасьте пятном Райта в течение 15 секунд. Немедленно зафиксируйте образец, промыть дистиллированной водой и понаблюдать за морфологией под оптическим микроскопом. Далее добавляют один раз 10 к пятой клетке для проточных проточных пробирок цитометрии и окрашивают одним микролитром 7AAD в 100 микролитрах буфера FACS в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.Промывайте 500 микролитрами буфера FACS при 300 G в течение 10 минут. Зафиксируйте клетки 500 микролитрами 2% параформальдегида и храните при четырех градусах Цельсия до анализа проточной цитометрии. Для контроля мертвых клеток зафиксируйте клетки 200 микролитрами 4% параформальдегида в течение 30 минут и промывайте 500 микролитрами 1XPBS при 300 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Выбросьте супернатант и добавьте 200 микролитров 0,1% Triton X-100. Инкубировать в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Стирайте 500 микролитрами 1X PBS и окрашивайте 7AAD.Анализируйте полученные данные в программном обеспечении проточного цитометра. Загрузите файлы и дважды щелкните по незапятнанному файлу neutrophil. Выберите прямое рассеяние или FSC по оси X и боковое рассеяние или SSC по оси Y, чтобы отобразить популяцию клеток, соответствующую нейтрофилам.Затем выберите канал B3-A:PerCP vio 700-A по оси X, чтобы снять ограничение автофлуоресценции ячеек и выберите гистограмму по оси Y. Затем откройте окрашенный файл нейтрофилов. Выберите FSC на оси X и SSC на оси Y, чтобы отобразить популяцию клеток, соответствующую нейтрофилам.Опять же, выберите канал B3-A: PerCP vio 700-A, чтобы разграничить популяцию нейтрофилов, положительных на краситель 7AAD. Сгенерируйте окончательную гистограмму, щелкнув правой кнопкой мыши по окну и выбрав копировать в редактор макета. Добавьте бактериальные или грибковые псевдогифы в 1,5 миллилитровые микропробирки.Добавьте 200 микролитров, таким образом, пять микромоляров CFSC в 1X PBS. Перемешать и инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут в темноте. Остановите реакцию, добавив 500 микролитров декомплементированной плазмы и центрифуги.Выбросьте супернатант и промыть гранулу одним миллилитром 1XPBS центрифугированием. Затем повторно суспендировать микроорганизмы в 250 микролитрах 1X PBS. Подготовьте 50 микролитровых аликвот в 1,5 миллилитра микротрубках с двумя умноженными 10 на седьмую бактерию или два раза по 10 на пятую псевдогифаю для индукции NET.Поместите 10 на 10 миллиметров стерильной стеклянной крышки в 24-луночную пластину. Накрыть 10 микролитрами 0,001% поли l-лизина в течение одного часа при комнатной температуре и дважды промыть 100 микролитрами 1X PBS. Высушите воздухом и облучите ультрафиолетовым светом в течение 15 минут.Далее замените HBSS раствор нейтрофильной суспензии, приготовленной ранее, на среду RPMI 1640, дополненную 10% термодемпляционной аутологичной плазмой. Добавьте 350 микролитров этой клеточной суспензии в 24-луночную пластину для конечной концентрации в два раза 10 до пятого нейтрофилов на лунку. Инкубируйте пластину в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом, чтобы ячейки прилипали к дну скважин.Чтобы индуцировать образование сети, добавьте стимулы бактерий MOI100 и псевдогифы в MOI1. Также добавьте биохимические раздражители и подготовьте контроль без стимула, добавив 50 микролитров HBSS. Получите конечный объем 400 микролитров на лунку и перемешайте на пластинчатом шейкере при 140 об/мин в течение 30 секунд.Затем инкубируют в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. После чистой индукции удалите супернатант из скважин путем тщательной пипетки и зафиксируйте ячейки 300 микролитрами 4% параформальдегида в течение 30 минут. Промыть ячейки 200 микролитрами 1X PBS без центрифугирования и добавить 200 микролитров блокирующего буфера в течение 30 минут.Для окрашивания LL37 проницайте клетки 200 микролитрами 0,2% Triton X-100 в 1X PBS в течение 10 минут и дважды промывайте 1X PBS. Установите крышку на стеклянные горки. ДНК окрашивает клетки двумя микролитрами DAPI и хранится при минус 20 градусах Цельсия до анализа конфокальной флуоресцентной микроскопией.Динамические клеточные фазы визуализировали после очистки с двойным градиентом плотности. Типичная морфология нейтрофилов была подтверждена правильным окрашиванием. Клетки также показали оптимальную жизнеспособность, наблюдаемую при исключении синего трипана без нарушения мембраны.Анализ SSC в сравнении с FSC методом проточной цитометрии подтвердил популяцию, соответствующую PMN, с высокой чистотой клеток. Точечные графики PMN для неокрашенных клеток по сравнению с клетками окрашивания 7AAD и их соответствующими гистограммами указывали на высокую жизнеспособность клеток в свежеизолированных нейтрофилах по сравнению с пермеабилизированными контрольными клетками. После стимуляции нейтрофилов химическими и микробными стимуляторами НЭТ визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием ДНК DPI и анти-LL37.Микроорганизмы были предварительно окрашены CFSE. Образование суицидальной сети, вызванное PMA, указывается на колокализацию с LL37. В то время как NETs, сформированные с помощью HOCI, показали незначительную дисперсию ДНК во внеклеточном пространстве, которая соответствовала жизненно важному образованию NET.NET, индуцированная грибковыми псевдогифаами, показала низкие концентрации ДНК, высвобождаемой во внеклеточное пространство с нитевидными структурами, характерными для жизненно важного образования NET. S.aureus показал жизненно важное образование NET, тогда как P.aeruginosa индуцировал высвобождение больших концентраций ДНК с мутной морфологией, которая совместно локализовалась с LL37, что указывает на образование NET самоубийства. Выполнение методики градиента двойной плотности позволяет получить высокую чистоту и жизнеспособность нейтрофилов.И мы поднимаем стирки, избегаем повреждения их структуры. Следуя этому методу, мы можем проанализировать влияние веществ или клеток на производство NET, а также то, участвуют ли они в каком-либо механизме или их использовании в качестве терапии при аутоиммунных заболеваниях.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Визуализация внеклеточного ловушки макрофагов с помощью конфокальной микроскопии

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

В пробирке Формирование собак нейтрофилов внеклеточного ловушка: Динамические и количественный анализ по микроскопии флуоресцирования

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Идентификация нейтрофилов Внеклеточных Ловушек в Параффина-embedded Feartline артериальных тромби с использованием иммунофлюоресценционной микроскопии

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Количественная оценка комплексов миелопероксидаза-ДНК и нейтрофильной эластазы-ДНК из нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием модифицированного сэндвич-ИФА

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Иммунофлуоресцентная визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в тканях человека и мыши

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...