Name: morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli
Uploaded: 2022-11-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Bu çalışma, CONACyT'den bir temel bilim hibesi (#285480) ve Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca Biyokimyasal Bilimler Fakültesi Klinik İmmünoloji Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. A.A.A, S.A.S.L ve W.J.R.R., sırasıyla #799779, #660793 ve #827788 CONACyT numaralarının doktora burslarına sahiptir.

Kan örnekleri, bilgilendirilmiş onam sonrası klinik olarak sağlıklı katılımcılardan bağış olarak alındı. Tüm deneyler, Oaxaca'nın Universidad Autónoma 'Benito Juárez' Biyokimyasal Bilimler Fakültesi İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'nun izniyle gerçekleştirildi.
NOT: Çalışmaya dahil edilme kriterleri cinsiyet ve yaş belirsizdi ve kan örneği almadan önce bir ankete verilen katılımcı yanıtlarına göre klinik olarak sağlıklıydı. Hücre sayısını belirlemek...

<ol>
	<li>De Buhr, N., Maren, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible.">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).</li><li>Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways:+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase.">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).</li><li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+(PMA)+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis.">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways.">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> eLife. 6, 24437 (2017).</li><li>Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+trap+release+during+bacterial+and+viral+infection.">Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).</li><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease.">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li><li>Delgado-Rizo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+and+its+implications+in+inflammation:+An+overview.">Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview.</a> Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).</li><li>Petretto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+(NET)+induced+by+different+stimuli:+A+comparative+proteomic+analysis.">Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis.</a> PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+the+antimicrobial+peptide+LL-37+in+the+protection+of+neutrophil+extracellular+traps+against+degradation+by+bacterial+nucleases.">Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases.</a> Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).</li><li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Raf-MEK-ERK+pathway+is+required+for+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).</li><li>Sabbatini, M., Magnelli, V., Ren&#242;, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+in+wound+healing:+When+enough+Is+enough.">NETosis in wound healing: When enough Is enough.</a> Cells. 10 (3), 494 (2021).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>Clark, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood.">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Sosa, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+differences+of+neutrophil+extracellular+traps+induced+by+biochemical+and+microbiologic+stimuli+under+healthy+and+autoimmune+milieus.">Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus.</a> Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).</li><li>White, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization,+quantification,+and+visualization+of+neutrophil+extracellular+traps.">Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).</li><li>Boeltz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+NET+or+not+to+NET:+current+opinions+and+state+of+the+science+regarding+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).</li><li>Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+neutrophils+release+mitochondrial+DNA+to+form+neutrophil+extracellular+traps.">Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).</li></ol>

NET'lerin salınımını indüklemek için oldukça saf bir canlı nötrofil popülasyonu elde edilmelidir, çünkü bu hücreler ortalama 8 saatlik sınırlı bir ex vivo ömre sahiptir, bu da tüm deneylerin yapılması gereken bir süredir. Bu amaçla, ideal metodoloji, Ficoll-Histopaque gradyanı veya Dextran sedimantasyon tekniklerinin aksine, eksojen stimülasyona daha duyarlı aktive olmayan hücreleri izole ederek saflaştırma süresini optimize etmek için çift yoğunluklu gradyandır<sup class="xref"...

