Name: analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry at JoVE.com

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Vielen Dank an unsere Kollegen bei Cytek für die kontinuierlichen Diskussionen über die vollständige spektralzytometrische Analyse mit der Aurora- und SpectroFlo-Software. Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

Die Mäuse wurden auf dem medizinischen Campus der University of Colorado Anschutz in Übereinstimmung mit den IACUC-Protokollen gehalten. Alle Mäuse wurden nach AAALAC-Standards eingeschläfert.
1. Präparation von Immunzellen aus der Milz der Maus
HINWEIS: Naive Mäuse mit CO2 -Euthanasie einschläfern. C57BL/6-Mäuse, die von Jackson Laboratories gekauft und im eigenen Haus gezüchtet wurden, werden für Experimente im Alter von 6-12 Wo...

<ol>
	<li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation:+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium.">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li><li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+calcium+mobilization+study+(flow+cytometry).">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).</li><li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , (2004).</li><li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry.">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+An+overview.">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li><li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+flow+cytometry.">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2013).</li><li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research.">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).</li><li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+(ITK)+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+(RLK)+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694.">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li><li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK.">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).</li><li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. 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Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022)</li><li>SpctroFlo Software. Cytek Available from: <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022)</li><li>FlowJo Software. Becton-Dickinson Available from: <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022)</li><li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+points+in+early+T-cell+development.">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li><li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression,+but+triggers+cytokine-related+side+effects.">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Assay zur Messung von Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen, die mit titriertem Indo-1-ratiometrischem Indikatorfarbstoff unter Verwendung der Vollspektrum-Durchflusszytometrie beladen sind 7,8. Der Vorteil der Durchführung von Calciumfluss-Assays mit Vollspektrum-Durchflusszytometrie ist die Möglichkeit, die Färbung von Oberflächenzellmarkern in Kombination mit der Beurteilung der Indo-1-Fluoreszenz zu m...

