Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Un grand merci à nos collègues de Cytek pour les discussions continues sur l’analyse cytométrique spectrale complète sur les logiciels Aurora et SpectroFlo. Les figurines ont été créées avec BioRender.com.

Les souris ont été maintenues sur le campus médical Anschutz de l’Université du Colorado conformément aux protocoles de l’IACUC. Toutes les souris ont été euthanasiées selon les normes AAALAC.
1. Préparation des cellules immunitaires de la rate de souris
NOTE: Euthanasier les souris naïves avec l’euthanasie au CO2 . Les souris C57BL / 6 achetées aux laboratoires Jackson et élevées en interne sont utilisées pour des expé...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. 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Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Ce protocole décrit un dosage optimisé conçu pour mesurer les réponses calciques dans les lymphocytes T murins primaires chargés de colorant indicateur ratiométrique Indo-1 titré en utilisant la cytométrie en fluxà spectre complet 7,8. L’avantage d’effectuer des tests de flux de calcium à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet est la capacité de multiplexer la coloration des marqueurs cellulaires de surface en combinaison avec l’é...

L’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T (TCR) est une mesure utile de l’activation des lymphocytes T et est fréquemment utilisé pour déterminer si une population de lymphocytes T a des réponses altérées dans les étapes proximales de la voie de signalisation TCR1. Les mesures de l’afflux de calcium sont généralement effectuées en pré-marquant les lymphocytes T avec un ou une paire de colorants indicateurs de calcium fluorescents, puis en examinant les signaux fluorescents en utilisant la cytométrie de flux en temps réel après réticulation TCR 2,3,4. Indo-1, un colorant calcique proportionnel, est excité par le laser UV avec des émissions de pointe à deux longueurs d’onde différentes en fonction de la liaison au calcium5, et est un colorant indicateur couramment utilisé pour l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques dans les lymphocytes vivants. Comme le profil d’émission d’Indo-1 est assez large, il peut être difficile de combiner l’évaluation de l’Indo-1 avec l’analyse simultanée de plusieurs marqueurs de surface cellulaire par cytométrie en flux passe-bande. Cette limitation limite l’utilisation de l’analyse par cytométrie en flux des réponses calciques aux populations pré-purifiées de lymphocytes T ou aux populations identifiées par un ensemble limité de molécules de surface cellulaire.
Pour remédier aux limites de la mesure des réponses calciques sur des populations hétérogènes de lymphocytes primaires à l’aide de la cytométrie en flux passe-bande, un protocole a été développé pour mesurer la fluorescence Indo-1 à l’aide de la cytométrie en flux à spectre complet. Cette méthode permet de multiplexer Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire, en tirant parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet. L’avantage de l’utilisation de la cytométrie en flux à spectre complet par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est sa capacité à distinguer les signaux fluorescents des colorants qui se chevauchent fortement, augmentant ainsi le nombre de marqueurs de surface qui peuvent être évalués simultanément dans chaque échantillon. La cytométrie de flux conventionnelle utilise des filtres passe-bande et est limitée à un fluorochrome par système de détection6. La cytométrie en flux à spectre complet recueille des signaux sur tout le spectre du fluorochrome à l’aide de 64 détecteurs sur un système de cytométrie spectrale en fluxà cinq lasers 7,8. De plus, la cytométrie en flux à spectre complet tire parti des détecteurs APD (Avalanche Photo Diode) qui ont une sensibilité accrue par rapport aux détecteurs à tube photomultiplicateur présents sur les cytomètres en flux conventionnels8. Par conséquent, cette approche est idéale pour les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique ou les suspensions de cellules d’organes lymphoïdes secondaires murins, car elle élimine le besoin d’isoler des populations spécifiques de lymphocytes T avant le marquage du colorant calcique. Au lieu de cela, les profils d’expression des marqueurs de surface cellulaire et la cytométrie en flux après la collecte de données peuvent être utilisés pour évaluer les réponses au calcium dans chaque population d’intérêt. Comme le montre ce rapport, Indo-1 peut facilement être combiné avec huit anticorps conjugués au fluorochrome, ce qui donne un total de 10 signatures spectrales uniques. En outre, cette méthode peut être facilement appliquée à des mélanges de cellules de lignées de souris congéniquement distinctes, permettant l’analyse simultanée des réponses calciques dans les cellules T de type sauvage par rapport à celles d’une lignée de souris ciblant un gène.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

