Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
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Este trabajo fue apoyado por una beca de ciencias básicas (#285480) del CONACyT y por el Departamento de Investigación en Inmunología Clínica de la Facultad de Ciencias Bioquímicas de la Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L, y W.J.R.R. tienen becas doctorales de CONACyT números #799779, #660793 y #827788, respectivamente.

Las muestras de sangre se obtuvieron como donaciones de participantes clínicamente sanos después del consentimiento informado. Todos los experimentos se realizaron con el permiso del Comité de Ética en Investigación Humana de la Facultad de Ciencias Bioquímicas de la Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.
NOTA: Los criterios de inclusión en el estudio fueron sexo y edad indistintos, y clínicamente sanos de acuerdo con las respuestas de los participantes a un cuestionario ant...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

Se debe obtener una población altamente pura de neutrófilos viables para inducir la liberación de TNE, ya que estas células tienen una vida útil ex vivo limitada de 8 h en promedio, un período dentro del cual se deben realizar todos los experimentos. Para ello, la metodología ideal es el gradiente de doble densidad para optimizar el tiempo de purificación mediante el aislamiento de células no activadas más sensibles a la estimulación exógena, en contraste con el gradiente de Ficoll-Histopaque o las t...

Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en el torrente sanguíneo, desempeñando un papel esencial durante la eliminación de agentes patógenos por varios mecanismos, incluyendo la liberación de grandes estructuras de cromatina compuestas de ADN y varias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas y granulares 1,2. El antecedente directo que describe este papel antimicrobiano de los neutrófilos fue elaborado por Takei et al.3 en 1996. Estos autores relataron una nueva forma de muerte diferente de la apoptosis y necroptosis en neutrófilos, mostraron cambios morfológicos que exhibieron ruptura nuclear, seguido de derrame del nucleoplasma hacia el citoplasma, y un aumento en la permeabilidad de la membrana a partir de 3 h de incubación con acetato de forbol miristato (PMA)2,3. Sin embargo, no fue hasta 2004 que se utilizó el término "trampas extracelulares de neutrófilos (TNE)"4.
Se ha observado la formación de NET en diversas afecciones, como infecciones bacterianas, fúngicas5,virales 6 y parasitarias, para neutralizar, matar y prevenir la diseminación microbiana7. Otros estudios muestran que también puede ocurrir en condiciones no patógenas por estímulos estériles, como citoquinas, ácido úrico monosódico o cristales de colesterol, autoanticuerpos, complejos inmunes y plaquetas activadas7. El lipopolisacárido (LPS), la interleucina-8 (IL-8) y el PMA estuvieron entre los primeros estímulos in vitro descritos como inductores de NET, y la participación in vivo de NET en procesos patogénicos se demostró en dos modelos de inflamación aguda: disentería experimental y apendicitis humana espontánea4. El ADN es un componente NET esencial. Su estructura y composición apropiadas son necesarias para el secuestro y la muerte de microorganismos mediante la entrega de una alta concentración local de moléculas antimicrobianas hacia los microbios capturados, como lo demuestra un breve tratamiento con desoxirribonucleasa (DNasa) que desintegra los NET y sus propiedades microbicidas4. Además del ADN, los NET comprenden proteínas unidas como histonas, elastasa de neutrófilos (NE), catepsina G (CG), proteinasa 3, lactoferrina, gelatinasa, mieloperoxidasa (MPO) y péptidos antimicrobianos (AMP) como el péptido proinflamatorio catiónico catelicidina LL-37 entre otros 8,9. Tales agregados pueden formar hilos más grandes con diámetros de hasta 50 nm. Estos factores pueden alterar los factores de virulencia microbiana o la integridad de la membrana celular patógena; además, los AMPs pueden estabilizar el ADN derivado de NET contra la degradación por nucleasas bacterianas10.