Der durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) induzierte Kalziumeinstrom ist ein nützliches Maß für die T-Zell-Aktivierung und wird häufig verwendet, um festzustellen, ob eine Population von T-Zellen eine beeinträchtigte Reaktion in den proximalen Schritten des TCR-Signalwegsaufweist 1. Messungen des Kalziumeinstroms werden in der Regel durchgeführt, indem die T-Zellen mit einem oder zwei fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffen vormarkiert und dann die Fluoreszenzsignale mittels Durchflusszytometrie in Echtzeit nach TCR-Vernetzung untersuchtwerden 2,3,4. Indo-1, ein ratiometrischer Calciumfarbstoff, wird durch den UV-Laser mit Spitzenemissionen bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt, die von der Calciumbindung5 abhängen, und ist ein häufig verwendeter Indikatorfarbstoff für die durchflusszytometrische Analyse von Calciumantworten in lebenden Lymphozyten. Da das Emissionsprofil von Indo-1 recht breit gefächert ist, kann es schwierig sein, die Indo-1-Bewertung mit der gleichzeitigen Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu kombinieren. Diese Einschränkung schränkt die Verwendung der durchflusszytometrischen Analyse von Kalziumantworten auf vorgereinigte Populationen von T-Zellen oder auf Populationen ein, die durch einen begrenzten Satz von Zelloberflächenmolekülen identifiziert wurden.
Um die Einschränkungen der Messung von Kalziumantworten auf heterogene Populationen primärer Lymphozyten mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu beheben, wurde ein Protokoll zur Messung der Indo-1-Fluoreszenz mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht das Multiplexing von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, und nutzt so die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie. Der Vorteil der Vollspektrum-Durchflusszytometrie gegenüber der konventionellen Durchflusszytometrie besteht darin, dass sie die Fluoreszenzsignale von stark überlappenden Farbstoffen unterscheiden kann, wodurch die Anzahl der Oberflächenmarker erhöht wird, die gleichzeitig in jeder Probe bewertet werden können. Die konventionelle Durchflusszytometrie verwendet Bandpassfilter und ist auf ein Fluorochrom pro Detektorsystembeschränkt 6. Bei der Vollspektrum-Durchflusszytometrie werden Signale über das gesamte Spektrum des Fluorochroms mit 64 Detektoren auf einem spektralen Durchflusszytometriesystem mit fünf Lasernerfasst 7,8. Darüber hinaus nutzt die Vollspektrum-Durchflusszytometrie die Vorteile von APD-Detektoren (Avalanche Photo Diode), die eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Photomultiplier-Röhrendetektoren aufweisen, die auf herkömmlichen Durchflusszytometern vorhanden sind8. Folglich ist dieser Ansatz ideal für die heterogenen Zellpopulationen, wie z.B. mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder sekundäre lymphatische Organzellsuspensionen der Maus, da er die Isolierung spezifischer T-Zellpopulationen vor der Markierung des Kalziumfarbstoffs überflüssig macht. Stattdessen können Expressionsprofile von Zelloberflächenmarkern und durchflusszytometrisches Gating nach der Datenerfassung verwendet werden, um die Kalziumreaktionen in jeder interessierenden Population zu bewerten. Wie in diesem Bericht gezeigt wird, kann Indo-1 problemlos mit acht fluorochrom-konjugierten Antikörpern kombiniert werden, was zu insgesamt 10 einzigartigen spektralen Signaturen führt. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf Mischungen von Zellen aus kongen unterschiedlichen Mauslinien angewendet werden, was die gleichzeitige Analyse der Kalziumantworten in Wildtyp-T-Zellen im Vergleich zu denen einer genspezifischen Mauslinie ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 well TC treated plates</td>
			<td>Cell Treat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical</td>
			<td>Greiner Bio1</td>
			<td>41-12-17-03</td>
			<td>50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL polysterene flow tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL syringe</td>
			<td>BD syringe</td>
			<td>309646</td>
			<td>plunger only is used sheith is discarded</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM filter</td>
			<td>Greiner bio1</td>
			<td>542070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCD3 (17A2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKC lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aurora Spectral Flowcytometer</td>
			<td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Beads</td>
			<td>coleparmer</td>
			<td>Item # UX-06274-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 PE</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>50-0193-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1d Tetramer APC</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PECy7</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-0251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 APC Cy7</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>25-0042-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8a FITC</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>11-0081-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Incubator</td>
			<td>Formal Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools forceps</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#487593</td>
			<td>Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools Scissors</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>#970135</td>
			<td>Operating Scissors McKesson Argent&#8482; 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>DPBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC1280093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclond</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>lot AE29165301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>https://www.flowjo.com/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indo1-AM Ester Dye</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-085-39</td>
			<td>Calcium Loading Dye&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ionomycin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>407951-1mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Ghost 540</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>13-0879-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.7mL</td>
			<td>Light Labs</td>
			<td>A-7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRN694</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>Hy-12688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2)</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>70-0161-M001</td>
			<td>FC Block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1875093</td>
			<td>&#160;+ phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI phenol free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835030</td>
			<td>&#160;-phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#946; PerCP Cy5.5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>45-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR&#947;/&#948; Pe Cy5</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>15-5961-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu Reagent Pack</td>
			<td></td>
			<td>Product No: C06019</td>
			<td>Includes Tripan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vi-Cell Blu</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Fisher Brand Dry bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of t-cell receptor-induced calcium influx in primary murine t-cells by full spectrum flow cytometry

Der Kalziumeinstrom als Reaktion auf die Stimulation durch T-Zell-Rezeptoren ist ein gängiges Maß für die T-Zell-Signalübertragung. Es wurden mehrere Calcium-Indikatorfarbstoffe entwickelt, um die Calcium-Signalübertragung mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie zu messen. Die gesamten Splenozyten werden mit dem ratiometrischen Calciumindikatorfarbstoff Indo-1 markiert, zusammen mit einer Reihe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle. Die Nutzung der Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie bietet eine Plattform für die Verwendung einer breiten Palette von Zelloberflächenfärbungen in Kombination mit Indo-1. Die Zellen werden dann in Echtzeit bei 37 °C vor und nach der Zugabe eines Anti-CD3-Antikörpers zur Stimulation des T-Zell-Rezeptors analysiert. Nach der Entmischung der spektralen Signale wird das Verhältnis von calciumgebundenem zu calciumfreiem Indo-1 berechnet und kann über die Zeit für jede Gated Population von Splenozyten visualisiert werden. Diese Technik kann die gleichzeitige Analyse von Kalziumantworten in mehreren Zellpopulationen ermöglichen.