Nötrofiller, kan dolaşımındaki en bol lökositlerdir ve patojenik ajanların, DNA ve birkaç nükleer, sitoplazmik ve granüler antibakteriyel proteinden oluşan büyük kromatin yapılarının salınması da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalarla temizlenmesi sırasında önemli bir rol oynarlar 1,2. Nötrofillerin bu antimikrobiyal rolünü tanımlayan doğrudan öncül, 1996 yılında Takei ve ark.3 tarafından yapılmıştır. Bu yazarlar, nötrofillerde apoptoz ve nekroptozdan farklı yeni bir ölüm şekli bildirmiş, nükleer rüptür sergileyen morfolojik değişiklikler göstermiş, bunu nükleoplazmadan sitoplazmaya dökülmeyi ve forbol miristat asetat (PMA) ile 3 saatlik inkübasyondan membran geçirgenliğinde bir artış göstermiştir 2,3. Bununla birlikte, 2004 yılına kadar "nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler)" teriminin kullanıldığı4.
NET oluşumu, mikrobiyal yayılımı nötralize etmek, öldürmek ve önlemek için bakteriyel, fungal5, viral6 ve paraziter enfeksiyonlar gibi çeşitli koşullarda gözlenmiştir7. Diğer çalışmalar, patojenik olmayan koşullarda, sitokinler, monosodyum ürik asit veya kolesterol kristalleri, otoantikorlar, bağışıklık kompleksleri ve aktif trombositler gibi steril uyaranlarla da ortaya çıkabileceğini göstermektedir7. Lipopolisakkarit (LPS), interlökin-8 (IL-8) ve PMA, NET indükleyicileri olarak tanımlanan ilk in vitro uyaranlar arasındaydı ve patojenik süreçlerdeki in vivo NET katılımı iki akut inflamasyon modelinde gösterilmiştir: deneysel dizanteri ve spontan insan apandisiti4. DNA önemli bir NET bileşenidir. Uygun yapısı ve bileşimi, NET'leri ve mikrobisidal özelliklerini parçalayan kısa bir deoksiribonükleaz (DNaz) tedavisi ile gösterildiği gibi, yakalanan mikroplara karşı yüksek bir lokal antimikrobiyal molekül konsantrasyonu sağlayarak mikroorganizmaların tutulması ve öldürülmesi için gereklidir4. DNA'nın yanı sıra, NET'ler histonlar, nötrofil elastaz (NE), kathepsin G (CG), proteinaz 3, laktoferrin, jelatinaz, miyeloperoksidaz (MPO) ve katyonik pro-inflamatuar peptid katelisidin LL-37 gibi antimikrobiyal peptitler (AMP'ler) gibi bağlı proteinleri içerir 8,9. Bu tür agregalar, 50 nm'ye kadar çaplara sahip daha büyük dişler oluşturabilir. Bu faktörler mikrobiyal virülans faktörlerini veya patojen hücre zarının bütünlüğünü bozabilir; Ek olarak, AMP'ler NET kaynaklı DNA'yı bakteriyel nükleazlar tarafından bozulmaya karşı stabilize edebilir10.
NET oluşumunu düzenleyen spesifik mekanizmalar henüz tam olarak açıklığa kavuşturulmamıştır. NET salınımına yol açan en iyi karakterize yol, NADPH oksidaz aktivasyonu ve reaktif oksijen türleri (ROS) üretiminin yanı sıra MPO yolunun aktivasyonunu tetikleyen hücre içi kalsiyumun artmasına yol açan ERK sinyallemesidir. Bu da hidrojen peroksiti hipokloröz aside dönüştürür ve NE'yi oksidasyon11,12 ile aktive eder. NE, fagositozu bloke etmek için sitoiskeletin aktin filamentlerinin parçalanmasından ve granül ve sitoplazmik proteinlerle ilişkili kromatin liflerinin duyarsızlaştırılmasını sağlayan ve daha sonra hücre dışı olarak salınan PAD4 ile proteolitik bölünme ve deaminasyon ile işlenmek üzere çekirdeğe taşınmasından sorumludur7. Bu proteazlar, azurofil granüllerinin azurozom kompleksinden ve kathepsin G13 gibi diğer proteazlardan salınanları içerir.
Nötrofillerdeki morfolojik değişikliklere bağlı olarak, NET'ler iki tipte sınıflandırılır: hücre ölümüne yol açan intihar veya litik NET oluşumu4 ve nükleer veya mitokondriyal DNA'nın veziküler salınımının aracılık ettiği canlı hücreler tarafından üretilen hayati veya litik olmayan NET oluşumu, fagositik kapasiteye sahip bir anüklee sitoplastın kalıntısı14,15. Genel olarak, mitokondriyal DNA'dan oluşan NET'ler uzatılmış bir lif14 morfolojisi sunarken, nükleer DNA'dan yapılandırılmış olanlar bulut benzeri bir görünüme sahiptir3. Bununla birlikte, nötrofilin DNA kökenini nasıl seçtiği bilinmemektedir. NET'lerin kanonik yollarını birkaç saat gerektirdiğini tanımlayan önceki çalışmaların aksine, hayati yol sadece 5-60 dakika15'te hızla aktive edilir.