L’afflux de calcium en réponse à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T est une mesure courante de la signalisation des lymphocytes T. Plusieurs colorants indicateurs de calcium ont été développés pour évaluer la signalisation du calcium par cytométrie en flux passe-bande. Ce protocole est conçu pour mesurer les réponses calciques dans les cellules T murines primaires en utilisant la cytométrie en flux à spectre complet. Les splénocytes totaux sont marqués avec le colorant indicateur de calcium ratiométrique Indo-1, ainsi qu’un panel d’anticorps conjugués au fluorochrome contre les molécules de surface cellulaire. L’exploitation des capacités de la cytométrie en flux à spectre complet fournit une plate-forme pour utiliser un large éventail de colorations de surface cellulaire en combinaison avec Indo-1. Les cellules sont ensuite analysées en temps réel à 37 °C avant et après l’ajout d’un anticorps anti-CD3 pour stimuler le récepteur des lymphocytes T. Après avoir démélangé les signaux spectraux, le rapport de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium est calculé et peut être visualisé au fil du temps pour chaque population fermée de splénocytes. Cette technique peut permettre l’analyse simultanée des réponses calciques dans plusieurs populations cellulaires.

Le flux de travail expérimental pour évaluer les réponses au calcium dans les cellules T murines primaires à l’aide d’un colorant ratiométrique Indo-1 avec des taches de surface multiplexantes est illustré à la figure 1. Après avoir récolté et traité les splénocytes de souris en une seule suspension cellulaire, les cellules sont colorées avec un ester Indo-1 AM et colorées en surface avec des anticorps liés au fluorochrome. Une fois la charge du colorant et la coloration d...

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Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

L’afflux de calcium, une mesure de la signalisation des lymphocytes T, est un moyen efficace d’analyser les réponses à la stimulation des récepteurs des lymphocytes T. Ce protocole de multiplexage d’Indo-1 avec des panels d’anticorps dirigés contre les molécules de surface cellulaire tire parti des capacités très flexibles de la cytométrie en flux à spectre complet.

Analyse de l’afflux de calcium induit par le récepteur des lymphocytes T dans les lymphocytes T murins primaires par cytométrie en flux à spectre complet