Der experimentelle Arbeitsablauf zur Beurteilung der Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen unter Verwendung eines ratiometrischen Indo-1-Farbstoffs mit Multiplex-Oberflächenfärbungen ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Ernte und Aufbereitung der Maus-Splenozyten zu einer Einzelzellsuspension werden die Zellen mit einem Indo-1 AM-Ester gefärbt und mit Fluorochrom-verknüpften Antikörpern oberflächengefärbt. Nach Abschluss der Farbstoffbeladung und der Antikörperfärbung w...

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Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.

Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Das Protokoll ermöglicht es den Forschern, gleichzeitig die Kalziumantwort in primären T-Zellen zu messen und gleichzeitig ihre Untergruppe und ihren Oberflächenphänotyp zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Notwendigkeit vermeidet, bestimmte Untergruppen von Zellen zu isolieren, bevor ihre Kalziumreaktionen untersucht werden. Bereiten Sie zunächst eine Stammlösung von Indo-1 AM von einem Mikrogramm pro Mikroliter vor, indem Sie 50 Mikroliter DMSO in eine Durchstechflasche mit 50 Mikrogramm Indo-1 AM geben. Verdünnen Sie die Stammlösung auf ein geeignetes Volumen cRPMI und eine Konzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter.Stellen Sie das Medium in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann dieses Medium, um eine zuvor hergestellte Zellsuspension im Verhältnis eins zu eins zu verdünnen, um fünf bis 6 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Als nächstes fügen Sie zu einer 12-Well-Gewebekulturplatte einen Milliliter Zellsuspension pro Well und Versuchsbedingung hinzu.Bereiten Sie eine einzelne gefärbte Kontrollprobe für kalziumfreies Indo-1 vor, indem Sie EGTA zu den mit Farbstoffen beladenen Indo-1-Zellen hinzufügen. Bereiten Sie eine Vertiefung für die biologische Negativkontrolle ohne Fluorophore oder Indo-1-Farbstoff vor. Bereiten Sie eine Indo-1-Positivkontrolle vor, indem Sie Ionomycin in einer Konzentration von 50 Mikromol zur farbstoffbeladenen Zellsuspension am Durchflusszytometer hinzufügen.Bereiten Sie auch eine Vertiefung für die Kontrolle einzelner Färbungen für zusätzliche Zellpopulationen mit Antikörper-konjugierten Fluorophoren vor. Fügen Sie dann zwei Mikrogramm FC-Rezeptor-blockierenden Antikörper pro Million Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang, wobei alle 15 Minuten abgeklopft wird, um die Zellen zu resuspendieren. Mischen Sie nach der Inkubation das gesamte Zellvolumen von der Platte und geben Sie es in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren und Dekantieren des Überstands. Sobald die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem cRPMI gewaschen sind, pelletieren Sie erneut und dekantieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter cRPMI und inkubieren Sie jedes Röhrchen, wobei die Oberseite des Röhrchens für den Gasaustausch leicht geöffnet bleibt, um eine vollständige Entesterung der intrazellulären AM-Ester zu ermöglichen.Als nächstes bereiten Sie eine Mastermischung aus allen benutzerdefinierten Fluorochrom-konjugierten Antikörpern vor und geben sie für einen Milliliter des Zellvolumens zu den ruhenden Zellen. Nach der Ruhezeit pelletieren Sie die Zellen und waschen Sie das Pellet, indem Sie es in einem Milliliter cRPMI, das auf vier Grad Celsius gekühlt ist, resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Röhrchen auf Eis.Resuspendieren Sie einzelne Proben in 500 Mikrolitern phenolrotfreiem cRPMI unter Verwendung eines Fünf-Milliliter-Polystyrol-Durchflussrohrs mit einer Kappe. Um die Temperatur mit Hilfe der Kalziumflussanalyse zu halten, bereiten Sie ein Perlenbad vor, indem Sie Badeperlen in ein kleines Wasserbad geben und auf 37 Grad Celsius erwärmen. Schneiden Sie vorsichtig ein 50-Milliliter-Chronikröhrchen