Los mecanismos específicos que regulan la formación de NET aún no se han aclarado completamente. La vía mejor caracterizada que conduce a la liberación de NET es a través de la señalización ERK, que conduce a la activación de la NADPH oxidasa y a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como al aumento del calcio intracelular que desencadena la activación de la vía MPO. Esto a su vez transforma el peróxido de hidrógeno en ácido hipocloroso, activando NE por oxidación11,12. NE es responsable de degradar los filamentos de actina del citoesqueleto para bloquear la fagocitosis y translocarlos al núcleo para su procesamiento por escisión proteolítica y desaminación por PAD4 que impulsan la desensibilización de las fibras de cromatina, que se asocian con proteínas granulares y citoplasmáticas, y luego se liberan extracelularmente7. Estas proteasas incluyen las liberadas por el complejo azurosómico de los gránulos azurófilos y otras proteasas como la catepsina G13.
Dependiendo de los cambios morfológicos en los neutrófilos, los TNE se clasifican en dos tipos: formación de NET suicida o lítica que conduce a la muerte celular4, y formación de NET vital o no lítica producida por células viables mediadas por una liberación vesicular de ADN nuclear o mitocondrial, con un remanente de un citoplasto anucleado con capacidad fagocítica14,15. Generalmente, los NET compuestos de ADN mitocondrial presentan una morfología de fibra alargada14, mientras que los estructurados de ADN nuclear tienen una apariencia de nube3. Sin embargo, no se sabe cómo el neutrófilo elige su origen de ADN. Contrariamente a estudios previos que describieron las vías canónicas de los NET como que requieren varias horas, la vía vital se activa rápidamente en solo 5-60 min15.
A pesar de estos avances, la composición NET varía dependiendo del estímulo; por ejemplo, diferentes cepas mucoides y no mucoides de P. aeruginosa inducen la formación de NET que contienen 33 proteínas comunes y hasta 50 proteínas variables7. Así, es necesario homogeneizar técnicas que permitan la generación de conclusiones objetivas en los grupos de investigación. Este artículo describe un protocolo con diversas técnicas que permiten comparar y evaluar la composición, estructura y morfología de los TNE inducidos con diferentes microorganismos: Staphylococcus aureus (bacteria grampositiva), Pseudomonas aeruginosa (bacteria gramnegativa) y Candida albicans (hongo), así como estímulos químicos (PMA, HOCl) en neutrófilos humanos de individuos sanos. Los resultados representativos demuestran la heterogeneidad de los TNE dependiendo de su estímulo inductor en condiciones in vitro comparables, caracterizadas por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para LL37 y cuantificación de la actividad enzimática (NE, CG y MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Los neutrófilos funcionan como la primera línea de defensa celular en una respuesta inmune innata mediante el empleo de diversos mecanismos, como la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). Este estudio analiza los cambios morfológicos y de composición en los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos utilizando metodologías estandarizadas in vitro para la inducción y caracterización de NET con células humanas. Los procedimientos descritos aquí permiten el análisis de la morfología NET (lítica o no lítica) y la composición (estructuras ADN-proteína y actividad enzimática), y el efecto de los factores solubles o el contacto celular sobre dichas características. Además, las técnicas descritas aquí podrían modificarse para evaluar el efecto de los factores solubles exógenos o el contacto celular en la composición de NET.
Las técnicas aplicadas incluyen la purificación de células polimorfonucleares de sangre periférica humana utilizando un gradiente de doble densidad (1.079-1.098 g/mL), garantizando una pureza y viabilidad óptimas (≥ 95%) como lo demuestra la tinción de Wright, la exclusión de azul de tripano y la citometría de flujo, incluido el análisis FSC versus SSC y la tinción 7AAD. La formación de NET se induce con estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans) y químicos (acetato de forbol miristato, HOCl), y los NET se caracterizan por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para el péptido antimicrobiano catelicidina (LL37) y cuantificación de la actividad enzimática (elastasa de neutrófilos, catepsina G y mieloperoxidasa). Las imágenes se adquieren a través de microscopía de fluorescencia y se analizan con ImageJ.

Pureza y viabilidad de los neutrófilos Las fases celulares dinámicas se visualizan en el tubo a partir de la purificación de gradiente de doble densidad. Dentro de estas capas, la capa correspondiente a los granulocitos está por encima de la capa de densidad de 1,079 g/ml, que se distingue de las fases de los mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) y eritrocitos (Figura 1A). La morfología de las células purificadas se verificó con la tinción de Wright mediant...

