Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_021321, Mange tak til vores kolleger hos Cytek for løbende diskussioner af fuld spektral cytometrisk analyse på Aurora og SpectroFlo software. Figurer blev oprettet med BioRender.com.

Mus blev vedligeholdt på University of Colorado Anschutz Medical campus i overensstemmelse med IACUC protokoller. Alle mus blev aflivet i henhold til AAALAC-standarder.
1. Forberedelse af immunceller fra musemilten
BEMÆRK: Aflive naive mus med CO2 eutanasi. C57BL/6-mus købt hos Jackson Laboratories og opdrættet internt anvendes til forsøg, når de er 6-12 uger gamle. Både han- og hunmus bruges til forsøg.
<ol><li>Desinficer museh...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Denne protokol beskriver et optimeret assay designet til at måle calciumresponser i primære murin T-celler fyldt med titreret Indo-1 ratiometrisk indikatorfarvestof ved hjælp af fuldspektret flowcytometri 7,8. Fordelen ved at udføre calciumfluxassays ved hjælp af fuldspektret flowcytometri er evnen til at multiplexere overfladecellemarkørfarvning i kombination med vurdering af Indo-1-fluorescens. Fuldspektret flowcytometri har den fordel, at det tillader an...

T-cellereceptor (TCR) induceret calciumtilstrømning er et nyttigt mål for T-celleaktivering og bruges ofte til at bestemme, om en population af T-celler har nedsat respons i de proksimale trin i TCR-signalvejen1. Målinger af calciumtilstrømning udføres generelt ved at præmærke T-cellerne med et eller et par fluorescerende calciumindikatorfarvestoffer og derefter undersøge de fluorescerende signaler ved hjælp af flowcytometri i realtid efter TCR-tværbinding 2,3,4. Indo-1, et forholdsmetrisk calciumfarvestof, er ophidset af UV-laseren med maksimale emissioner ved to forskellige bølgelængder afhængig af calciumbinding5 og er et almindeligt anvendt indikatorfarvestof til flowcytometrianalyse af calciumresponser i levende lymfocytter. Da emissionsprofilen for Indo-1 er ret bred, kan det være udfordrende at kombinere Indo-1-vurdering med samtidig analyse af flere celleoverflademarkører ved båndpasflowcytometri. Denne begrænsning begrænser brugen af flowcytometrianalyse af calciumresponser til prærensede populationer af T-celler eller til populationer identificeret ved et begrænset sæt celleoverflademolekyler.
For at løse begrænsningerne ved måling af calciumresponser på heterogene populationer af primære lymfocytter ved hjælp af båndpasflowcytometri blev der udviklet en protokol til måling af Indo-1-fluorescens ved hjælp af fuldspektret flowcytometri. Denne metode giver mulighed for multiplexing af Indo-1 med paneler af antistoffer rettet mod celleoverflademolekyler og drager fordel af de meget fleksible muligheder for fuldspektret flowcytometri. Fordelen ved at anvende fuldspektret flowcytometri frem for konventionel flowcytometri er dens evne til at skelne fluorescerende signaler fra stærkt overlappende farvestoffer og derved øge antallet af overflademarkører, der kan vurderes samtidigt i hver prøve. Konventionel flowcytometri bruger båndpasfiltre og er begrænset til en fluorochrom pr. Detektorsystem6. Fuldspektret flowcytometri indsamler signaler over hele spektret af fluorochromen ved hjælp af 64 detektorer på et fem-laser spektral flowcytometrisystem 7,8. Derudover drager fuldspektret flowcytometri fordel af APD (Avalanche Photo Diode) detektorer, der har øget følsomhed i forhold til fotomultiplikatorrørdetektorer, der findes på konventionelle flowcytometre8. Derfor er denne tilgang ideel til de heterogene cellepopulationer, såsom mononukleære celler i perifert blod eller murine sekundære lymfoide organcellesuspensioner, da det eliminerer behovet for isolering af specifikke T-cellepopulationer før calciumfarvestofmærkning. I stedet kan celleoverflademarkørekspressionsprofiler og flowcytometri-gating efter dataindsamling bruges til at vurdere calciumresponser i hver population af interesse. Som vist i denne rapport kan Indo-1 let kombineres med otte fluorkromkonjugerede antistoffer, hvilket resulterer i i alt 10 unikke spektrale signaturer. Desuden kan denne metode let anvendes på blandinger af celler fra genisk forskellige muselinjer, hvilket muliggør samtidig analyse af calciumresponser i vildtype-T-celler sammenlignet med dem fra en genmålrettet muselinje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

