Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419 ، CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource ، RRID: SCR_021321 ، شكرا جزيلا لزملائنا في Cytek على المناقشات المستمرة للتحليل الخلوي الطيفي الكامل على برنامج Aurora و SpectroFlo. تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.

تم الحفاظ على الفئران في حرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي وفقا لبروتوكولات IACUC. تم القتل الرحيم لجميع الفئران وفقا لمعايير AAALAC.
1. تحضير الخلايا المناعية من طحال الفأر
ملاحظة: القتل الرحيم للفئران الساذجة بالقتل الرحيمCO 2 . يتم استخدام الفئران C57BL ...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول مقايسة محسنة مصممة لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية المحملة بصبغة مؤشر Indo-1 المعايرة باستخدام قياس التدفق الخلويلتدفق الطيف الكامل 7,8. تتمثل ميزة إجراء فحوصات تدفق الكالسيوم باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف ال...

يعد تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية (TCR) مقياسا مفيدا لتنشيط الخلايا التائية وكثيرا ما يستخدم لتحديد ما إذا كانت مجموعة الخلايا التائية قد ضعفت الاستجابات في الخطوات القريبة من مسار إشارات TCR1. يتم إجراء قياسات تدفق الكالسيوم بشكل عام عن طريق وضع العلامات المسبقة على الخلايا التائية بواحد أو زوج من أصباغ مؤشر الكالسيوم الفلورية ، ثم فحص إشارات الفلورسنت باستخدام قياس التدفق الخلوي في الوقت الفعلي بعد ربط TCRالمتقاطع 2،3،4. يتم إثارة Indo-1 ، صبغة الكالسيوم المترية النسبة ، بواسطة ليزر الأشعة فوق البنفسجية مع انبعاثات الذروة عند طولين موجيين مختلفين يعتمدان على ارتباط الكالسيوم5 ، وهو صبغة مؤشر شائعة الاستخدام لتحليل قياس التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية الحية. نظرا لأن ملف تعريف انبعاث Indo-1 واسع جدا ، فقد يكون من الصعب الجمع بين تقييم Indo-1 والتحليل المتزامن لعلامات سطح الخلية المتعددة عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. يقيد هذا القيد استخدام تحليل التدفق الخلوي لاستجابات الكالسيوم لمجموعات الخلايا التائية المنقاة مسبقا أو المجموعات التي تحددها مجموعة محدودة من جزيئات سطح الخلية.
لمعالجة قيود قياس استجابات الكالسيوم على المجموعات غير المتجانسة من الخلايا الليمفاوية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي بتمرير النطاق ، تم تطوير بروتوكول لقياس مضان Indo-1 باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تسمح هذه الطريقة بتعدد إرسال Indo-1 بألواح من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية ، مع الاستفادة من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. تتمثل ميزة استخدام قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف على قياس التدفق الخلوي التقليدي في قدرته على تمييز إشارات الفلورسنت عن الأصباغ شديدة التداخل ، وبالتالي زيادة عدد العلامات السطحية التي يمكن تقييمها في وقت واحد في كل عينة. يستخدم قياس التدفق الخلوي التقليدي مرشحات تمرير النطاق ويقتصر على فلوروكروم واحد لكل نظام كاشف6. يجمع قياس التدفق الخلوي كامل الطيف الإشارات عبر الطيف الكامل للفلوروكروم باستخدام 64 كاشفا على نظام قياس التدفق الخلوي بخمسة ليزر 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، يستفيد قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل من كاشفات APD (Avalanche Photo Diode) التي زادت من الحساسية بالنسبة لكاشفات أنبوب المضاعف الضوئي الموجودة في مقاييس التدفق الخلويالتقليدية 8. وبالتالي ، فإن هذا النهج مثالي لمجموعات الخلايا غير المتجانسة ، مثل خلايا الدم أحادية النواة المحيطية أو معلقات خلايا الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران ، لأنه يلغي الحاجة إلى عزل مجموعات معينة من الخلايا التائية قبل وضع علامات صبغة الكالسيوم. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ملفات تعريف تعبير علامات سطح الخلية وبوابات قياس التدفق الخلوي بعد جمع البيانات لتقييم استجابات الكالسيوم في كل مجموعة من السكان موضع الاهتمام. كما هو موضح في هذا التقرير ، يمكن بسهولة دمج Indo-1 مع ثمانية أجسام مضادة مقترنة بالفلوروكروم ، مما ينتج عنه ما مجموعه 10 توقيعات طيفية فريدة. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على مخاليط الخلايا من خطوط الفئران المتميزة وراثيا ، مما يسمح بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في الخلايا التائية من النوع البري مقارنة بتلك الموجودة في خط الفئران المستهدف بالجينات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