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Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Este protocolo demuestra la heterogeneidad en la composición, estructura y morfología de las trampas extracelulares de neutrófilos, dependiendo de su estímulo inductor en condiciones in vitro comparables en neutrófilos humanos de individuos sanos. Se obtiene una alta pureza y viabilidad de neutrófilos. Eso permite comparar la concentración de ADN, LL-37, y la actividad enzimática de la mieloperoxidasa, elastasa y catepsina G, liberadas por trampas extracelulares de neutrófilos.Este protocolo permitió analizar el efecto de factores solubles o de contacto celular o posibles terapias o mecanismos de cierre sobre la producción de TNE en enfermedades autoinmunes. Estos métodos pueden ayudar en la investigación de enfermedades autoinmunes. Debido a la reproducción celular incontrolada de los TNE y la duración de la alineación de sus componentes, que se consideran biomarcadores de la enfermedad.La microscopía de fluorescencia permite capturar imágenes de NET que muestran la dispersión del ADN en asociación con proteínas como LL37, que se co-localizan con microorganismos ayudando a entender cómo están apareciendo. Para comenzar, realice la punción de la vena para recolectar 10 mililitros de sangre periférica en tubos que contienen EDTA dipotásico como anticoagulante. Luego realice una biometría sanguínea estándar y una prueba de proteína C reactiva para descartar una infección o inflamación para garantizar la calidad de la muestra.Centrifugar la muestra de sangre periférica para eliminar el plasma rico en plaquetas, seguido de una segunda centrifugación y desechar el plasma restante. Diluya el paquete de eritrocitos y leucocitos resultante en una relación de volumen de uno a uno con un DPBS 1X. Luego, en un tubo de vidrio estéril de 10 mililitros, primero deposite un mililitro de solución de densidad de 1.08 gramos por mililitro seguido de un mililitro de solución de densidad de 1.079 gramos por mililitro.Luego, agregue cuatro mililitros del paquete diluido de eritrocitos y leucocitos vertiendo sobre las paredes. Centrífuga sin aceleración ni desaceleración para evitar perturbar la pendiente. Aspirar la fase correspondiente a los granulocitos y transferir a otro tubo de vidrio estéril de 10 mililitros.Lavar con cuatro mililitros de 1X DPBS a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Para eliminar los eritrocitos restantes, trate las células con shock osmótico agregando cuatro mililitros de solución salina al 0,2%. Incubar durante dos minutos a cuatro grados centígrados y centrifugar.Deseche el sobrenadante y agregue cuatro mililitros de solución salina al 0,65%. Incubar durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para restaurar la integridad de la membrana y repetir la centrifugación. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en cuatro mililitros de 1X DPBS para eliminar los desechos celulares.Nuevamente, centrifugar y volver a suspender el pellet celular en dos mililitros de tampón HBSS frío. Para realizar una prueba de exclusión de azul de tripano, diluir cinco microlitros de la suspensión celular en 20 microlitros de azul de tripano al 0,4%. Cuente las células en una nueva cámara de arco y determine la viabilidad celular mediante una prueba de exclusión.Luego, monte 5 microlitros de la suspensión celular en un portaobjetos y tiñe con la tinción de Wright durante 15 segundos. Fije inmediatamente la muestra, lávela con agua destilada y observe la morfología bajo un microscopio óptico. A continuación, agregue una vez 10 a las quintas células para fluir tubos de citometría y tiñe con un microlitro de 7AAD en 100 microlitros de tampón FACS durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Lavar con 500 microlitros de tampón FACS a 300 G durante 10 minutos. Fijar las células con 500 microlitros de paraformaldehído al 2% y almacenar a cuatro grados centígrados hasta el análisis de citometría de flujo. Para un control de células muertas, fije las células con 200 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos y lave con 500 microlitros de 1XPBS a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 0.1% Triton X-100. Incubar durante una hora a cuatro grados centígrados. Lavar con 500 microlitros de 1X PBS y manchar con 7AAD.Analice los datos capturados en el software del citómetro de flujo. Cargue los archivos y haga doble clic en el archivo de neutrófilos sin teñir. Elija dispersión directa o FSC en el eje X y dispersión lateral o SSC en el eje Y para mostrar la población celular correspondiente a los neutrófilos.Luego seleccione el canal B3-A: PerCP vio 700-A en el eje X para delimitar la autofluorescencia de las células y elija el histograma en el eje Y. Luego, abra el archivo de