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Le protocole permet aux chercheurs de mesurer simultanément la réponse au calcium dans les cellules T primaires et d’évaluer leur sous-ensemble et leur phénotype de surface. Le principal avantage de cette technique est qu’elle évite d’avoir à isoler des sous-ensembles spécifiques de cellules avant d’examiner leurs réponses au calcium. Pour commencer, préparez une solution mère d’Indo-1 AM d’un microgramme par microlitre en ajoutant 50 microlitres de DMSO dans un flacon contenant 50 microgrammes d’Indo-1 AM. Diluer la solution mère dans un volume approprié de cRPMI et une concentration de six microgrammes par millilitre.Placez le milieu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, utilisez ce milieu pour diluer une suspension cellulaire préalablement préparée à un rapport de un à un pour obtenir cinq à 6 millions de cellules par millilitre. Ensuite, sur une plaque de culture tissulaire de 12 puits, ajoutez un millilitre de suspension cellulaire par puits par condition expérimentale.Préparer un seul échantillon témoin coloré pour l’Indo-1 sans calcium en ajoutant de l’EGTA aux cellules chargées de colorant Indo-1. Préparer un puits pour le contrôle biologique négatif sans fluorophores ni colorant Indo-1. Préparer un témoin positif Indo-1 en ajoutant de l’ionomycine à une concentration de 50 micromoles à la suspension cellulaire chargée de colorant au cytomètre en flux.De plus, préparez un puits pour les contrôles de taches uniques pour des populations cellulaires supplémentaires en utilisant des fluorophores conjugués d’anticorps. Ajoutez ensuite deux microgrammes d’anticorps bloquant les récepteurs FC par million de cellules et incuber la plaque pendant 45 minutes en tapotant toutes les 15 minutes pour remettre les cellules en suspension. Après l’incubation, mélangez et retirez tout le volume de cellules de la plaque et ajoutez-le à des tubes microcentrifuges de 1,7 millilitre.Centrifuger et décanter le surnageant. Une fois les cellules lavées avec un millilitre de cRPMI préchauffé, pelletez à nouveau et décantez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de cRPMI et incuber chaque tube, en laissant le haut du tube légèrement ouvert pour l’échange gazeux, permettant une deestérification complète des esters AM intracellulaires.Ensuite, préparez un mélange principal de tous les anticorps conjugués fluorochromes définis par l’utilisateur et ajoutez-le aux cellules au repos pour un millilitre du volume cellulaire. Après le repos, pelleter les cellules et laver la pastille en la remettant en suspension dans un millilitre de cRPMI refroidi à quatre degrés Celsius. Répétez cette étape et placez les tubes sur de la glace.Resuspendre des échantillons individuels dans 500 microlitres de cRPMI sans phénol rouge à l’aide d’un tube d’écoulement en polystyrène de cinq millilitres muni d’un bouchon. Pour maintenir la température à l’aide de l’analyse du flux de calcium, préparez un bain de perles en ajoutant des perles de bain à un petit bain-marie et réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Coupez soigneusement un tube chronique de 50 millilitres en deux et jetez le dessus du tube.Remplissez les trois quarts du tube restant avec des perles de bain et laissez-le atteindre 37 degrés Celsius dans le bain de perles. Placez le bain de billes près d’un cytomètre en flux, ainsi qu’un support en polystyrène pour positionner le tube. Avant l’analyse sur le cytomètre en flux, réchauffez les tubes individuellement à 37 degrés Celsius pendant sept minutes.Connectez-vous au logiciel de cytomètre en flux et cliquez sur l’onglet Bibliothèque. Sélectionnez ensuite des étiquettes fluorescentes pour ajouter de l’Indo-1 lié au calcium et de l’Indo-1 sans calcium. Sélectionnez ensuite Laser UV sous les groupes de balises fluorescentes et cliquez sur Ajouter pour ajouter un nom d’étiquette fluorescente.Choisissez l’excitation laser et la longueur d’onde d’émission, puis cliquez sur Enregistrer. Passez à la configuration expérimentale. Cliquez sur l’onglet Acquisition, Ouvrir/Créer une nouvelle expérience et ajouter les balises fluorescentes souhaitées à l’expérience.Créez un groupe de référence et un nouveau groupe d’échantillons pour l’expérience et étiquetez les deux groupes. Sous l’onglet Acquisitions, définissez les événements pour enregistrer au maximum à 10 millions, le volume d’arrêt au volume maximal de 3000 microlitres et le temps d’arrêt au maximum de 36 000 secondes. Acquérir des témoins à coloration unique pour les anticorps conjugués définis par l’utilisateur inclus dans le panneau multicolore et pour le colorant fonctionnel Indo-1.Ajouter 50 micromoles d’ionomycine au contrôle positif Indo-1 lié au calcium et au vortex. Ajoutez le tube d’écoulement à la carte d’injection d’échantillon et cliquez sur Enregistrer. Ajoutez ensuite un contrôle négatif Indo-1 sans calcium au cytomètre en flux et cliquez sur Enregistrer.Annulez le mélange des commandes colorées simples en cliquant sur le bouton Unmix. Une fois le démélange terminé, créez des tracés séquentiels à l’aide de la feuille de calcul non mélangée, comme SSC-A par rapport à FSC-A, pour enlever les débris de l’échantillon et SSC-A par rapport à