Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett grundvetenskapligt bidrag (#285480) från CONACyT och av institutionen för klinisk immunologiforskning vid fakulteten för biokemiska vetenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L och W.J.R.R. har doktorandstipendier med CONACyT-nummer #799779, #660793 respektive #827788.

Blodproverna erhölls som donationer från kliniskt friska deltagare efter informerat samtycke. Alla experiment utfördes med tillstånd från kommittén för mänsklig forskningsetik vid fakulteten för biokemiska vetenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' i Oaxaca.
OBS: Inklusionskriterierna i studien var otydligt kön och ålder och kliniskt friska enligt deltagarnas svar på ett frågeformulär innan ett blodprov togs. En hematologisk analys utfördes för att bestämma cellantale...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

En mycket ren population av viabla neutrofiler måste erhållas för att inducera frisättning av NET eftersom dessa celler har en begränsad ex vivo-livslängd på i genomsnitt 8 timmar, en period inom vilken alla experiment måste utföras. För detta ändamål är den ideala metoden dubbeldensitetsgradienten för att optimera reningstiden genom att isolera icke-aktiverade celler som är mer mottagliga för exogen stimulering, i motsats till Ficoll-Histopaque-gradient eller Dextran sedimenteringstekniker<sup c...

Neutrofiler är de vanligaste leukocyterna i blodomloppet och spelar en viktig roll under clearance av patogena medel genom flera mekanismer, inklusive frisättning av stora kromatinstrukturer som består av DNA och flera nukleära, cytoplasmatiska och granulära antibakteriella proteiner 1,2. Den direkta antecedenten som beskriver denna antimikrobiella roll av neutrofiler gjordes av Takei et al.3 1996. Dessa författare rapporterade en ny form av död som skiljer sig från apoptos och nekroptos hos neutrofiler, visade morfologiska förändringar som uppvisade kärnbrott, följt av spillning ur nukleoplasman i cytoplasman och en ökning av membranpermeabiliteten från 3 timmars inkubation med forbolmyristatacetat (PMA)2,3. Det var dock inte förrän 2004 som termen "neutrofila extracellulära fällor (NET)" användes4.
NET-bildning har observerats under olika förhållanden, såsom bakteriella, svamp5, virus6 och parasitinfektioner, för att neutralisera, döda och förhindra mikrobiell spridning7. Andra studier visar att det också kan förekomma vid icke-patogena tillstånd genom sterila stimuli, såsom cytokiner, mononatrium urinsyra eller kolesterolkristaller, autoantikroppar, immunkomplex och aktiverade blodplättar7. Lipopolysackarid (LPS), interleukin-8 (IL-8) och PMA var bland de första in vitro-stimuli som beskrivs som NET-inducerare, och in vivo NET-involvering i patogena processer demonstrerades i två modeller av akut inflammation: experimentell dysenteri och spontan human blindtarmsinflammation4. DNA är en viktig NET-komponent. Dess lämpliga struktur och sammansättning är nödvändiga för att binda och döda mikroorganismer genom att leverera en hög lokal koncentration av antimikrobiella molekyler mot de fångade mikroberna, vilket framgår av en kort deoxiribonukleasbehandling (DNase) som sönderdelar NET och deras mikrobicida egenskaper4. Förutom DNA består NET av bundna proteiner såsom histoner, neutrofilt elastas (NE), cathepsin G (CG), proteinas 3, laktoferrin, gelatinas, myeloperoxidas (MPO) och antimikrobiella peptider (AMP) såsom den katjoniska proinflammatoriska peptiden cathelicidin LL-37 bland andra 8,9. Sådana aggregat kan bilda större trådar med diametrar upp till 50 nm. Dessa faktorer kan störa de mikrobiella virulensfaktorerna eller patogencellmembranets integritet; Dessutom kan AMP: erna stabilisera det NET-härledda DNA: t mot nedbrytning av bakteriella nukleaser10.