neutrófilos teñido. Elija FSC en el eje X y SSC en el eje Y para mostrar la población celular correspondiente a los neutrófilos.De nuevo, seleccione el canal B3-A:PerCP vio 700-A para delimitar la población de neutrófilos positivos para el colorante 7AAD. Genere el histograma final haciendo clic derecho en la ventana y seleccionando copiar al editor de diseño. Agregue pseudohifas bacterianas o fúngicas en microtubos de 1.5 mililitros.Agregue 200 microlitros, por lo que cinco CFSC micromolares en 1X PBS. Mezclar e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos en la oscuridad. Detenga la reacción agregando 500 microlitros de plasma descomplementado y centrífuga.Deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de 1XPBS con centrifugación. Luego vuelva a suspender los microorganismos en 250 microlitros de 1X PBS. Preparar alícuotas de 50 microlitros en microtubos de 1,5 mililitros con dos veces 10 a la séptima bacteria o dos veces 10 a la quinta pseudohifas para la inducción NET.Coloque los resbalones de cubierta de vidrio estéril de 10 por 10 milímetros en una placa de 24 pocillos. Cubrir con 10 microlitros de 0.001% poli l-lisina durante una hora a temperatura ambiente y lavar dos veces con 100 microlitros de 1X PBS. Secar al aire e irradiar con luz UV durante 15 minutos.A continuación, reemplace la solución HBSS de la suspensión de neutrófilos preparada anteriormente con RPMI 1640 medio suplementado con plasma autólogo descomplementado con calor al 10%. Agregue 350 microlitros de esta suspensión celular a la placa de 24 pocillos para una concentración final de dos veces 10 a la quinta de neutrófilos por pocillo. Incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para permitir que las células se adhieran al fondo de los pocillos.Para inducir la formación de redes, agregue los estímulos bacterianos MOI100 y pseudohifas en MOI1. También agregue los estímulos bioquímicos y prepare un control sin estímulo agregando 50 microlitros de HBSS. Obtener un volumen final de 400 microlitros por pocillo y mezclar en un agitador de placas a 140 RPM durante 30 segundos.Luego incubar durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la inducción neta, retire el sobrenadante de los pocillos pipeteando cuidadosamente y fije las células con 300 microlitros de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. Lave las células con 200 microlitros de 1X PBS sin centrifugar y agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos.Para la tinción LL37, permeabilizar las células con 200 microlitros de 0,2% Triton X-100 en 1X PBS durante 10 minutos y lavar con 1X PBS dos veces. Monte los deslizamientos de la cubierta en portaobjetos de vidrio. El ADN tiñe las células con dos microlitros de DAPI y se almacenan a menos 20 grados centígrados hasta el análisis por microscopía de fluorescencia confocal.Las fases celulares dinámicas se visualizaron después de la purificación de gradiente de doble densidad. La morfología típica de neutrófilos se confirmó mediante tinción derecha. Las células también mostraron una viabilidad óptima observada por exclusión de azul de tripano sin interrupción de la membrana.El análisis de SSC versus FSC por citometría de flujo confirmó una población correspondiente a PMN con alta pureza celular. Los diagramas de puntos PMN para células no teñidas versus células de tinción 7AAD y sus respectivos histogramas indicaron una alta viabilidad celular en los neutrófilos recién aislados en comparación con las células de control permeabilizadas. Después de estimular los neutrófilos con estimulantes químicos y microbianos, los NET fueron visualizados por microscopía de fluorescencia utilizando ADN DPI y anti-LL37.Los microorganismos fueron pre-teñidos con CFSE. Formación neta suicida inducida por PMA indicada por colocalización con LL37. Mientras que los NET formados con HOCI mostraron una dispersión menor de ADN en el espacio extracelular que correspondía a la formación de NET vital.NET inducida por pseudohifas fúngicas mostró bajas concentraciones de ADN liberado en el espacio extracelular con estructuras filamentosas características de la formación vital de NET. S.aureus mostró formación vital de NET mientras que P.aeruginosa indujo la liberación de grandes concentraciones de ADN con una morfología turbia que co-localizada con LL37 indicando formación de NET suicida. Realizar la metodología de gradiente de doble densidad nos permite obtener una alta pureza y viabilidad de los neutrófilos.Y elevamos los lavados, evitamos dañar la estructura de los mismos. Siguiendo este método podemos analizar el efecto de sustancias o células en la producción de NET así como si están implicadas en algún mecanismo o su uso como terapias en enfermedades autoinmunes.

Research

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