Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Veel dank aan onze collega's bij Cytek voor voortdurende discussies over volledige spectrale cytometrische analyse op de Aurora en SpectroFlo software. Figuren werden gemaakt met BioRender.com.

Muizen werden onderhouden op de Anschutz Medical-campus van de Universiteit van Colorado in overeenstemming met IACUC-protocollen. Alle muizen werden geëuthanaseerd volgens de AAALAC-normen.
1. Bereiding van immuuncellen uit de milt van de muis
LET OP: Euthanaseer naïeve muizen met CO 2-euthanasie. C57BL / 6-muizen gekocht bij Jackson Laboratories en intern gefokt, worden gebruikt voor experimenten op de leeftijd van 6-12 weken. Zowel man...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase,+Itk.">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2++channels.">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).</li><li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde test die is ontworpen om calciumresponsen te meten in primaire muizen T-cellen geladen met getitreerde Indo-1 ratiometrische indicatorkleurstof met behulp van full spectrum flowcytometrie 7,8. Het voordeel van het uitvoeren van calciumfluxtesten met behulp van volledige spectrum flowcytometrie is de mogelijkheid om oppervlaktecelmarkerkleuring te multiplexen in combinatie met beoordeling van Indo-1-fluorescentie. Full ...

T-celreceptor (TCR) geïnduceerde calciuminflux is een nuttige maat voor T-celactivatie en wordt vaak gebruikt om te bepalen of een populatie T-cellen verminderde reacties heeft in de proximale stappen van de TCR-signaleringsroute1. Metingen van calciuminstroom worden over het algemeen uitgevoerd door de T-cellen vooraf te labelen met één of een paar fluorescerende calciumindicatorkleurstoffen en vervolgens de fluorescerende signalen te onderzoeken met behulp van flowcytometrie in realtime na TCR-crosslinking 2,3,4. Indo-1, een ratio-metrische calciumkleurstof, wordt geëxciteerd door de UV-laser met piekemissies op twee verschillende golflengten, afhankelijk van calciumbinding5, en is een veelgebruikte indicatorkleurstof voor flowcytometrie-analyse van calciumresponsen in levende lymfocyten. Omdat het emissieprofiel van Indo-1 vrij breed is, kan het een uitdaging zijn om Indo-1-beoordeling te combineren met gelijktijdige analyse van meerdere celoppervlakmarkers door band-pass flowcytometrie. Deze beperking beperkt het gebruik van flowcytometrie-analyse van calciumresponsen op voorgezuiverde populaties van T-cellen of op populaties geïdentificeerd door een beperkte set celoppervlakmoleculen.
Om de beperkingen van het meten van calciumresponsen op heterogene populaties van primaire lymfocyten met behulp van band-pass flowcytometrie aan te pakken, werd een protocol ontwikkeld om Indo-1 fluorescentie te meten met behulp van full spectrum flow cytometrie. Deze methode maakt het mogelijk om Indo-1 te multiplexen met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie. Het voordeel van het gebruik van full spectrum flowcytometrie ten opzichte van conventionele flowcytometrie is het vermogen om de fluorescerende signalen te onderscheiden van sterk overlappende kleurstoffen, waardoor het aantal oppervlaktemarkers dat tegelijkertijd in elk monster kan worden beoordeeld, toeneemt. Conventionele flowcytometrie maakt gebruik van bandpassfilters en is beperkt tot één fluorochroom per detectorsysteem6. Full spectrum flowcytometrie verzamelt signalen over het gehele spectrum van het fluorochroom met behulp van 64 detectoren op een vijf-laser spectraal flowcytometriesysteem 7,8. Bovendien maakt full spectrum flowcytometrie gebruik van APD-detectoren (Avalanche Photo Diode) die een verhoogde gevoeligheid hebben ten opzichte van fotomultiplicatorbuisdetectoren die aanwezig zijn op conventionele flowcytometers8. Bijgevolg is deze aanpak ideaal voor de heterogene celpopulaties, zoals perifere mononucleaire bloedcellen of muriene secundaire lymfoïde orgaancelsuspensies, omdat het de noodzaak voor de isolatie van specifieke T-celpopulaties voorafgaand aan calciumkleurstofetikettering elimineert. In plaats daarvan kunnen celoppervlakmarkerexpressieprofielen en flowcytometriegating na gegevensverzameling worden gebruikt om calciumresponsen in elke relevante populatie te beoordelen. Zoals aangetoond in dit rapport, kan Indo-1 gemakkelijk worden gecombineerd met acht fluorochroom-geconjugeerde antilichamen, wat resulteert in een totaal van 10 unieke spectrale handtekeningen. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast op mengsels van cellen uit congenetisch verschillende muizenlijnen, waardoor de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in wildtype T-cellen mogelijk is in vergelijking met die van een gengerichte muizenlijn.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