يعد تدفق الكالسيوم استجابة لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية مقياسا شائعا لإشارات الخلايا التائية. تم تطوير العديد من أصباغ مؤشر الكالسيوم لتقييم إشارات الكالسيوم عن طريق قياس التدفق الخلوي لتمرير النطاق. تم تصميم هذا البروتوكول لقياس استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام قياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل. يتم تمييز الخلايا الطحالية الكلية بصبغة مؤشر الكالسيوم النسبي Indo-1 ، جنبا إلى جنب مع لوحة من الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم لجزيئات سطح الخلية. توفر الاستفادة من قدرات قياس التدفق الخلوي كامل الطيف منصة لاستخدام مجموعة واسعة من بقع سطح الخلية بالاشتراك مع Indo-1. ثم يتم تحليل الخلايا في الوقت الفعلي عند 37 درجة مئوية قبل وبعد إضافة جسم مضاد ل CD3 لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. بعد فك خلط الإشارات الطيفية ، يتم حساب نسبة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم إلى Indo-1 الخالي من الكالسيوم ويمكن تصوره بمرور الوقت لكل مجموعة مسورة من الخلايا الطحالية. يمكن أن تسمح هذه التقنية بالتحليل المتزامن لاستجابات الكالسيوم في مجموعات خلايا متعددة.

يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي لتقييم استجابات الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية باستخدام صبغة Indo-1 ذات البقع السطحية المتعددة. بعد حصاد ومعالجة خلايا الطحال الفأرية في تعليق خلية واحدة ، يتم تلطيخ الخلايا بإستر Indo-1 AM والسطح ملطخ بالأجسام المضادة المرتبطة بالفلوروكرو...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

يعد تدفق الكالسيوم ، وهو مقياس لإشارات الخلايا التائية ، طريقة فعالة لتحليل الاستجابات لتحفيز مستقبلات الخلايا التائية. يستفيد هذا البروتوكول لتعدد إرسال Indo-1 مع لوحات من الأجسام المضادة الموجهة إلى جزيئات سطح الخلية من القدرات المرنة للغاية لقياس التدفق الخلوي لتدفق الطيف الكامل.

تحليل تدفق الكالسيوم الناجم عن مستقبلات الخلايا التائية في الخلايا التائية الأولية عن طريق قياس التدفق الخلوي الكامل الطيف