Bu ilerlemelere rağmen, NET bileşimi uyarana bağlı olarak değişir; Örneğin, P. aeruginosa'nın farklı mukoid ve mukoid olmayan suşları, 33 ortak protein ve 50'ye kadar değişken proteiniçeren NET'lerin oluşumunu indükler. Bu nedenle, araştırma gruplarında nesnel sonuçların üretilmesine izin veren teknikleri homojenize etmek gerekir. Bu yazıda, farklı mikroorganizmalarla indüklenen NET'lerin bileşiminin, yapısının ve morfolojisinin karşılaştırılmasına ve değerlendirilmesine olanak tanıyan çeşitli tekniklerle bir protokol açıklanmaktadır: Staphylococcus aureus (gram-pozitif bakteri), Pseudomonas aeruginosa (gram-negatif bakteri) ve Candida albicans (mantar) ve sağlıklı bireylerden gelen insan nötrofillerinde kimyasal uyaranlar (PMA, HOCl). Temsili sonuçlar, DNA-DAPI boyaması, LL37 için immün boyama ve enzimatik aktivitenin (NE, CG ve MPO) nicelleştirilmesi ile karakterize edilen karşılaştırılabilir in vitro koşullar altında indükleyici uyaranlarına bağlı olarak NET'lerin heterojenliğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 Well plate for cell culture</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-aminoactinomycin D (7-AAD)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>51-668981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well plate for cell culture</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3596</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agitator</td>
			<td>CRM Globe</td>
			<td>CRM-OS1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody LL37&#160;&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-166770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood collection tubes</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>368171</td>
			<td>K2 EDTA 7.2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>21878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>M03-CUB-22X22</td>
			<td>22 mm x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>1201022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>5 mL - Without caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>DM 2000&#160;</td>
			<td>LEICA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F6057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>UN-4750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACSQuant Analyzer</td>
			<td>Miltenyi Biotec&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader photometer&#160;</td>
			<td>Clarkson Laboratory - CL&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes 1.5 mL</td>
			<td>Zhejiang Runlab Tech</td>
			<td>35200N</td>
			<td>wire snap&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minitab Software</td>
			<td>Minitab</td>
			<td></td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD VACUTAINER</td>
			<td>301746</td>
			<td>Diameter 1.34 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>VELAB</td>
			<td>VE-B50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td>Solution for density gradient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td>
			<td>Caisson</td>
			<td>PBL07-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex culture tubes</td>
			<td>CORNING&#160;</td>
			<td>CLS982025</td>
			<td>N&#176;9820</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 1x</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-104-CV</td>
			<td>contains Glutagro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Madesa</td>
			<td>PDI257550</td>
			<td>22 mm x 75 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and compositional analysis of neutrophil extracellular traps induced by microbial and chemical stimuli