Calciuminstroom als reactie op T-celreceptorstimulatie is een veel voorkomende maat voor T-celsignalering. Verschillende calciumindicatorkleurstoffen zijn ontwikkeld om calciumsignalering te beoordelen door band-pass flowcytometrie. Dit protocol is ontworpen om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te meten met behulp van full spectrum flowcytometrie. Totale splenocyten worden gelabeld met de ratiometrische calciumindicatorkleurstof Indo-1, samen met een panel van fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen celoppervlakmoleculen. Het benutten van de mogelijkheden van full spectrum flowcytometrie biedt een platform voor het gebruik van een breed scala aan celoppervlakvlekken in combinatie met Indo-1. Cellen worden vervolgens in real-time geanalyseerd bij 37 °C voor en na de toevoeging van een anti-CD3-antilichaam om de T-celreceptor te stimuleren. Na het ontmengen van de spectrale signalen wordt de verhouding van calciumgebonden tot calciumvrije Indo-1 berekend en kan deze in de loop van de tijd worden gevisualiseerd voor elke gated populatie van splenocyten. Deze techniek kan de gelijktijdige analyse van calciumresponsen in meerdere celpopulaties mogelijk maken.

De experimentele workflow om calciumresponsen in primaire murine T-cellen te beoordelen met behulp van een Indo-1 ratiometrische kleurstof met multiplexing oppervlaktevlekken is weergegeven in figuur 1. Na het oogsten en verwerken van de splenocyten van de muis tot een enkele celsuspensie, worden de cellen gekleurd met een Indo-1 AM-ester en het oppervlak gekleurd met fluorochroom-gekoppelde antilichamen. Zodra de kleurstofbelasting en antilichaamkleuring zijn voltooid, worden de lymfocytenm...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Calciuminflux, een maat voor T-celsignalering, is een effectieve manier om reacties op T-celreceptorstimulatie te analyseren. Dit protocol voor het multiplexen van Indo-1 met panelen van antilichamen gericht op celoppervlakmoleculen maakt gebruik van de zeer flexibele mogelijkheden van volledige spectrum flowcytometrie.

Analyse van T-celreceptor-geïnduceerde calciuminstroom in primaire muizen T-cellen door full spectrum flow cytometrie

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Het protocol stelt onderzoekers in staat om tegelijkertijd de calciumrespons in primaire T-cellen te meten, samen met het beoordelen van hun subset en oppervlaktefenotype. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de noodzaak vermijdt om specifieke subsets van cellen te isoleren voordat hun calciumresponsen worden onderzocht. Bereid om te beginnen een microgram per microliter stamoplossing van Indo-1 AM door 50 microliter DMSO toe te voegen aan een injectieflacon met 50 microgram Indo-1 AM. Verdun de stamoplossing tot een geschikt volume cRPMI en een concentratie van zes microgram per milliliter.Plaats het medium in een waterbad op 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens dit medium om een eerder bereide celsuspensie te verdunnen in een één-op-één verhouding om vijf tot 6 miljoen cellen per milliliter te krijgen. Voeg vervolgens aan een weefselkweekplaat met 12 putten één milliliter celsuspensie per put per experimentele toestand toe.Bereid een enkel gekleurd controlemonster voor calciumvrije Indo-1 door EGTA toe te voegen aan Indo-1 kleurstof-geladen cellen. Bereid een put voor voor biologische negatieve bestrijding zonder fluoroforen of Indo-1-kleurstof. Bereid een Indo-1 positieve controle voor door ionomycine in een concentratie van 50 micromol toe te voegen aan de kleurstof-geladen