De specifika mekanismer som reglerar NET-bildning har ännu inte klargjorts fullständigt. Den bäst karakteriserade vägen som leder till NET-frisättning är genom ERK-signalering, vilket leder till NADPH-oxidasaktivering och produktion av reaktiva syrearter (ROS), samt ökat intracellulärt kalcium som utlöser aktivering av MPO-vägen. Detta omvandlar i sin tur väteperoxid till hypoklorsyra och aktiverar NE genom oxidation11,12. NE är ansvarig för att bryta ner cytoskelettens aktinfilament för att blockera fagocytos och translokera dem till kärnan för bearbetning genom proteolytisk klyvning och deaminering av PAD4 som driver desensibiliseringen av kromatinfibrer, som associerar med granulat och cytoplasmatiska proteiner, och frigörs sedan extracellulärt7. Dessa proteaser innefattar de som frigörs från azurosomkomplexet av azurofilgranulerna och andra proteaser, såsom cathepsin G13.
Beroende på de morfologiska förändringarna i neutrofiler klassificeras NET i två typer: suicidal eller lytisk NET-bildning som leder till celldöd4 och vital eller icke-lytisk NET-bildning producerad av livskraftiga celler medierade av en vesikulär frisättning av kärn- eller mitokondriellt DNA, med en rest av en anucleated cytoplast med fagocytisk förmåga14,15. I allmänhet presenterar NETs som består av mitokondriellt DNA en långsträckt fiber14-morfologi, medan de som är strukturerade av kärn-DNA har ett molnliknande utseende3. Det är emellertid inte känt hur neutrofilen väljer sitt DNA-ursprung. I motsats till tidigare studier som beskrev de kanoniska vägarna för NETs som kräver flera timmar, aktiveras den vitala vägen snabbt på bara 5-60 min15.
Trots dessa framsteg varierar NET-sammansättningen beroende på stimulansen; till exempel inducerar olika mucoid- och icke-mucoidstammar av P. aeruginosa bildandet av NET innehållande 33 vanliga proteiner och upp till 50 variabla proteiner7. Således är det nödvändigt att homogenisera tekniker som möjliggör generering av objektiva slutsatser i forskargrupper. Detta papper beskriver ett protokoll med olika tekniker som möjliggör jämförelse och utvärdering av sammansättningen, strukturen och morfologin hos NETs inducerad med olika mikroorganismer: Staphylococcus aureus (grampositiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gramnegativ bakterie) och Candida albicans (svamp), liksom kemiska stimuli (PMA, HOCl) i humana neutrofiler från friska individer. De representativa resultaten visar heterogeniteten hos NETs beroende på deras inducerande stimulans under jämförbara in vitro-förhållanden, kännetecknade av DNA-DAPI-färgning, immunfärgning för LL37 och kvantifiering av enzymatisk aktivitet (NE, CG och MPO).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Neutrofiler fungerar som den första linjen av cellulärt försvar i ett medfött immunsvar genom att använda olika mekanismer, såsom bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET). Denna studie analyserar de morfologiska och kompositionella förändringarna i NET inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli med hjälp av standardiserade in vitro-metoder för NET-induktion och karakterisering med mänskliga celler. De förfaranden som beskrivs här möjliggör analys av NET-morfologi (lytisk eller icke-lytisk) och komposition (DNA-proteinstrukturer och enzymatisk aktivitet) och effekten av lösliga faktorer eller cellulär kontakt på sådana egenskaper. Dessutom kan de tekniker som beskrivs här modifieras för att utvärdera effekten av exogena lösliga faktorer eller cellulär kontakt på NET-kompositionen.
De tillämpade teknikerna inkluderar rening av polymorfonukleära celler från humant perifert blod med hjälp av en dubbeldensitetsgradient (1,079-1,098 g / ml), vilket garanterar optimal renhet och livskraft (≥ 95%) vilket demonstreras av Wrights färgning, trypanblå uteslutning och flödescytometri, inklusive FSC kontra SSC-analys och 7AAD-färgning. NET-bildning induceras med mikrobiella (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus och Candida albicans) och kemiska (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, och NETs kännetecknas av DNA-DAPI-färgning, immunfärgning för den antimikrobiella peptiden cathelicidin (LL37) och kvantifiering av enzymatisk aktivitet (neutrofilt elastas, cathepsin G och myeloperoxidas). Bilderna förvärvas genom fluorescensmikroskopi och analyseras med ImageJ.