Calciumtilstrømning som reaktion på T-cellereceptorstimulering er et almindeligt mål for T-cellesignalering. Flere calciumindikatorfarvestoffer er blevet udviklet til vurdering af calciumsignalering ved båndpasflowcytometri. Denne protokol er designet til at måle calciumresponser i primære murin T-celler ved hjælp af fuldspektret flowcytometri. Samlede splenocytter er mærket med det ratiometriske calciumindikatorfarvestof Indo-1 sammen med et panel af fluorkromkonjugerede antistoffer mod celleoverflademolekyler. Udnyttelse af mulighederne for fuldspektret flowcytometri giver en platform til udnyttelse af en bred vifte af celleoverfladepletter i kombination med Indo-1. Celler analyseres derefter i realtid ved 37 °C før og efter tilsætning af et anti-CD3-antistof for at stimulere T-cellereceptoren. Efter blanding af spektralsignalerne beregnes forholdet mellem calciumbundet og calciumfrit Indo-1 og kan visualiseres over tid for hver lukket population af splenocytter. Denne teknik kan muliggøre samtidig analyse af calciumresponser i flere cellepopulationer.

Den eksperimentelle arbejdsgang til vurdering af calciumresponser i primære murin-T-celler ved anvendelse af et Indo-1-ratiometrisk farvestof med multiplexerende overfladepletter er vist i figur 1. Efter høst og behandling af musesplenocytterne i en enkelt cellesuspension farves cellerne med en Indo-1 AM-ester og overfladen farves med fluorkrombundne antistoffer. Når farvestofbelastningen og antistoffarvningen er afsluttet, opvarmes lymfocytprøverne til en biologisk temperatur (37 °C). ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calciumtilstrømning, et mål for T-cellesignalering, er en effektiv måde at analysere reaktioner på T-cellereceptorstimulering. Denne protokol til multiplexing af Indo-1 med paneler af antistoffer rettet mod celleoverflademolekyler udnytter de meget fleksible muligheder for fuldspektret flowcytometri.

Analyse af T-cellereceptor-induceret calciumtilstrømning i primære murin-T-celler ved fuldspektret flowcytometri