Nötrofiller, nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) oluşumu gibi çeşitli mekanizmalar kullanarak doğuştan gelen bir bağışıklık tepkisinde hücresel savunmanın ilk hattı olarak işlev görür. Bu çalışma, mikrobiyal ve kimyasal uyaranların neden olduğu NET'lerdeki morfolojik ve bileşimsel değişiklikleri, NET indüksiyonu ve insan hücreleri ile karakterizasyonu için standartlaştırılmış in vitro metodolojiler kullanarak analiz etmektedir. Burada açıklanan prosedürler, NET morfolojisinin (litik veya litik olmayan) ve kompozisyonun (DNA-protein yapıları ve enzimatik aktivite) analizine ve çözünür faktörlerin veya hücresel temasın bu özellikler üzerindeki etkisine izin verir. Ek olarak, burada açıklanan teknikler, eksojen çözünür faktörlerin veya hücresel temasın NET bileşimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için değiştirilebilir.
Uygulanan teknikler, polimorfonükleer hücrelerin çift yoğunluklu bir gradyan (1.079-1.098 g / mL) kullanılarak insan periferik kanından saflaştırılmasını, Wright'ın boyanması, tripan mavisi dışlaması ve FSC'ye karşı SSC analizi ve 7AAD boyama dahil olmak üzere akış sitometrisi ile gösterildiği gibi optimum saflık ve canlılığı (≥% 95) garanti etmeyi içerir. NET oluşumu mikrobiyal (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Candida albicans) ve kimyasal (forbol miristat asetat, HOCl) uyaranlarla indüklenir ve NET'ler DNA-DAPI boyaması, antimikrobiyal peptid katelisidin (LL37) için immün boyama ve enzimatik aktivitenin (nötrofil elastaz, kathepsin G ve miyeloperoksidaz) nicelleştirilmesi ile karakterize edilir. Görüntüler floresan mikroskopi ile elde edilir ve ImageJ ile analiz edilir.