Renhet och livskraft hos neutrofiler De dynamiska cellfaserna visualiseras i röret från dubbeldensitetsgradientreningen. Inom dessa skikt ligger skiktet som motsvarar granulocyter över densitetsskiktet på 1,079 g / ml, som skiljer sig från faserna av mononukleocyter i perifert blod (PBMC) och erytrocyter (figur 1A). De renade cellernas morfologi verifierades med Wrights färgning genom att observera celler med segmenterade kärnor kopplade till trådliknande filament...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Här presenteras ett protokoll för induktion och analys av in vitro neutrofila extracellulära fällor (NET). Kvantifiering av DNA, kathelicidin (LL37) och enzymaktivitet gav data som visar variationen i sammansättningen och morfologin hos NET inducerad av mikrobiella och kemiska stimuli under liknande kontrollerade förhållanden.

Morfologisk och kompositionell analys av neutrofila extracellulära fällor inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Detta protokoll visar heterogeniteten i sammansättning, struktur och morfologi hos neutrofila extracellulära fällor, beroende på deras inducerande stimulans under jämförbara in vitro-förhållanden i humana neutrofiler från friska individer. Hög neutrofil renhet och livskraft erhålls. Det gör det möjligt att jämföra koncentrationen av DNA, LL-37 och enzymaktivitet av myeloperoxidas, elastas och cathepsin G, frigjord av neutrofila extracellulära fällor.Detta protokoll gjorde det möjligt att analysera effekten av lösliga faktorer eller cellulär kontakt eller möjliga terapier eller mekanismer för att stänga produktionen av NET vid autoimmun sjukdom. Dessa metoder kan hjälpa till vid utredning av autoimmun sjukdom. På grund av den okontrollerade cellreproduktionen av NET och varaktigheten av anpassa deras komponenter, vilka anses vara biomarkörer för sjukdomen.Fluorescensmikroskopi gör det möjligt att fånga bild av NET som visar spridningen av DNA i samband med protein som LL37, som samlokaliseras med mikroorganismer som hjälper till att förstå hur de ser ut. För att börja, utför vena punktering för att samla 10 ml perifert blod i rör som innehåller dipotassium EDTA som antikoagulant. Utför sedan standard blodbiometri och C-reaktivt proteintest för att utesluta infektion eller inflammation för att säkerställa provets kvalitet.Centrifugera det perifera blodprovet för att avlägsna den trombocytrika plasman, följt av en andra centrifugering och kassera den återstående plasman. Späd det resulterande erytrocyt- och leukocytpaketet i ett-till-ett-volymförhållande med en 1X DPBS. Sedan, i ett sterilt 10 ml glasrör, deponera först en milliliter 1,08 gram per milliliter densitetslösning följt av en milliliter 1,079 gram per milliliter densitetslösning.Tillsätt sedan fyra milliliter av det utspädda erytrocyt- och leukocytpaketet genom att hälla över väggarna. Centrifugera utan acceleration eller retardation för att undvika att störa lutningen. Aspirera fasen som motsvarar granulocyter och överför till ett annat sterilt 10 ml glasrör.Tvätta med fyra milliliter 1X DPBS vid 300 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten. För att avlägsna de återstående erytrocyterna, behandla cellerna med osmotisk chock genom att tillsätta fyra milliliter 0,2% saltlösning. Inkubera i två minuter vid fyra grader Celsius och centrifugera.Kassera supernatanten och tillsätt fyra milliliter 0,65% saltlösning. Inkubera i fem minuter vid fyra grader Celsius för att återställa membranintegriteten och upprepa centrifugeringen. Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen i fyra milliliter 1X DPBS för att ta bort cellulärt skräp.