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Protokollen giver efterforskere mulighed for samtidig at måle calciumrespons i primære T-celler sammen med at vurdere deres delmængde og overfladefænotype. Den største fordel ved denne teknik er, at den undgår behovet for at isolere specifikke undergrupper af celler, før de undersøger deres calciumresponser. Til at begynde med skal du forberede en mikrogram pr. mikroliter stamopløsning af Indo-1 AM ved at tilsætte 50 mikroliter DMSO i et hætteglas indeholdende 50 mikrogram Indo-1 AM. Stamopløsningen fortyndes til et passende volumen cRPMI og en koncentration på seks mikrogram pr. ml.Placer mediet i et vandbad ved 37 grader Celsius. Brug derefter dette medium til at fortynde en tidligere fremstillet cellesuspension i et en-til-en-forhold for at få fem til 6 millioner celler pr. Milliliter. Derefter tilsættes en milliliter cellesuspension pr. Brønd pr. Eksperimentel tilstand til en 12-brønds vævskulturplade.Forbered en enkelt farvet kontrolprøve til calciumfri Indo-1 ved at tilføje EGTA til Indo-1 farvestofbelastede celler. Forbered en brønd til biologisk negativ kontrol uden fluoroforer eller Indo-1 farvestof. Der fremstilles en Indo-1-positiv kontrol ved tilsætning af ionomycin i en koncentration på 50 mikromol til den farvestofbelastede cellesuspension ved flowcytometeret.Forbered også en brønd til enkeltpletkontrol til yderligere cellepopulationer ved hjælp af antistofkonjugerede fluoroforer. Derefter tilsættes to mikrogram FC-receptorblokerende antistof pr. Million celler og inkuberes pladen i 45 minutter ved at tappe hvert 15. minut for at resuspendere cellerne. Efter inkubation blandes og fjernes hele mængden af celler fra pladen og tilsættes til 1,7 ml mikrocentrifugerør.Supernatanten centrifugeres og dekanteres. Når cellerne er vasket med en milliliter forvarmet cRPMI, pelleteres igen og supernatanten dekanteres. Resuspender cellerne i en milliliter cRPMI og inkuber hvert rør, så toppen af røret er let åben for gasudveksling, hvilket muliggør fuldstændig de-esterificering af de intracellulære AM-estere.Derefter fremstilles en masterblanding af alle de brugerdefinerede fluorkromkonjugerede antistoffer og tilsættes til hvilecellerne for en milliliter af cellevolumenet. Efter hvile pellet cellerne og vask pelleten ved at resuspendere i en milliliter cRPMI kølet til fire grader Celsius. Gentag dette trin og læg rørene på is.Resuspender individuelle prøver i 500 mikroliter phenol rødfri cRPMI ved hjælp af et fem milliliter polystyrenflowrør med en hætte. For at opretholde temperaturen ved hjælp af calciumfluxanalyse skal du forberede et perlebad ved at tilføje badeperler til et lille vandbad og varme det op til 37 grader Celsius. Skær forsigtigt et 50 ml kronikrør i halve og kassér toppen af røret.Fyld tre fjerdedele af det resterende rør med badeperler og lad det nå 37 grader Celsius i perlebadet. Placer perlebadet nær et flowcytometer sammen med et styrofoamstativ for at placere røret. Før analysen på flowcytometeret opvarmes rørene individuelt til 37 grader Celsius i syv minutter.Log ind på flowcytometersoftwaren, og klik på fanen Bibliotek. Vælg derefter fluorescerende tags for at tilføje calciumbundet Indo-1 og calciumfri Indo-1. Vælg derefter UV-laser under fluorescerende taggrupper, og klik på tilføj for at tilføje et fluorescerende tagnavn.Vælg laserexcitations- og emissionsbølgelængden, og klik derefter på Gem. Fortsæt til den eksperimentelle opsætning. Klik på fanen Anskaffelse, Åbn/opret et nyt eksperiment, og tilføj de ønskede fluorescerende tags til eksperimentet.Opret en referencegruppe og en ny eksempelgruppe til eksperimentet, og navngiv begge grupper. Under fanen Opkøb skal du indstille begivenhederne til at optage maksimalt til 10 millioner, stoppe lydstyrken til det maksimale volumen på 3000 mikroliter og stoptiden til maksimalt 36.000 sekunder. Anskaf enkeltfarvede kontroller til brugerdefinerede konjugerede antistoffer inkluderet i flerfarvepanelet og til Indo-1 funktionelt farvestof.Tilsæt 50 mikromol ionomycin til den calciumbundne Indo-1 positive kontrol og hvirvel. Føj flowrøret til prøveinjektionskortet, og klik på Optag. Tilføj derefter calciumfri Indo-1 negativ kontrol til flowcytometeret, og klik på Optag.Ublandet de enkeltfarvede kontroller ved at klikke på knappen Unmix. Når blandingen er fuldført, skal du oprette sekventielle afbildninger ved hjælp af det ublandede regneark, f.eks. SSC-A versus FSC-A, til fjernelse af snavs fra prøven og SSC-A versus SSC-H til fjernelse af dubletter. Opret derefter porte