Nötrofillerin saflığı ve yaşayabilirliği Dinamik hücresel fazlar, çift yoğunluklu gradyan saflaştırmasından tüpte görselleştirilir. Bu tabakalar içinde, granülositlere karşılık gelen tabaka, periferik kan mononükleositlerinin (PBMC'ler) ve eritrositlerin fazlarından ayırt edilen 1.079 g / mL yoğunluk tabakasının üzerindedir (Şekil 1A). Saflaştırılmış hücrelerin morfolojisi, olgun nötrofillere karşılık gelen iplik benzeri filamentlerle...

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli at JoVE.com

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Bu protokol, nötrofil hücre dışı tuzakların bileşimi, yapısı ve morfolojisindeki heterojenliği, sağlıklı bireylerden gelen insan nötrofillerinde karşılaştırılabilir in vitro koşullar altında uyaranlarına bağlı olarak göstermektedir. Yüksek nötrofil saflığı ve canlılığı elde edilir. Bu, nötrofil hücre dışı tuzaklar tarafından salınan DNA, LL-37 ve miyeloperoksidaz, elastaz ve kathepsin G'nin enzim aktivitesinin konsantrasyonunu karşılaştırmaya izin verir.Bu protokol, çözünür faktörlerin veya hücresel temasın veya otoimmün hastalıkta NET'lerin üretimi üzerindeki olası tedavilerin veya mekanizmaların etkisini analiz etmeyi sağlamıştır. Bu yöntemler otoimmün hastalığın araştırılmasında yardımcı olabilir. NET'lerin kontrolsüz hücre üremesi ve hastalığın biyobelirteçleri olarak kabul edilen bileşenlerinin hizalanma süresi nedeniyle.Floresan mikroskopisi, DNA'nın dağılımını gösteren NET'lerin görüntüsünü, nasıl göründüklerini anlamaya yardımcı olan mikroorganizmalarla birlikte lokalize olan LL37 gibi proteinlerle ilişkili olarak yakalamaya izin verir. Başlamak için, antikoagülan olarak dipotasyum EDTA içeren tüplerde 10 mililitre periferik kan toplamak için vena ponksiyonu yapın. Ardından, numunenin kalitesini sağlamak için enfeksiyon veya inflamasyonu dışlamak için standart kan biyometrisi ve C-reaktif protein testi yapın.Trombositten zengin plazmayı çıkarmak için periferik kan örneğini santrifüj edin, ardından ikinci bir santrifüjleme yapın ve kalan plazmayı atın. Elde edilen eritrosit ve lökosit paketini bire bir hacim oranında bir 1X DPBS ile seyreltin. Daha sonra, steril bir 10 mililitrelik cam tüpte, önce mililitre yoğunluk çözeltisi başına bir mililitre 1.08 gram, ardından mililitre yoğunluk çözeltisi başına bir mililitre 1.079 gram biriktirin.Daha sonra, seyreltilmiş eritrosit ve lökosit paketinin dört mililitresini duvarların üzerine dökerek ekleyin. Gradyanı rahatsız etmemek için hızlanma veya yavaşlama olmadan santrifüj. Granülositlere karşılık gelen fazı aspire edin ve başka bir steril 10 mililitrelik cam tüpe aktarın.Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de dört mililitre 1X DPBS ile yıkayın ve süpernatanı atın. Kalan eritrositleri çıkarmak için, dört mililitre% 0.2 tuzlu su çözeltisi ekleyerek hücreleri ozmotik şokla tedavi edin. Dört santigrat derecede iki dakika inkübe edin ve santrifüjleyin.Süpernatantı atın ve dört mililitre% 0.65 tuzlu su çözeltisi ekleyin. Membran bütünlüğünü geri kazanmak ve santrifüjlemeyi tekrarlamak için dört santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. Süpernatantı çıkarın ve hücresel kalıntıları gidermek için hücreleri dört mililitre 1X DPBS'de yeniden askıya alın.Yine, hücre peletini iki mililitre soğuk HBSS tamponunda santrifüj edin ve yeniden askıya alın. Bir tripan mavisi dışlama testi yapmak için, hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini% 0.4 tripan mavisi 20 mikrolitrede seyreltin. Yeni bir bower odasındaki hücreleri sayın ve bir dışlama testi kullanarak hücre canlılığını belirleyin.Ardından, hücre süspansiyonunun 5 mikrolitresini bir slayta monte edin ve Wright'ın lekesiyle 15 saniye boyunca lekeleyin. Numuneyi hemen sabitleyin, damıtılmış suyla yıkayın ve morfolojiyi optik mikroskop altında gözlemleyin. Daha sonra, sitometri tüplerini akıtmak için beşinci hücrelere bir kez 10 kez ekleyin ve karanlıkta dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 100 mikrolitre FACS tamponunda bir mikrolitre 7AAD ile lekeleyin.300 G'de 500 mikrolitre FACS tamponu ile 10 dakika boyunca yıkayın. Hücreleri 500 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile sabitleyin ve akış sitometrisi analizine kadar dört santigrat derecede saklayın. Ölü hücre kontrolü için, hücreleri 30 dakika boyunca 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de 500 mikrolitre 1XPBS ile yıkayın.Süpernatantı atın ve% 0.1 Triton X-100'ün 200 mikrolitresini ekleyin. Dört santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. 500 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın ve 7AAD ile lekeleyin.Yakalanan verileri akış sitometresi yazılımında analiz edin. Dosyaları yükleyin ve lekesiz nötrofil dosyasına çift tıklayın. Nötrofillere karşılık gelen hücre popülasyonunu görüntülemek için X ekseninde ileri saçılım veya FSC ve Y ekseninde yan saçılma veya SSC seçin.Ardından, hücrelerin otofloresansını sınırlamak için X ekseninde B3-A:PerCP vio 700-A kanalını seçin ve Y ekseninde histogramı seçin. Ardından, lekeli nötrofil dosyasını açın. Nötrofillere karşılık gelen hücre popülasyonunu görüntülemek için X ekseninde FSC'yi ve Y ekseninde SSC'yi seçin.Yine, 7AAD boyası için pozitif nötrofil popülasyonunu sınırlamak üzere B3-A:PerCP vio 700-A kanalını seçin. Pencereye sağ tıklayıp düzen düzenleyicisine kopyala'yı seçerek son histogramı oluşturun. 