SSC-H pour enlever les doublets. Créez ensuite des portes en cliquant sur Plot.Ajoutez un tracé à la feuille de calcul et double-cliquez à l’intérieur de la porte pour créer une population fermée en aval. Continuez jusqu’à ce que toutes les populations d’intérêt soient prises en compte. Ensuite, réchauffez les échantillons témoins colorés à une seule couleur préalablement préparés à 37 degrés Celsius pour une analyse séquentielle.Configurez le logiciel de cytométrie en flux et exécutez DI dans de l’eau glacée pendant deux à trois minutes pour assurer la stabilité fluidique du cytomètre en flux. Configurez des tracés séquentiels sur la feuille de calcul non mélangée en créant des portes à l’aide du rectangle polygonal ou des boutons de porte elliptique pour inclure la population d’intérêt. Double-cliquez à l’intérieur de la porte et remplacez les paramètres des axes y et x par SSC-A par rapport à SSC-H.Terminez la définition des paramètres de l’axe en cliquant avec le bouton gauche de la souris sur l’axe. Créez un tracé avec le signal de colorant SSC-A par rapport au colorant de viabilité. Fermez les cellules vivantes qui sont négatives pour la coloration au colorant amine.Les cellules vivantes négatives pour la coloration vivante morte se regrouperont à la marque zéro sur les axes y et x. Double-cliquez sur le graphique intérieur pour créer un nouveau graphique contenant uniquement des lymphocytes vivants unicellulaires. Changez l’axe des Y en Indo-1 en fonction du temps sur l’axe des x pour visualiser l’afflux de calcium.Ensuite, placez l’échantillon biologique chauffé dans le SIT de la machine. Exécutez les échantillons à 2 500 à 3000 événements par seconde sur un débit moyen pour visualiser l’afflux de calcium dans un nombre limité de populations cellulaires. Ajouter le tube suivant au bain de billes dans le contrôle d’acquisition.Appuyez sur Enregistrer pour enregistrer les données initiales pendant 30 secondes afin d’obtenir un niveau basal de signalisation calcique dans l’échantillon. Cliquez ensuite sur Arrêter et retirez le tube de l’orifice d’injection de l’échantillon. Ajouter 30 microgrammes d’anti-CD3 non conjugué directement dans le tube à échantillon pour initier l’afflux de calcium.Replacez rapidement le tube sur le port d’injection de l’échantillon et appuyez sur Enregistrer dans le logiciel. Enregistrez les données pendant sept minutes, en regardant le temps écoulé sous les contrôles d’acquisition du logiciel. Appuyez ensuite sur Arrêter dans le logiciel.Ajouter un microgramme par millilitre d’ionomycine et enregistrer pendant 30 secondes pour obtenir le signal de calcium maximal dans les cellules d’intérêt. Passez à l’échantillon suivant et répétez le workflow jusqu’à ce que tous les échantillons aient été collectés. Enregistrez l’expérience et cliquez sur le fichier zip d’exportation.Les fichiers non mélangés sont téléchargés vers un logiciel externe d’analyse de cytométrie en flux. Un signal stable et cohérent dans un tracé de la diffusion temporelle par rapport à la diffusion latérale indiquait une stabilité fluidique. La population lymphocytaire a été fermée, suivie d’une discrimination des singulettes sur une parcelle de hauteur de dispersion latérale par rapport à la surface.La viabilité des singulettes a été évaluée. Ensuite, un point de contrôle sur la population CD19 négative a été appliqué. Ces sous-ensembles de lymphocytes T ont été évalués à l’aide d’anticorps dirigés contre CD4 et CD8 en visualisant la fluorescence Indo-1 liée au calcium en fonction du temps.Dans les populations cellulaires individuelles, le graphique de l’Indo-1 lié au calcium en fonction du temps a montré une ligne de base avant la stimulation. Une réponse maximale lorsque les niveaux de calcium intracellulaire ont diminué et la réponse calcique a été provoquée par l’ajout d’ionomycine. Avant l’ajout d’anticorps anti-CD3, un faible signal Indo-1 lié au calcium a été détecté.Au cours de la réponse maximale, les cellules ont montré un fort signal Indo-1 lié au calcium et une réduction de l’Indo-1 sans calcium. Cinq minutes après le pic, la fluorescence Indo-1 est presque revenue à la ligne de base. Après l’ajout d’ionomycine, un signal robuste d’Indo-1 lié au calcium a été visualisé, indiquant une charge de colorant adéquate des cellules.L’analyse des populations rares a été effectuée en traçant l’Indo-1 lié au calcium par rapport à l’Indo-1 sans calcium après avoir été mis en évidence sur chaque population d’intérêt. Et analyser la réponse calcique sur l’ensemble du parcours temporel pour chaque sous-ensemble. Le flux de calcium à l’aide du profilage à spectre complet peut conduire à une analyse cytométrique en flux à paramètres élevés dans divers sous-ensembles immunitaires.L’analyse de haute dimension pour le regroupement non biaisé de sous-ensembles de lymphocytes T peut être utilisée en combinaison avec la cytométrie de flux à paramètres élevés pour une analyse avancée. Cette technique est développée pour l’analyse de plusieurs sous-ensembles immunitaires en conjonction les uns avec les autres dans un échantillon global.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Recherche

Immunologie et infection

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