in zwei Hälften und entsorgen Sie die Oberseite des Röhrchens.Füllen Sie das restliche Röhrchen zu drei Vierteln mit Badeperlen und lassen Sie es im Perlenbad 37 Grad Celsius erreichen. Stellen Sie das Perlenbad zusammen mit einem Styroporgestell in die Nähe eines Durchflusszytometers, um das Röhrchen zu positionieren. Vor der Analyse am Durchflusszytometer erwärmen Sie die Röhrchen einzeln sieben Minuten lang auf 37 Grad Celsius.Melden Sie sich bei der Durchflusszytometer-Software an und klicken Sie auf die Registerkarte Bibliothek. Wählen Sie dann fluoreszierende Tags aus, um kalziumgebundenes Indo-1 und kalziumfreies Indo-1 hinzuzufügen. Wählen Sie dann UV-Laser unter Fluoreszenz-Tag-Gruppen aus und klicken Sie auf Hinzufügen, um einen fluoreszierenden Tag-Namen hinzuzufügen.Wählen Sie die Laseranregung und die Emissionswellenlänge aus und klicken Sie dann auf Speichern. Fahren Sie mit dem Versuchsaufbau fort. Klicken Sie auf die Registerkarte Akquise, Öffnen/Erstellen eines neuen Experiments und fügen Sie dem Experiment die gewünschten fluoreszierenden Tags hinzu.Erstellen Sie eine Referenzgruppe und eine neue Stichprobengruppe für das Experiment, und beschriften Sie beide Gruppen. Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassungen" die Ereignisse auf das Maximum von 10 Millionen, das Stoppvolumen auf das maximale Volumen von 3000 Mikrolitern und die Stoppzeit auf das Maximum von 36.000 Sekunden ein. Erfassen Sie einfach gefärbte Kontrollen für benutzerdefinierte konjugierte Antikörper, die im Multicolor-Panel enthalten sind, und für den funktionellen Indo-1-Farbstoff.Fügen Sie 50 Mikromol Ionomycin zur kalziumgebundenen Indo-1-Positivkontrolle hinzu und wirbeln Sie vor. Fügen Sie das Durchflussrohr zur Probeninjektionsplatine hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen. Fügen Sie dann die kalziumfreie Indo-1-Negativkontrolle zum Durchflusszytometer hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen.Entmischt die einzelnen Stained-Regler, indem Sie auf die Schaltfläche Unmix klicken. Sobald die Entmischung abgeschlossen ist, erstellen Sie sequenzielle Diagramme mit dem ungemischten Arbeitsblatt, z. B. SSC-A im Vergleich zu FSC-A, um Schmutz aus der Probe zu entfernen, und SSC-A im Vergleich zu SSC-H, um Dubletten zu entfernen. Erstellen Sie dann Tore, indem Sie auf Plotten klicken.Fügen Sie dem Arbeitsblatt ein Diagramm hinzu, und doppelklicken Sie in das Tor, um eine nachgelagerte geschlossene Population zu erstellen. Fahren Sie fort, bis alle interessierenden Populationen berücksichtigt sind. Als nächstes erwärmen Sie die zuvor vorbereiteten einzelgefärbten Kontrollproben auf 37 Grad Celsius für die sequenzielle Analyse.Richten Sie die Durchflusszytometrie-Software ein und lassen Sie DI zwei bis drei Minuten lang in Eiswasser laufen, um die fluidische Stabilität des Durchflusszytometers zu gewährleisten. Richten Sie sequenzielle Diagramme auf dem ungemischten Arbeitsblatt ein, indem Sie mit den Schaltflächen Polygonrechteck oder Ellipsentor Tore erstellen, um die gewünschte Grundgesamtheit einzubeziehen. Doppelklicken Sie in das Tor und ändern Sie die Parameter für die y- und x-Achse in SSC-A statt SSC-H.Schließen Sie die Definition der Achsenparameter ab, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Achse klicken. Erstellen Sie ein Diagramm mit SSC-A im Vergleich zum Viabilitätsfarbstoffsignal. Gate die lebenden Zellen, die negativ für die Aminfarbstofffärbung sind.Lebende Zellen, die für die Lebendtotfärbung negativ sind, gruppieren sich sowohl auf der y- als auch auf der x-Achse an der Nullmarkierung. Doppelklicken Sie auf das innere Diagramm, um ein neues Diagramm zu erstellen, das nur einzellige lebende Lymphozyten enthält. Ändern Sie die Y-Achse in Indo-1 über der Zeit auf der x-Achse, um den Kalziumeinstrom zu visualisieren.Als nächstes legen Sie die erwärmte biologische Probe in den SIT der Maschine. Führen Sie die Proben mit 2.500 bis 3000 Ereignissen pro Sekunde bei einer mittleren Flussrate durch, um den Kalziumeinstrom in einer begrenzten Anzahl von Zellpopulationen zu visualisieren. Geben Sie das nächste Röhrchen in das Perlenbad zur Erfassungskontrolle.Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Ausgangsdaten 30 Sekunden lang aufzuzeichnen und einen basalen Calcium-Signalspiegel in der Probe zu erhalten. Klicken Sie dann auf Stopp und entfernen Sie das Röhrchen aus dem Probeninjektionsanschluss. Geben Sie 30 Mikrogramm unkonjugiertes Anti-CD3 direkt in das Probenröhrchen, um den Kalziumeinstrom einzuleiten.Setzen Sie das Röhrchen schnell wieder auf den Probeninjektionsanschluss und drücken Sie in der Software auf Aufnahme. Zeichnen Sie sieben Minuten lang Daten auf und beobachten Sie, wie viel Zeit unter den Erfassungssteuerungen in der Software verstrichen ist. Drücken Sie dann in der Software auf Stopp.Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin hinzu und zeichnen Sie es 30 Sekunden lang auf, um das maximale Kalziumsignal in den interessierenden Zellen zu erhalten. Fahren Sie mit der nächsten Probe fort und wiederholen Sie den Arbeitsablauf, bis alle Proben gesammelt wurden. Speichern Sie das Experiment und klicken Sie auf die Export-Zip-Datei.Ungemischte Dateien werden in eine externe Durchflusszytometrie-Analysesoftware hochgeladen. Ein stabiles, konsistentes Signal in einem Diagramm von Zeit und Seitenstreuung deutete auf fluidische Stabilität hin. Die Lymphozytenpopulation wurde durch eine anschließende Unterscheidung von Einzelstücken in einem Diagramm der Seitenstreuhöhe über der Fläche kontrolliert.Die Singuletts wurden auf ihre Lebensfähigkeit hin untersucht. Anschließend wurde das Gating auf die CD19-negative Population angewendet. Diese T-Zell-Subpopulationen wurden mit Antikörpern gegen CD4 und CD8 untersucht, indem die kalziumgebundene Indo-1-Fluoreszenz über die Zeit visualisiert wurde.In einzelnen Zellpopulationen zeigte das Diagramm des kalziumgebundenen Indo-1 über der Zeit einen Ausgangswert vor der Stimulation. Eine Spitzenreaktion, wenn der intrazelluläre Kalziumspiegel abnahm und die Kalziumantwort durch Zugabe von Ionomycin ausgelöst wurde. Vor der Zugabe von Anti-CD3-Antikörpern wurde ein schwaches Calcium-gebundenes Indo-1-Signal detektiert.Während der Peakantwort zeigten die Zellen ein starkes kalziumgebundenes Indo-1-Signal und reduzierten kalziumfreies Indo-1. Fünf Minuten nach dem Höhepunkt kehrte die Indo-1-Fluoreszenz fast zum Ausgangswert zurück. Nach Zugabe von Ionomycin konnte ein robustes Signal von Calcium-gebundenem Indo-1 sichtbar gemacht werden, das auf eine adäquate Farbbeladung der Zellen hinweist.Die Analyse der seltenen Populationen wurde durchgeführt, indem kalziumgebundenes Indo-1 im Vergleich zu kalziumfreiem Indo-1 nach Gating auf jede interessierende Population aufgetragen wurde. Und die Analyse der Kalziumantwort über den gesamten Zeitverlauf für jede Teilmenge. Der Kalziumfluss unter Verwendung von Vollspektrumprofilen kann zu einer durchflusszytometrischen Analyse mit hohen Parametern in einer Vielzahl von Immunsubpopulationen führen.Die hochdimensionale Analyse für ein unverzerrtes Clustering von T-Zell-Subpopulationen kann in Kombination mit Hochparameter-Durchflusszytometrie für erweiterte Analysen verwendet werden. Diese Technik wurde für die Analyse mehrerer Immunsubpopulationen in Verbindung miteinander in einer Massenprobe entwickelt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Charakterisierung der menschliche Monocyte Teilmengen von Vollblut Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Ermittlung der regulatorischen T Zelle Teilmengen in murinen Thymus, Pankreas, Entwässerung, Lymphknoten und Milz mit Durchflusszytometrie

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...