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

يسمح البروتوكول للباحثين بقياس استجابة الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية في وقت واحد جنبا إلى جنب مع تقييم مجموعتها الفرعية والنمط الظاهري السطحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب الحاجة إلى عزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا قبل فحص استجاباتها للكالسيوم. للبدء ، قم بإعداد ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من محلول مخزون Indo-1 AM بإضافة 50 ميكرولترا من DMSO في قنينة تحتوي على 50 ميكروغرام من Indo-1 AM. قم بتخفيف محلول المخزون إلى حجم مناسب من cRPMI وتركيز ستة ميكروغرام لكل ملليلتر.ضع الوسط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ثم استخدم هذا الوسط لتخفيف تعليق خلية معد مسبقا بنسبة واحد إلى واحد للحصول على خمسة إلى 6 ملايين خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا ، أضف ملليلتر واحد من معلق الخلية لكل بئر لكل حالة تجريبية.قم بإعداد عينة تحكم واحدة ملطخة ل Indo-1 الخالي من الكالسيوم عن طريق إضافة EGTA إلى الخلايا المحملة بالصبغة Indo-1. قم بإعداد بئر للمكافحة السلبية البيولوجية بدون فلوروفورات أو صبغة Indo-1. قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي Indo-1 عن طريق إضافة الأيونوميسين بتركيز 50 ميكرومول إلى تعليق الخلية المحمل بالصبغة عند مقياس التدفق الخلوي.أيضا ، قم بإعداد بئر لضوابط بقعة واحدة لمجموعات الخلايا الإضافية باستخدام الفلوروفورات المترافقة بالأجسام المضادة. ثم أضف ميكروغرام من الأجسام المضادة التي تمنع مستقبلات FC لكل مليون خلية واحتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة مع النقر كل 15 دقيقة لإعادة تعليق الخلايا. بعد الحضانة ، قم بخلط وإزالة الحجم الكامل للخلايا من اللوحة وإضافته إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي وصب الطاف. بمجرد غسل الخلايا بملليلتر واحد من cRPMI الذي تم تسخينه مسبقا ، قم بالحبيبات مرة أخرى وصب المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من cRPMI واحتضان كل أنبوب ، وترك الجزء العلوي من الأنبوب مفتوحا قليلا لتبادل الغازات ، مما يسمح بإزالة الأسترة الكاملة لاسترات AM داخل الخلايا.بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكرومية المعرفة من قبل المستخدم وأضفها إلى خلايا الراحة مقابل ملليلتر واحد من حجم الخلية. بعد الراحة ، قم بإذابة الخلايا وغسل الحبيبات عن طريق تعليقها في ملليلتر واحد من cRPMI المبرد إلى أربع درجات مئوية. كرر هذه الخطوة وضع الأنابيب على الجليد.أعد تعليق العينات الفردية في 500 ميكرولتر من cRPMI الخالي من الفينول الأحمر باستخدام أنبوب تدفق البوليسترين سعة خمسة ملليلتر مع غطاء. للحفاظ على درجة الحرارة باستخدام تحليل تدفق الكالسيوم ، قم بإعداد حمام حبة عن طريق إضافة حبات الحمام إلى حمام مائي صغير وتسخينه حتى 37 درجة مئوية. قطع بعناية أنبوب كرونيكل 50 ملليلتر في النصف وتجاهل الجزء العلوي من الأنبوب.املأ ثلاثة أرباع الأنبوب المتبقي بخرز الحمام واتركه يصل إلى 37 درجة مئوية في حمام الخرز. ضع حمام الخرزة بالقرب من مقياس التدفق الخلوي ، جنبا إلى جنب مع رف الستايروفوم لوضع الأنبوب. قبل التحليل على مقياس التدفق الخلوي ، قم بتسخين الأنابيب بشكل فردي إلى 37 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.قم بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق علامة التبويب المكتبة. ثم حدد علامات الفلورسنت لإضافة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم و Indo-1 الخالي من الكالسيوم. ثم حدد ليزر الأشعة فوق البنفسجية ضمن مجموعات علامات الفلورسنت وانقر فوق إضافة لإضافة اسم علامة الفلورسنت.اختر الطول الموجي لإثارة الليزر وانبعاثه ثم انقر فوق حفظ. تابع إلى الإعداد التجريبي. انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" ، افتح / أنشئ تجربة جديدة وأضف علامات الفلورسنت المطلوبة إلى التجربة.أنشئ مجموعة مرجعية ومجموعة عينات جديدة للتجربة وقم بتسمية كلتا المجموعتين. ضمن علامة التبويب عمليات الاستحواذ ، اضبط الأحداث على التسجيل إلى الحد الأقصى عند 10 ملايين ، وإيقاف الحجم إلى الحد الأقصى لحجم 3000 ميكرولتر ، ووقت التوقف إلى 36،000 ثانية كحد أقصى. احصل على عناصر تحكم مفردة للأجسام المضادة المترافقة المعرفة من قبل المستخدم والمضمنة في اللوحة متعددة الألوان ولصبغة Indo-1 الوظيفية.أضف 50 ميكرومول من الأيونوميسين إلى التحكم الإيجابي في Indo-1 المرتبط بالكالسيوم والدوامة. أضف أنبوب التدفق إلى لوحة حقن العينة وانقر فوق تسجيل. ثم أضف عنصر التحكم السلبي Indo-1 الخالي من الكالسيوم إلى مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق تسجيل.