Återigen, centrifugera och suspendera cellpelleten i två milliliter kall HBSS-buffert. För att utföra ett trypanblått uteslutningstest, späd fem mikroliter av cellsuspensionen i 20 mikroliter 0,4% trypanblå. Räkna cellerna i en ny bowerkammare och bestäm cellviabiliteten med hjälp av ett uteslutningstest.Montera sedan 5 mikroliter av cellsuspensionen på en bild och fläcka med Wrights fläck i 15 sekunder. Fixa omedelbart provet, tvätta med destillerat vatten och observera morfologin under ett optiskt mikroskop. Lägg sedan till en gånger 10 till de femte cellerna för att flöda cytometrirör och fläcka med en mikroliter 7AAD i 100 mikroliter FACS-buffert i 15 minuter vid fyra grader Celsius i mörkret.Tvätta med 500 mikroliter FACS-buffert vid 300 G i 10 minuter. Fixera cellerna med 500 mikroliter 2% paraformaldehyd och förvara vid fyra grader Celsius tills flödescytometrianalys. För en död cellkontroll, fixa cellerna med 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minuter och tvätta med 500 mikroliter 1XPBS vid 300 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Kassera supernatanten och tillsätt 200 mikroliter 0,1% Triton X-100. Inkubera i en timme vid fyra grader Celsius. Tvätta med 500 mikroliter 1X PBS och fläcka med 7AAD.Analysera insamlade data i flödescytometerprogramvaran. Ladda filerna och dubbelklicka på den ofärgade neutrofilfilen. Välj framåtriktad punkt eller FSC på X-axeln och sidopunktspunkten eller SSC på Y-axeln för att visa cellpopulationen som motsvarar neutrofiler.Välj sedan kanalen B3-A: PerCP vio 700-A på X-axeln för att avgränsa cellernas autofluorescens och välj histogram på Y-axeln. Öppna sedan den färgade neutrofilfilen. Välj FSC på X-axeln och SSC på Y-axeln för att visa cellpopulationen som motsvarar neutrofiler.Återigen, välj kanalen B3-A: PerCP vio 700-A för att avgränsa populationen av neutrofiler som är positiva för färgämnet 7AAD. Generera det slutliga histogrammet genom att högerklicka på fönstret och välja kopiera till layoutredigeraren. Tillsätt bakteriell eller svamp pseudohyfer i 1,5 ml mikrorör.Tillsätt 200 mikroliter, så fem mikromolar CFSC i 1X PBS. Blanda och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter i mörkret. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 500 mikroliter desupplementerad plasma och centrifug.Kassera supernatanten och tvätta pelleten med en milliliter 1XPBS med centrifugering. Suspendera sedan mikroorganismerna i 250 mikroliter 1X PBS. Förbered 50 mikroliter alikvoter i 1,5 ml mikrorör med två gånger 10 till den sjunde bakterien eller två gånger 10 till den femte pseudohyphae för NET-induktion.Placera 10 x 10 millimeter sterilt glaslock i en 24-brunnsplatta. Täck med 10 mikroliter 0,001% poly l-lysin i en timme vid rumstemperatur och tvätta två gånger med 100 mikroliter 1X PBS. Lufttorka och bestråla med UV-ljus i 15 minuter.Byt sedan ut HBSS-lösningen av den neutrofila suspensionen som framställts tidigare med RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmedecomplementerad autolog plasma. Tillsätt 350 mikroliter av denna cellsuspension till 24-brunnsplattan för en slutlig koncentration av två gånger 10 till de femte neutrofilerna per brunn. Inkubera plattan i 20 minuter vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid så att cellerna kan fästa vid botten av brunnarna.För att inducera nettobildning, tillsätt bakteriestimuli MOI100 och pseudohyfer vid MOI1. Lägg också till de biokemiska stimuli och förbered en kontroll utan stimulans genom att tillsätta 50 mikroliter HBSS. Få en slutlig volym på 400 mikroliter per brunn och blanda på en tallriksskakare vid 140 varv / min i 30 sekunder.Inkubera sedan i fyra timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter nätinduktion, ta bort supernatanten från brunnarna genom att pipettera försiktigt