ved at klikke på Plot.Føj et plot til regnearket, og dobbeltklik inde i porten for at oprette en nedstrøms lukket befolkning. Fortsæt, indtil der er taget højde for alle de relevante populationer. Opvarm derefter de tidligere fremstillede enkeltfarvede kontrolprøver til 37 grader Celsius til sekventiel analyse.Opsæt flowcytometrisoftwaren, og kør DI i isvand i to til tre minutter for at sikre flowcytometerets flydende stabilitet. Konfigurer sekventielle afbildninger i det ublandede regneark ved at oprette porte ved hjælp af polygonrektanglet eller ellipsegitterknapperne for at medtage den relevante population. Dobbeltklik inde i porten, og skift parametrene y- og x-aksen til SSC-A versus SSC-H.Komplet definition af akseparametrene ved at venstreklikke på aksen. Opret et plot med SSC-A versus levedygtighedsfarvesignal. Gate de levende celler, der er negative for aminfarvestoffarvning.Levende celler, der er negative for levende døde farvninger, klynger sig ved nulmærket på både y- og x-aksen. Dobbeltklik på det indvendige plot for at oprette et nyt plot, der kun indeholder enkeltcellede levende lymfocytter. Skift Y-aksen til Indo-1 versus tiden på x-aksen for visualisering af calciumtilstrømningen.Placer derefter den opvarmede biologiske prøve i maskinens SIT. Kør prøverne ved 2.500 til 3000 begivenheder pr. Sekund på en medium strømningshastighed for at visualisere calciumtilstrømning i et begrænset antal cellepopulationer. Tilføj det næste rør til perlebadet i erhvervelseskontrol.Tryk på Record for at registrere de indledende data i 30 sekunder for at opnå et basalniveau af calciumsignalering i prøven. Klik derefter på Stop og fjern røret fra prøveinjektionsporten. Der tilsættes 30 mikrogram ukonjugeret anti-CD3 direkte i prøveglasset for at starte calciumtilstrømningen.Placer hurtigt slangen tilbage på prøveinjektionsporten, og tryk på Optag i softwaren. Optag data i syv minutter, og se den tid, der er gået under erhvervelseskontrollerne i softwaren. Tryk derefter på Stop i softwaren.Tilsæt et mikrogram pr. milliliter ionomycin og optag i 30 sekunder for at opnå det maksimale calciumsignal i cellerne af interesse. Fortsæt til næste eksempel, og gentag arbejdsprocessen, indtil alle prøverne er indsamlet. Gem eksperimentet, og klik på eksport-zip-filen.Ublandede filer uploades til ekstern flowcytometrianalysesoftware. Et stabilt konsistent signal i et plot af tid versus sidespredning indikerede flydende stabilitet. Lymfocytpopulationen var lukket efterfulgt af diskrimination af singlets på et plot af sidespredningshøjde versus område.Singlets blev vurderet for levedygtighed. Derefter blev gating på CD19-negativ befolkning anvendt. Disse T-celleundergrupper blev vurderet ved hjælp af antistoffer mod CD4 og CD8 ved at visualisere calciumbundet Indo-1-fluorescens versus tid.I individuelle cellepopulationer viste plottet af calciumbundet Indo-1 versus tid en baseline før stimulering. Et toprespons, da intracellulære calciumniveauer faldt, og calciumresponset fremkaldes ved tilsætning af ionomycin. Før anti-CD3-antistoftilsætning blev der påvist et svagt calciumbundet Indo-1-signal.Under topresponsen viste cellerne et stærkt calciumbundet Indo-1-signal og reduceret calciumfri Indo-1. Fem minutter efter toppen vendte Indo-1-fluorescensen næsten tilbage til baseline. Efter ionomycintilsætning blev et robust signal af calciumbundet Indo-1 visualiseret, hvilket indikerer tilstrækkelig farvestofbelastning af cellerne.Analyse af de sjældne populationer blev udført ved at plotte calciumbundet Indo-1 versus calciumfri Indo-1 efter gating på hver population af interesse. Og analysere calciumresponsen over hele tidsforløbet for hver delmængde. Calciumflux ved hjælp af fuldspektret profilering kan føre til cytometrisk analyse med høj parameter flow i en række immunundergrupper.Højdimensionel analyse til upartisk klyngedannelse af T-celleundergrupper kan anvendes i kombination med flowcytometri med høj parameter til avanceret analyse. Denne teknik er udviklet til analyse af flere immunundergrupper i forbindelse med hinanden i en bulkprøve.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Brug af flowcytometri at vurdere tilstanden af ​​kromatin i T-celler

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisering af humane monocyt delmængder af fuldblod Flow flowcytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bestemmelse af regulerende T celle Subsets i Murine Thymus, pancreas afdrypning lymfeknude og milten ved hjælp af flowcytometri

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...