1.5 mililitrelik mikro tüplere bakteriyel veya fungal psödohipha ekleyin.200 mikrolitre ekleyin, böylece 1X PBS'de beş mikromolar CFSC. Karanlıkta 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede karıştırın ve kuluçkaya yatırın. 500 mikrolitre dekompleman plazma ve santrifüj ekleyerek reaksiyonu durdurun.Süpernatantı atın ve peleti santrifüjleme ile bir mililitre 1XPBS ile yıkayın. Daha sonra mikroorganizmaları 250 mikrolitre 1X PBS'de tekrar askıya alın. NET indüksiyonu için 1.5 mililitrelik mikrotüplerde iki kez 10 ila yedinci bakteri veya iki kez 10 ila beşinci psödohifler ile 50 mikrolitre alikot hazırlayın.10 x 10 milimetre steril cam kapak kaymalarını 24 delikli bir plakaya yerleştirin. Oda sıcaklığında bir saat boyunca 10 mikrolitre% 0.001poli l-lizin ile örtün ve 100 mikrolitre 1X PBS ile iki kez yıkayın. Hava kurutun ve 15 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın.Daha sonra, daha önce hazırlanan nötrofil süspansiyonunun HBSS çözeltisini,% 10 ısı ile dekompleman otolog plazma ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamı ile değiştirin. Bu hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini, kuyu başına iki kez 10 ila beşinci nötrofillerin son konsantrasyonu için 24 delikli plakaya ekleyin. Hücrelerin kuyucukların dibine yapışmasını sağlamak için% 5 karbondioksit ile plakayı 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.Net oluşumunu indüklemek için, MOI100 bakteri uyaranlarını ve MOI1'de psödohifaları ekleyin. Ayrıca biyokimyasal uyaranları ekleyin ve 50 mikrolitre HBSS ekleyerek uyaran olmadan bir kontrol hazırlayın. Kuyu başına 400 mikrolitrelik son bir hacim elde edin ve 140 RPM'de bir plaka çalkalayıcıda 30 saniye boyunca karıştırın.Daha sonra 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dört saat kuluçkaya yatırın. Net indüksiyondan sonra, süpernatantı dikkatlice pipetleyerek kuyucuklardan çıkarın ve hücreleri 30 dakika boyunca 300 mikrolitre% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Hücreleri santrifüj yapmadan 200 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın ve 30 dakika boyunca 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin.LL37 boyası için, hücreleri 10 dakika boyunca 1X PBS'de 200 mikrolitre% 0.2Triton X-100 ile geçirgenleştirin ve 1X PBS ile iki kez yıkayın. Kapak fişlerini cam slaytlara monte edin. DNA, hücreleri iki mikrolitre DAPI ile boyar ve konfokal floresan mikroskobu ile analiz edilene kadar eksi 20 santigrat derecede depolar.Dinamik hücresel fazlar çift yoğunluklu gradyan saflaştırmadan sonra görselleştirildi. Tipik nötrofil morfolojisi sağ boyama ile doğrulandı. Hücreler ayrıca membran bozulması olmadan tripan mavisi dışlaması ile gözlenen optimal canlılık gösterdi.SSC'ye karşı FSC'nin akış sitometrisi ile analizi, yüksek hücre saflığına sahip PMN'ye karşılık gelen bir popülasyonu doğruladı. 7AAD leke hücrelerine karşı boyanmamış hücreler için PMN nokta grafikleri ve bunların ilgili histogramları, geçirgenleştirilmiş kontrol hücrelerine kıyasla yeni izole edilmiş nötrofillerde yüksek hücre canlılığını göstermiştir. Nötrofiller kimyasal ve mikrobiyal uyarıcılarla uyarıldıktan sonra, NET'ler DNA DPI ve anti-LL37 kullanılarak floresan mikroskopi ile görselleştirildi.Mikroorganizmalar CFSE ile önceden boyandı. PMA'ya bağlı intihar ağı oluşumu LL37 ile birlikte lokalizasyon ile gösterilir. HOCI ile oluşturulan NET'ler, hayati NET oluşumuna karşılık gelen hücre dışı alanda küçük DNA dispersiyonu gösterdi.Fungal psödohifaların neden olduğu NET, hayati NET oluşumunun karakteristik filamentli yapıları ile hücre dışı boşluğa salınan düşük DNA konsantrasyonları gösterdi. S.aureus vital NET oluşumu gösterirken, P.aeruginosa, intihar NET oluşumunu gösteren LL37 ile birlikte lokalize olan bulutlu bir morfoloji ile büyük konsantrasyonlarda DNA salınımını indükledi. Çift yoğunluklu gradyan metodolojisi gerçekleştirmek, nötrofillerin yüksek saflığını ve yaşayabilirliğini elde etmemizi sağlar.Ve yıkamaları yükseltiriz, yapılarına zarar vermekten kaçınırız. Bu yöntemi takiben, NET üretimindeki maddelerin veya hücrelerin etkisini, ayrıca bazı mekanizmalarda yer alıp almadıklarını veya otoimmün hastalıkta tedavi olarak kullanılıp kullanılmadıklarını analiz edebiliriz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

İmmünofluoresans Mikroskobu kullanılarak Parafin Gömülü Kedi Arteriyel Trombisinde Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Belirlenmesi

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

İnsan ve Fare Dokularında Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İmmünofloresan Görüntülemesi

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...