celsuspensie bij de flowcytometer.Bereid ook een put voor voor enkele kleurcontroles voor extra celpopulaties met behulp van antilichaam geconjugeerde fluoroforen. Voeg vervolgens twee microgram FC-receptorblokkerend antilichaam per miljoen cellen toe en incuber de plaat gedurende 45 minuten met tikken om de 15 minuten om de cellen te resuspenderen. Na incubatie, meng en verwijder het volledige volume cellen van de plaat en voeg het toe aan 1,7 milliliter microcentrifugebuizen.Centrifugeer en decanteer het supernatant. Zodra de cellen zijn gewassen met een milliliter voorverwarmde cRPMI, pellet opnieuw en decanteer het supernatant. Resuspendeer de cellen in één milliliter cRPMI en incubeer elke buis, waarbij de bovenkant van de buis enigszins open blijft voor gasuitwisseling, waardoor de intracellulaire AM-esters volledig kunnen worden gedesterd.Bereid vervolgens een mastermix van alle door de gebruiker gedefinieerde fluorochroom geconjugeerde antilichamen en voeg deze toe aan de rustende cellen voor één milliliter van het celvolume. Na rust, pellet de cellen en was de pellet door opnieuw te suspenderen in een milliliter cRPMI gekoeld tot vier graden Celsius. Herhaal deze stap en plaats de buizen op ijs.Resuspendeerde individuele monsters in 500 microliter fenolroodvrije cRPMI met behulp van een polystyreenstroombuis van vijf milliliter met een dop. Om de temperatuur te handhaven met behulp van calciumfluxanalyse, bereidt u een kralenbad voor door badparels toe te voegen aan een klein waterbad en het op te warmen tot 37 graden Celsius. Snijd voorzichtig een kroniekbuis van 50 milliliter doormidden en gooi de bovenkant van de buis weg.Vul driekwart van de resterende buis met badkralen en laat het 37 graden Celsius bereiken in het kralenbad. Plaats het kraalbad in de buurt van een flowcytometer, samen met een piepschuimen rek om de buis te positioneren. Verwarm vóór de analyse op de flowcytometer de buisjes afzonderlijk tot 37 graden Celsius gedurende zeven minuten.Log in op de flowcytometersoftware en klik op het tabblad Bibliotheek. Selecteer vervolgens fluorescerende tags om calciumgebonden Indo-1 en calciumvrije Indo-1 toe te voegen. Selecteer vervolgens UV-laser onder fluorescerende taggroepen en klik op toevoegen om een fluorescerende tagnaam toe te voegen.Kies de golflengte van de laserexcitatie en -emissie en klik vervolgens op Opslaan. Ga verder met de experimentele opstelling. Klik op het tabblad Acquisitie, Open/Maak een nieuw experiment en voeg de gewenste fluorescerende tags toe aan het experiment.Maak een referentiegroep en een nieuwe voorbeeldgroep voor het experiment en label beide groepen. Stel op het tabblad Acquisities de gebeurtenissen in om op te nemen op het maximum van 10 miljoen, het volume te stoppen tot het maximale volume van 3000 microliter en de stoptijd te stoppen tot het maximum van 36.000 seconden. Verkrijg enkele gekleurde controles voor door de gebruiker gedefinieerde geconjugeerde antilichamen in het meerkleurige paneel en voor Indo-1 functionele kleurstof.Voeg 50 micromol ionomycine toe aan de calciumgebonden Indo-1 positieve controle en vortex. Voeg de stroombuis toe aan de injectieplaat van het monster en klik op Opnemen. Voeg vervolgens calciumvrije Indo-1 negatieve controle toe aan de flowcytometer en klik op Opnemen.Verwijder de enkele gekleurde besturingselementen door op de knop Unmix te klikken. Zodra het ontmengen is voltooid, maakt u opeenvolgende plots met behulp van het ongemengde werkblad, zoals SSC-A versus FSC-A, voor het verwijderen van vuil uit het monster en SSC-A versus SSC-H om doubletten te verwijderen. Maak vervolgens poorten aan door op Plot te klikken.Voeg een plot toe aan het werkblad en dubbelklik binnen de poort om een stroomafwaartse gated populatie te maken. Ga door totdat alle populaties van belang zijn meegeteld. Verwarm vervolgens de eerder bereide enkelgekleurde controlemonsters tot 37 graden Celsius voor sequentiële analyse.Stel de flowcytometriesoftware in en voer DI gedurende twee tot drie minuten uit in ijswater om de vloeistofstabiliteit van de flowcytometer te garanderen. Stel opeenvolgende plots in op het ongemengde werkblad door poorten te maken met behulp