قم بإلغاء خلط عناصر التحكم الملطخة الفردية بالنقر فوق الزر Unmix. بمجرد اكتمال فك الخلط ، قم بإنشاء مخططات متسلسلة باستخدام ورقة العمل غير المختلطة ، مثل SSC-A مقابل FSC-A ، لإزالة الحطام من العينة و SSC-A مقابل SSC-H لإزالة الثنائيات. ثم قم بإنشاء بوابات بالنقر فوق مؤامرة.أضف قطعة أرض إلى ورقة العمل وانقر نقرا مزدوجا داخل البوابة لإنشاء مجتمع مسور في اتجاه مجرى النهر. استمر حتى يتم حساب جميع السكان المعنيين. بعد ذلك ، قم بتسخين عينات التحكم الملطخة المفردة المعدة مسبقا إلى 37 درجة مئوية للتحليل المتسلسل.قم بإعداد برنامج قياس التدفق الخلوي وقم بتشغيل DI في الماء المثلج لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان الاستقرار السائل لمقياس التدفق الخلوي. قم بإعداد مخططات متسلسلة على ورقة العمل غير المختلطة عن طريق إنشاء بوابات باستخدام أزرار بوابة المستطيل المضلع أو القطع الناقص لتضمين المحتوى محل الاهتمام. انقر نقرا مزدوجا داخل البوابة وقم بتغيير معلمات المحور y و x إلى SSC-A مقابل SSC-H.أكمل تحديد معلمات المحور عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على المحور. قم بإنشاء قطعة أرض باستخدام إشارة صبغة SSC-A مقابل قابلية التحمل. بوابة الخلايا الحية التي هي سلبية لتلطيخ صبغة أمين.تتجمع الخلايا الحية السالبة للتلطيخ الميت الحي عند علامة الصفر على كل من المحور y و x. انقر نقرا مزدوجا فوق المخطط الداخلي لإنشاء مؤامرة جديدة تحتوي على خلايا ليمفاوية حية أحادية الخلية فقط. قم بتغيير المحور Y إلى Indo-1 مقابل الوقت على المحور x لتصور تدفق الكالسيوم.ضع العينة البيولوجية الدافئة في اللقطة العقيمة للآلة. قم بتشغيل العينات بمعدل 2،500 إلى 3000 حدث في الثانية على معدل تدفق متوسط لتصور تدفق الكالسيوم في عدد محدود من مجموعات الخلايا. أضف الأنبوب التالي إلى حمام الخرزة في التحكم في الاستحواذ.اضغط على Record لتسجيل البيانات الأولية لمدة 30 ثانية للحصول على مستوى أساسي من إشارات الكالسيوم في العينة. ثم انقر فوق إيقاف وإزالة الأنبوب من منفذ حقن العينة. أضف 30 ميكروغرام من مضاد CD3 غير المقترن مباشرة إلى أنبوب العينة لبدء تدفق الكالسيوم.ضع الأنبوب بسرعة مرة أخرى على منفذ حقن العينة واضغط على تسجيل في البرنامج. سجل البيانات لمدة سبع دقائق ، وشاهد الوقت المنقضي تحت ضوابط الاستحواذ في البرنامج. ثم اضغط على إيقاف في البرنامج.أضف ميكروجراما واحدا لكل ملليلتر من الأيونوميسين وسجل لمدة 30 ثانية للحصول على أقصى إشارة كالسيوم في الخلايا ذات الاهتمام. تابع إلى العينة التالية وكرر سير العمل حتى يتم جمع كافة العينات. احفظ التجربة وانقر على تصدير ملف مضغوط.يتم تحميل الملفات غير المختلطة إلى برنامج تحليل التدفق الخلوي الخارجي. تشير الإشارة المتسقة المستقرة في مخطط زمني مقابل التشتت الجانبي إلى استقرار السوائل. كان سكان الخلايا الليمفاوية متبوعين بتمييز المفردات على قطعة من ارتفاع التشتت الجانبي مقابل المساحة.تم تقييم المفردات للتأكد من جدواها. ثم تم تطبيق البوابات على السكان سلبيين CD19. تم تقييم هذه المجموعات الفرعية للخلايا التائية باستخدام الأجسام المضادة ل CD4 و CD8 من خلال تصور مضان Indo-1 المرتبط بالكالسيوم مقابل الوقت.في مجموعات الخلايا الفردية ، أظهر مخطط Indo-1 المرتبط بالكالسيوم مقابل الوقت خط أساس قبل التحفيز. استجابة الذروة مع انخفاض مستويات الكالسيوم داخل الخلايا واستجابة الكالسيوم المستنبطة بإضافة الأيونومايسين. قبل إضافة الأجسام المضادة المضادة ل CD3 ، تم اكتشاف إشارة Indo-1 ضعيفة مرتبطة بالكالسيوم.خلال ذروة الاستجابة ، أظهرت الخلايا إشارة Indo-1 قوية مرتبطة بالكالسيوم وخفضت Indo-1 الخالية من الكالسيوم. في خمس دقائق بعد الذروة ، عاد مضان Indo-1 تقريبا إلى خط الأساس. بعد إضافة الأيونوميسين ، تم تصور إشارة قوية من Indo-1 المرتبط بالكالسيوم ، مما يشير إلى تحميل صبغة كافية للخلايا.تم إجراء تحليل للمجموعات النادرة عن طريق رسم Indo-1 المرتبط بالكالسيوم مقابل Indo-1 الخالي من الكالسيوم بعد بوابات على كل مجموعة من السكان المعنيين. وتحليل استجابة الكالسيوم على مدار الدورة الزمنية الكاملة لكل مجموعة فرعية. يمكن أن يؤدي تدفق الكالسيوم باستخدام التنميط الكامل الطيف إلى تحليل قياس خلوي عالي التدفق في مجموعة متنوعة من المجموعات الفرعية المناعية.يمكن استخدام التحليل عالي الأبعاد للتجميع غير المتحيز للمجموعات الفرعية للخلايا التائية مع قياس التدفق الخلوي عالي المعلمات للتحليل المتقدم. تم تطوير هذه التقنية لتحليل مجموعات فرعية مناعية متعددة بالتزامن مع بعضها البعض في عينة مجمعة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

التدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الكمي الميتوكوندريا وليسوسوميس في خلايا تي

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

تحديد المجموعات الفرعية التنظيمية تي الخلية في الغدة الصعترية مورين، البنكرياس تصب العقدة الليمفاوية والطحال باستخدام التدفق الخلوي

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...