och fixera cellerna med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minuter. Tvätta cellerna med 200 mikroliter 1X PBS utan centrifugering och tillsätt 200 mikroliter blockerande buffert i 30 minuter.För LL37-fläck, permeabilisera cellerna med 200 mikroliter 0,2% Triton X-100 i 1X PBS i 10 minuter och tvätta med 1X PBS två gånger. Montera lockets glidningar på glasskivor. DNA färgar cellerna med två mikroliter DAPI och lagrar vid minus 20 grader Celsius tills analys med konfokal fluorescensmikroskopi.De dynamiska cellfaserna visualiserades efter dubbel densitetsgradientrening. Den typiska neutrofila morfologin bekräftades genom rätt färgning. Cellerna visade också optimal livskraft observerad genom trypanblå uteslutning utan membranavbrott.Analys av SSC kontra FSC genom flödescytometri bekräftade en population som motsvarar PMN med hög cellrenhet. PMN-punktdiagram för ofärgade celler kontra 7AAD-fläckceller och deras respektive histogram indikerade en hög cellviabilitet i de nyligen isolerade neutrofilerna jämfört med de permeabiliserade kontrollcellerna. Efter att ha stimulerat neutrofilerna med kemiska och mikrobiella stimulanser visualiserades NET genom fluorescensmikroskopi med hjälp av DNA DPI och anti-LL37.Mikroorganismerna var förfärgade med CFSE. PMA-inducerad suicidal nettobildning indikerad genom samlokalisering med LL37. Medan NETs bildade med HOCI visade mindre DNA-dispersion i det extracellulära utrymmet som motsvarade vital NET-bildning.NET inducerat av svamp pseudohyfer visade låga koncentrationer av DNA som släpptes ut i det extracellulära utrymmet med trådformiga strukturer som är karakteristiska för den vitala NET-bildningen. S.aureus visade vital NET-bildning medan P.aeruginosa inducerade frisättning av stora koncentrationer av DNA med en grumlig morfologi som samlokaliserades med LL37 vilket indikerar självmords-NET-bildning. Genom att utföra dubbeldensitetsgradientmetodik kan vi få en hög renhet och livskraft hos neutrofiler.Och vi höjer tvättarna, vi undviker att skada strukturen på dem. Efter denna metod kan vi analysera effekten av ämnen eller celler i NET-produktion samt om de är involverade i någon mekanism eller deras användning som terapier vid autoimmun sjukdom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofila Extracellulär Fällor: Hur att generera och visualisera dem

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Förenklad Human Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) Isolering och Hantering

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Metoder för att studera Lipidförändringarna i neutrofiler och efterföljande bildning av neutrofila Extracellulär Fällor

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualisera makrofag extracellulära fällor med konfokalmikroskopi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatiserad bildbaserad kvantifiering av neutrofila extracellulära fällor med NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifiering av neutrofila extracellulära fällor i paraffinin embedded felintens arteriell trombi med immunofluorescensmikroskopi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kvantifiering av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex från neutrofila extracellulära fällor med hjälp av en modifierad sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Färgning och avbildning för att visualisera neutrofila extracellulära fällor

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Författare i fokus: Avbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människor och möss 

Immunofluorescensavbildning av neutrofila extracellulära fällor i vävnader från människa och mus

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...