van de veelhoekige rechthoek of ellipspoortknoppen om de populatie van belang op te nemen. Dubbelklik binnen de poort en wijzig de parameters van de y- en x-as in SSC-A versus SSC-H.Voltooi het definiëren van de asparameters door met de linkermuisknop op de as te klikken. Maak een plot met SSC-A versus levensvatbaarheid kleurstofsignaal. Sluit de levende cellen die negatief zijn voor aminekleurstofkleuring.Levende cellen die negatief zijn voor levende dode kleuring zullen clusteren op het nulteken op zowel de y- als de x-as. Dubbelklik op de binnenste plot om een nieuwe plot te maken die alleen eencellige levende lymfocyten bevat. Verander de Y-as in Indo-1 versus tijd op de x-as voor visualisatie van de calciuminstroom.Plaats vervolgens het opgewarmde biologische monster in de SIT van de machine. Voer de monsters uit met 2.500 tot 3000 gebeurtenissen per seconde op een gemiddelde stroomsnelheid om de calciuminstroom in een beperkt aantal celpopulaties te visualiseren. Voeg de volgende buis toe aan het kralenbad in acquisitiecontrole.Druk op Record om de initiële gegevens gedurende 30 seconden op te nemen om een basaal niveau van calciumsignalering in het monster te verkrijgen. Klik vervolgens op Stop en verwijder de buis uit de injectiepoort van het monster. Voeg 30 microgram ongeconjugeerd anti-CD3 rechtstreeks toe aan de monsterbuis om de calciuminstroom te initiëren.Plaats de buis snel terug op de injectiepoort van het monster en druk op Opnemen in de software. Neem gegevens gedurende zeven minuten op en kijk naar de tijd die is verstreken onder de acquisitiebesturingselementen in de software. Druk vervolgens op Stop in de software.Voeg één microgram per milliliter ionomycine toe en neem gedurende 30 seconden op om het maximale calciumsignaal in de cellen van belang te verkrijgen. Ga verder met het volgende voorbeeld en herhaal de workflow totdat alle monsters zijn verzameld. Sla het experiment op en klik op het zip-bestand exporteren.Ongemengde bestanden worden geüpload naar externe flowcytometrie-analysesoftware. Een stabiel consistent signaal in een plot van tijd versus zijverstrooiing duidde op vloeistofstabiliteit. De lymfocytenpopulatie werd afgesloten, gevolgd door discriminatie van singlets op een perceel van zijspreidingshoogte versus gebied.Singlets werden beoordeeld op levensvatbaarheid. Vervolgens werd gating op CD19-negatieve populatie toegepast. Deze T-cel subsets werden beoordeeld met behulp van antilichamen tegen CD4 en CD8 door calciumgebonden Indo-1 fluorescentie versus tijd te visualiseren.In individuele celpopulaties toonde de plot van calciumgebonden Indo-1 versus tijd een basislijn voorafgaand aan stimulatie. Een piekrespons als intracellulaire calciumspiegels daalden en de calciumrespons werd opgewekt door ionomycine toe te voegen. Voorafgaand aan anti-CD3-antilichaamtoevoeging werd een zwak calciumgebonden Indo-1-signaal gedetecteerd.Tijdens de piekrespons vertoonden de cellen een sterk calciumgebonden Indo-1-signaal en verminderden ze calciumvrij Indo-1. Vijf minuten na de piek keerde de Indo-1 fluorescentie bijna terug naar de basislijn. Na toevoeging van ionomycine werd een robuust signaal van calciumgebonden Indo-1 gevisualiseerd, wat wijst op voldoende kleurstofbelasting van de cellen.Analyse van de zeldzame populaties werd uitgevoerd door calciumgebonden Indo-1 versus calciumvrij Indo-1 uit te zetten na gating op elke populatie van belang. En het analyseren van de calciumrespons over het gehele tijdsverloop voor elke subset. Calciumflux met behulp van full spectrum profiling kan leiden tot hoge parameter flow cytometrische analyse in een verscheidenheid van immuun subsets.Hoogdimensionale analyse voor onbevooroordeelde clustering van T-celsubsets kan worden gebruikt in combinatie met flowcytometrie met hoge parameters voor geavanceerde analyse. Deze techniek is ontwikkeld voor de analyse van meerdere immuunsubsets in combinatie met elkaar in een bulkmonster.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Bepaling van regelgevende T cel Subsets in lymfkliertest Thymus, alvleesklier aftappen lymfeklier en milt met behulp van Stroom Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...